白背飞虱UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因片段及其dsRNA的应用的制作方法

本发明涉及昆虫基因工程技术领域，尤其是一种白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因片段及其dsrna在害虫防治中的应用。

背景技术

白背飞虱sogatallafurcifera(horváth)隶属于半翅目hemiptera飞虱科delphacidae，是亚太地区水稻生产上的一种重要害虫。其主要通过成虫、若虫直接刺吸稻株汁液，造成水稻生长缓慢，分蘖延迟，瘪粒增加，受害严重时可引起稻株枯死；此外，白背飞虱还是南方水稻黑条矮缩病病毒(southernriceblack-streakeddwarfvirus,srbsdv)的主要传播媒介，造成的危害更是毁灭性的。当下白背飞虱的防控仍然主要依赖于化学杀虫剂，而化学杀虫剂的大量不合理使用，对生态环境和人类的健康构成了严重的威胁，同时也使得白背飞虱对多种杀虫剂产生了不同程度的抗性，因此，亟待发展一种新型的环境友好型的防治白背飞虱的策略。

rna干扰(rnainterference,rnai)是近年来发现的一种重要基因沉默手段，是通过体外合成一段与靶基因同源的双链rna(double-strandrna,dsrna)，导入昆虫体内，使内源性靶基因中同源mrna降解，从而达到阻断基因翻译的目的。rnai是昆虫基因功能研究的有效手段，它的成功应用为发展环境友好型、经济效果好的新型害虫防治策略提供了新思路和新方法。

几丁质是昆虫表皮和中肠围食膜的主要组成部分。昆虫的表皮也由于几丁质和鞣化蛋白的存在而呈刚性结构，这无疑限制了昆虫的生长。在生长发育过程中，昆虫必须经历周期性地蜕去旧表皮和形成新表皮，这一过程依赖于昆虫体内几丁质生物合成和降解的精确控制。udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(udp-n-acetylglucosaminepyrophosphorylase,uap)是参与几丁质合成的关键酶，调节昆虫的行为、变态发育及繁殖等。通过扰乱或阻断昆虫udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶的形成，使得昆虫体内出现了蜕皮障碍、存活率降低、繁殖力下降等现象。由于人类与其它高等动物体内不存在几丁质，故几丁质合成途径作为害虫防治的靶标相对安全，但是目前针对白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶的研究未见相关报道，也未见针对白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因的dsrna的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因片段及其dsrna的应用，以实现环境友好型的防治白背飞虱。

为实现上述目的，本发明采用如下方案：

一种白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因片段，该基因片段核苷酸序列如seqidno：7所示；

白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因的核苷酸序列如序列表中seqidno：3所示。

白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因编码的氨基酸酸序列如seqidno：4所示，udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因编码489个氨基酸，相对分子量为55.07kda，理论等电点为6.37。

上述基因片段的获取方法如下：基于udp-n-葡糖胺焦磷酸化酶基因，设计带有t7启动子的上游引物2seqidno：5和下游引物2seqidno：6，通过pcr扩增获得。

利用白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因片段合成dsrna。

优选地，所合成的dsrna应用于白背飞虱防治。

白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因片段合成dsrna的方法如下：将核苷酸序列seqidno：7的基因片段的pcr产物胶回收与纯化后，按照rnaikit(thermo)试剂盒说明书体外转录合成dsrna。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

利用本发明所述基因片段合成的dsrna能够有效预防白背飞虱，通过体外合成一段与靶基因同源的双链rna(double-strandrna,dsrna)，导入昆虫体内，使内源性靶基因中同源mrna降解，从而达到阻断基因翻译的目的，为发展环境友好型、经济效果好的新型害虫防治策略提供了新思路和新方法；通过显微注射法将dsrna传递到白背飞虱体内，检测dsrna对udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因的mrna表达，并观察dsrna对白背飞虱生长发育的影响。结果表明：注射dsrna可以特异性地沉默白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因的mrna表达，同时虫体有明显的蜕皮困难的畸形表型，并最终导致死亡，干扰5天后死亡率达到86.7％。本发明为未来白背飞虱rna干扰介导的害虫防治策略提供了候选基因，同时本发明为研发新型杀虫剂提供了理论依据。

