一种具有提高抗氧化活性的西番莲果皮多糖羧甲基化修饰产物及其制备方法与流程

本发明涉及一种西番莲果皮多糖，具体涉及一种具有提高抗氧化活性的西番莲果皮多糖羧甲基化修饰产物及其制备方法。

背景技术：

西番莲(passifloraedulissims)，又名百香果、鸡蛋果，属于西番莲科西番莲属植物果实，是一种典型的药食同源的高品质水果，具有很高的药用价值和食用价值。中医药研究表明，西番莲具有消炎、镇静、抗焦虑、抗成瘾、治疗失眠等多种功效。

多糖为天然产物，来源广泛，具有毒副作用小、无残留、不产生耐药性等优点，因而备受研究者的重视。现代研究发现，多糖的生物活性与多糖的空间结构密切，通过物理、化学等手段对其分子结构进行修饰，从而赋予多糖更多生物活性。用适当方法向多糖支链进行羧甲基修饰，羧甲基化多糖溶解性和电负性增强，并对其抗氧化、抗肿瘤活性有很大的提高，且能增强甚至产生新的生物活性。本发明对西番莲果皮多糖进行羧甲基化修饰，确定其结构特征，比较研究了不同取代度羧甲基化多糖的抗氧化活性。有关西番莲果皮多糖羧甲基化衍生物制备及抗氧化活性研究至今未见国内外文献报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供羧甲基化西番莲果皮多糖的合成方法，并获得不同羧甲基化取代度西番莲果皮多糖抗氧化作用结果。

本发明通过以下技术方案达到上述目的：

一种羧甲基化西番莲果皮多糖，由以下方法合成：将西番莲果皮多糖溶于不同浓度氢氧化钠溶液中，并加入异丙醇同时搅拌，冰浴，搅拌一段时间后制成均匀悬浊液，并逐渐滴加异丙醇—氯乙酸混合液，逐渐升温，搅拌一段时间，停止反应，冷却至室温。调ph值至中性，将反应液置于截留分子量为3000的透析袋中透析48h。旋转蒸发溶液，冷冻干燥，得到羧甲基化西番莲果皮多糖。

本发明还要求保护所述的不同取代度的羧甲基化多糖在制药中的应用。进一步地，不同取代度羧甲基化西番莲果皮多糖在制备药物中的应用包括以下4个方面。

(1)羧甲基化西番莲果皮多糖在制备清除dpph自由基药物中的应用，羧甲基化西番莲果皮多糖有效浓度为10mg/ml，羧甲基化取代度为0.236～1.192。

(2)羧甲基化西番莲果皮多糖在制备清除羟基自由基药物中的应用，羧甲基化西番莲果皮多糖有效浓度为10mg/ml，羧甲基化取代度为0.236～1.192。

(3)羧甲基化西番莲果皮多糖在制备清除超氧阴离子自由基药物中的应用，羧甲基化西番莲果皮多糖有效浓度为10mg/ml，羧甲基化取代度为0.236～1.192。

(4)羧甲基化西番莲果皮多糖在制备清在清除还原能力药物中的应用，羧甲基化西番莲果皮多糖有效浓度为10mg/ml，羧甲基化取代度为0.236～1.192。

本发明的有益效果在于：将人工合成的羧甲基化西番莲果皮多糖用于体外抗氧化活性实验，获得不同取代度的羧甲基化西番莲果皮多糖抗氧化的实验结果，为羧甲基化西番莲果皮多糖在医药领域的应用提供参考依据。

附图说明

图1为实施所述不同naoh浓度对肠西番莲果皮多糖羧甲基化取代度的影响

图2为实施所述不同反应温度肠西番莲果皮多糖羧甲基化取代度的影响

图3为实施所述不同反应时间肠西番莲果皮多糖羧甲基化取代度的影响

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

1、西番莲果皮多糖的制备

西番莲果皮洗净，于50℃下烘干，粉碎，80％的乙醇85℃冷凝回流提取3次，每次2h，分离残渣并干燥。称取上述残渣5g，按照一定料液比加入蒸馏水，微波提取，抽滤，滤液离心得上清液浓缩，加入4倍体积无水乙醇沉淀，4℃静置48h，4000r/min，离心15min，取上清液冷冻干燥，得到西番莲果皮粗多糖(wpep)。

2、西番莲果皮多糖羧甲基化修饰

称量西番莲果皮多糖，加入naoh和异丙醇溶液，冰浴，搅拌后制成均匀悬浊液。将混合液缓慢滴入反应体系中，逐渐升温，搅拌，停止反应，冷却至室温。调至ph为中性。用流水和蒸馏水分别透析48h。旋转蒸发溶液，冷冻干燥，得到羧甲基化西番莲果皮多糖(wpepc)。

3、红外光谱分析

分别称取2mg的西番莲果皮多糖和羧甲基化西番莲果皮多糖加入100mg干燥kbr于玛瑙研钵中，研磨均匀，压片。进行红外光谱扫描，扫描范围为4000～400cm^-1。

4、羧甲基化西番莲果皮多糖取代度的测定

试管中分别加入0.25ml0.5mg/ml的eipc溶液和0.25ml浓硫酸，混匀，125℃加热3h后取出，再加入2ml2,7-二羟基萘溶液，混匀后于沸水浴中加热20min，冷却至室温，最后加入2ml的蒸馏水，测定其520nm吸收值。同时，用羟基乙酸替代多糖样品计算每克多糖样品中羟基乙酸的克数，计算羧甲基化西番莲果皮多糖取代度的值：