附图说明

图1为5龄白背飞虱若虫注射uap基因的dsrna后的uap基因相对表达量。18srna为内参基因，dsgfp为对照组，dsuap为实验组。

图2为5龄白背飞虱若虫注射uap基因的dsrna后的累积存活率。其中dsgfp为对照组，dsuap为实验组。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，具体如下：

实施例1：

白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因的核苷酸序列如seqidno：3；该核苷酸序列是基于白背飞虱转录组数据库获得的片段，设计特异性引物通过pcr扩增获得。该核苷酸序列长度为1470bp。白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因编码的氨基酸序列如seqidno：4；该氨基酸序列获得是采用expasy软件将所述核苷酸序列seqidno：3翻译为氨基酸并对其蛋白特性进行分析。结果表明udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因编码489个氨基酸，相对分子量为55.07kda，理论等电点为6.37。

白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因片段以及该基因片段的获取方法：基于所述核苷酸序列seqidno：3，利用primerpremier6.0软件设计带有t7启动子的上游引物2seqidno：5和下游引物2seqidno：6，通过pcr扩增获得一段长度为442bp的dna片段，该片段的核苷酸序列如seqidno：7。

白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因片段合成的dsrna以及合成该dsrna的方法：将核苷酸序列seqidno：7的基因片段的pcr产物胶回收与纯化后，以该胶回收的产物为模板按照rnaikit(thermo)试剂盒说明书体外转录合成dsrna。

实施例2：白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因序列及其编码的氨基酸

1.白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因全长序列的获得

1)采用生物信息学技术对白背飞虱转录组数据库进行初步分析，通过ncbi数据库blast等程序确定获得白背飞虱sfuap基因的2个片段。利用primerpremier6.0软件设计了如下特异性引物：上游引物sfuap-f5'-gaacgagaggaactgtgt-3'，下游引物sfuap-r5'-gttggtgacgacttctgt-3'，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2)选取白背飞虱5龄若虫15头，置于1.5ml无rna酶的离心管中，经液氮冷冻后快速研磨成细粉，用trizol法进行总rna的提取，具体操作步骤参照trizol试剂盒说明书进行。然后按照sangon公司amvfirststrandcdnasynthesiskit试剂盒的说明书合成第一链cdna。

3)以上述合成的cdna为模板，利用引物sfuap-f和sfuap-r进行pcr扩增。pcr反应体系总体积为25μl，包括：上下游引物(10μm)各1μl，10×lapcrbuffer(mg²⁺plus)2.5μl，dntpmixture(2.5mm)4μl，cdna2μl，taq酶0.25μl和重蒸水14.25μl。pcr反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

4)pcr产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，于凝胶成像仪检测目的条带长度并初步判断是否为预期的目的条带。随后对目的条带切胶，通过quickgelextractionkit试剂盒进行pcr产物回收与纯化，具体操作步骤参见试剂盒说明书。将胶回收产物连接至pmd18-t载体上(体系为回收产物2μl、solationⅰ2.5μl和pmd18-t载体0.5μl，16℃孵育过夜)，随后连接体系转化至dh5α感受态细胞，经蓝白斑筛选和pcr检验后，将检验正确的克隆用lb液体培养基(含氨苄青霉素)培养过夜后，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

5)将测序结果通过seqman软件进行校对及序列拼接，并利用ncbi网站中blast程序进行序列同源性比对，获得白背飞虱sfuap基因全长序列。

2.白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因全长序列的验证

基于上述获得的白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因全长序列，利用primerpremier6.0软件设计特异性引物，其中上游引物1seqidno：1和下游引物1seqidno：2，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通过pcr扩增、测序及序列分析，确定获得白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因全长序列，其序列结果如seqidno：3所示。