5、不同naoh浓度对西番莲果皮多糖羧甲基化取代度的影响

设置naoh浓度10％、15％～30％，研究不同浓度的碱液对西番莲果皮多糖羧甲基化取代度的影响，结果见图1.羧甲基化西番莲果皮多糖取代度随naoh质量分数的增大呈现先增大后减小的趋势，naoh质量分数为25％时，达到最大。

6、不同反应温度对西番莲果皮多糖羧甲基化取代度的影响

设置反应温度40℃、50℃～80℃，研究不同反应温度对西番莲果皮多糖羧甲基化取代度的影响，结果见图3。当反应温度到60℃时，羧甲基化西番莲果皮多糖的取代度最大。当温度继续升高，造成氯乙酸水解副产物增多和多糖在碱性介质中发生降解而使羧甲基化西番莲果皮多糖取代度降低。因此，选择氢氧化钠-氯乙酸化学法修饰西番莲果皮多糖的反应温度为60℃。

7、不同反应时间对西番莲果皮多糖羧甲基化取代度的影响

设置反应时间1h、2h～5h，研究不同反应时间对西番莲果皮多糖羧甲基化取代度的影响，结果见图3。随着加热反应时间的增加，羧甲基化西番莲果皮多糖的取代度不断增加。加热时间1～3h，随着加热时间增加，羧甲基化西番莲果皮多糖的取代度显著增加。当加热时间超过3h后，其取代度几乎不再增加。因此，综合考虑选择氢氧化钠-氯乙酸化学法修饰西番莲果皮多糖的反应时间为3h。

8、不同取代度羧甲基化西番莲果皮多糖对dpph自由基清除作用

量取配制的待测样品液2.0ml，加入2.0ml0.04mg/mldpph溶液(无水乙醇作为溶剂)，充分混匀后室温下避光反应30min，在波长517nm处测定其吸光度ai，同时测定无水乙醇(2.0ml)与dpph(2.0ml)混合液的吸光度ac，无水乙醇(2.0ml)和样品液(2.0ml)混合液的吸光度aj。

随着取代度的不断增大，羧甲基化西番莲果皮多糖对dpph自由基的清除作用整体是呈下降趋势。当取代度为0.435时，dpph自由基清除率最大，为92.74％。当取代度为0.473时，dpph自由基清除率最小，为81.21％。说明羧甲基化修饰的取代度越大，西番莲果皮多糖对dpph自由基的清除能力越弱，表明羧甲基化修饰不利于西番莲果皮多糖清除dpph自由基。

9、不同取代度羧甲基化西番莲果皮多糖对羟基自由基清除作用

取0.2ml的feso4-edta混合液(10mmol/l)于带塞试管中，加入0.2ml的α-脱氧核糖溶液(20mmol/l)，然后再加入0.2ml样品，并用磷酸缓冲液(0.2mol/l，ph＝7.4)定容至1.8ml，然后加入0.2ml的h2o2(10mmol/l)，40℃恒温水浴1h，加入1ml2.8％的三氯乙酸终止反应，再加入1ml1％硫代巴比妥酸，混匀之后于沸水浴中加热10min，冷却后于532nm处测光吸收值as。以去离子水为阴性对照，测定吸光值a0，抗坏血酸为阳性对照，测定吸光值ac。

随着取代度的不断增大，羧甲基化西番莲果皮多糖对羟自由基的清除作用显示不规律性，说明影响其抑制羟自由基的因素比较复杂。总体上，羧甲基化修饰的取代度越大，西番莲果皮多糖的清除羟自由基的能力越强，当取代度为1.192时，羟基自由基清除率最大为98.79％，表明羧甲基化修饰有利于西番莲果皮多糖清除羟自由基。

10、不同取代度羧甲基化西番莲果皮多糖对超氧阴离子自由基清除作用

精确量取4.5mltris-hcl溶液(50mmol/l，ph＝8.2)于试管，在25℃温水中预热20min，之后依次加入同样预热条件下预热的邻苯三酚溶液(25mmo1/l)0.3ml和样品0.2ml，并迅速混匀倒入比色皿，波长319nm处测定吸光度at，每30s测一次，测定8次。以去离子水作为空白对照，同样操作条件下测定并计算邻苯三酚自氧化速率v0。

羧甲基化西番莲果皮多糖对超氧阴离子自由基的清除能力，随着取代度的变大而下降。但是并不呈现清晰的线性规律。当取代度为1.192时，超氧阴离子清除率最为60.11％。

11、不同取代度羧甲基化西番莲果皮多糖对fe³⁺还原能力作用

移取0.5ml羧甲基化多糖溶液与试管中，并加入0.5ml0.2mol/lpbs缓冲液(ph＝6.7)和0.5ml1％铁氰化钾溶液，50℃水浴锅恒温20min后冷却，加入0.5ml10％三氯乙酸溶液，依次加入2ml蒸馏水，0.5ml0.1％的fecl3溶液充分混匀，静置10min后，在紫外-可见分光光度计700nm波长处测定溶液吸光值。

随着取代度的不断增大，羧甲基化西番莲果皮多糖的还原性作用呈下降的趋势。但是取代度和清除率之间并没有呈非常显著的负相关关系。当取代度为0.268时，吸光度最大为0.579。