3.白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因编码的氨基酸

采用expasy软件将获得的基因序列seqidno：3翻译为氨基酸并对其蛋白特性进行分析。结果表明udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因编码489个氨基酸，相对分子量为55.07kda，理论等电点为6.37。将sfuap编码的氨基酸序列进行blast分析，sfuap与同为半翅目的褐飞虱n.lugens(genbank登录号ael88647)uap基因具有最高的相似性，为97％。

实施例3：白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因的dsrna的合成

1)基于所获得的sfuap基因全长序列seqidno：3，利用primerpremier6.0软件设计带有t7启动子的上游引物2seqidno：5和下游引物2seqidno：6，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2)以实施例2中合成的cdna作为模板，利用上述合成的dsrna引物进行pcr扩增。pcr反应体系总体积为25μl，包括：上下游引物(10μm)各1μl，10×lapcrbuffer(mg²⁺plus)2.5μl，dntpmixture(2.5mm)4μl，cdna2μl，taq酶0.25μl和重蒸水14.25μl。pcr反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

3)取1μlpcr产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，于凝胶成像仪检测所得条带长度并初步判断是否为预期的目的条带，随后对pcr产物进行胶回收与纯化、克隆、菌液pcr验证并测序，方法参照实施例1。

4)经测序验证无误后，取200μl测序菌液加入到20mllb液体培养基(含有氨苄青霉素)中，置于摇床37℃、220rpm震荡培养过夜。利用plasmidminiprepkit试剂盒(北京全式金)进行质粒抽提，具体步骤参照说明书完成。

5)以抽提的质粒为模板，采用rnaikit(thermo)试剂盒按照说明书体外转录合成并纯化得到白背飞虱sfuap基因的dsrna。

6)取上述纯化的dsrna产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测其单一性，并用nanodrop2000spectrophotometer(thermofisher)检测其浓度。保存至-80℃冰箱备用。

实施例4：白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因的dsrna致死白背飞虱实验

1.白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因的dsrna注射

选取5龄第一天大小均一、健康状况一致的若虫用于注射上述合成的dsrna。首先准备1％的琼脂糖平板，将白背飞虱在co2的处理下腹部向上固定在琼脂糖平板上，利用显微注射仪nanoliter2010injector(worldprecisioninstruments)进行注射，注射时要轻微操作，前胸和中胸相接的位置作为注射点。注射dsrna的量为100ng/头，并以注射dsgfp作为对照组，每组注射50头，设置3个生物学重复。注射完毕后，将试虫放入装有新鲜稻苗的试管中，置于温度(25±1)℃、相对湿度70％±5％、光周期16l:8d的人工气候箱中。

2.白背飞虱udp-n-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因的沉默效率检测

基于上述注射试验，在注射dsrna或dsgfp72h后，每组收集存活的试虫10头，设置3个生物重复。提取总rna，并反转录为cdna，采用qpcr技术检测rnai后的目的基因表达情况。结果表明，在72h后，与注射dsgfp的对照组相比，白背飞虱注射sfuap的dsrna的实验组的相对表达量显著降低，而且降低高达％。结果如图1所示。

3.注射dsrna后白背飞虱死亡情况的观察

5龄第一天若虫注射dsrna或dsgfp后，观察实验组与对照组的白背飞虱死亡情况。结果表明，注射5天后，注射dsrna的实验组白背飞虱死亡率高达86.7％，这与注射dsgfp的对照组(死亡率为8％)相比，致死效果明显。结果如图2所示。

4.注射dsrna后白背飞虱表型的观察

注射dsrna的实验组若虫共150头，84％个体在羽化前死亡，16％可以成功羽化，但其中的2.7％羽化后也相继死亡。

序列表

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