本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及生长抑素的制备方法及含有生长抑素的药物组合物。
背景技术：
生长抑素(生长素释放抑制素，ghrih，growthhormonerelease-inlease-inhibitinghormone，或somatostatin)是由116个氨基酸的大分子肽裂解而来的十四肽，其分了结构呈环状，在第3位和第14位半胱氨酸之间有一个二硫键，其化学结构如下，分子式为c76h104n18o19s2，相对分子质量为1637.89，为白色粉末。生长抑素是一种生长抑制激素，最初由brazen等1973年从动物下丘脑中发现，主要有14和28个氨基酸两种活性形式。它广泛分布于中枢和外周神经系统以及胃肠道内，亦存在于大鼠和人的心脏中，在胃肠道粘膜内，生长抑素由d细胞所释放，其含量以胃窦和胃体部最高。生长抑素可抑制蛙皮素、α-脱氧葡萄糖等的分泌，降低肾素活性，产生降压效应；生长抑素对离体豚鼠心脏有负性肌力作用，在利尿磺胺存在时它可以进一步降低其心脏指数和动脉血压；它可以通过调节消化道激素分泌，稳定细胞膜，对其起到保护作用。此外，生长抑素对全部胃肠道的分泌均有抑制作用。目前制备获得的生长抑素的纯度和收率都较低，不能满足工业化生产的需求，特别是无法大规模纯化生长抑素，制约了生长抑素的应用。因此，提供一种纯化生长抑素的方法具有重要意义。技术实现要素：为解决上述现有技术中所存在的问题，我们进行了大量的试验探索，发现一种新的生长抑素的纯化方法，本发明得到的生长抑素纯度更高。本发明的另一个目的在于提供一种生长抑素药物组合物及其制备方法。具体而言，本发明提供了：一种生长抑素的纯化方法，包括以下步骤：步骤1、用第一缓冲液洗涤阳离子交换树脂柱后，用第一缓冲液溶解生长抑素粗品，并按≤50g生长抑素粗品/l树脂/循环上样；用第二缓冲液洗脱，获得第一洗脱物；所述第一、二缓冲液为磷酸钠缓冲液；步骤2：用磷酸盐缓冲液将洗脱液的ph值到4.5～6.5，得到溶液；步骤3：用第三缓冲液洗涤阴离子交换树脂柱进行预平衡后，用第三缓冲液溶解步骤2所得产物，并按30g生长抑素粗品/l树脂/循环进行上样；用第四缓冲液进行洗脱，获得第二洗脱物，浓缩干燥即得生长抑素；所述第三、四缓冲液为醋酸钠缓冲液。所述阳离子交换树脂为羧甲基琼脂糖柱；所述阴离子交换树脂为琼脂糖凝胶柱。所述步骤2中的磷酸盐缓冲液的ph值为5.0～7.0。所述第一、第二、三、四缓冲液的ph值为4.0～6.0。所述第二、四缓冲液中含有氯化钠。一种含有生长抑素的药物组合物包含生长抑素、赋形剂，所述的赋形剂为海藻糖、半乳糖组成的混合物。所述组合物包含以下重量份的成分：0.8～1重量份生长抑素、30～50重量份赋形剂。所述赋形剂中海藻糖为α,α-双羧海藻糖、β,β-双羧异海藻糖或α，β-双羧海藻糖中的一种或几种。所述赋形剂中海藻糖：半乳糖的重量比为(0.5～0.9)：1。所述的组合物的ph值为4.5～6.5。一种含有生长抑素的药物组合物制备冻干粉针的方法，包括以下步骤：1)按处方量称取赋形剂溶解于2/3处方量的注射用水中，搅匀；2)待上述配制液降至室温后，加入处方量生长抑素，测ph值，调节ph至4.5～6.0，加入注射用水至全量，用微孔滤膜精滤，冻干，得冻干粉针。本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：1、本发明提供的纯化生长抑素方法操作简单易行，获得的生长抑素纯度可达99.7％、收率可达60％以上。2、由该组合物制得的冻干粉针剂稳定性良好，复溶性好；由该组合物制得的冻干粉针剂使用方便，利于贮运，其制备方法简单，易于工业化生产，且生产成本低。具体实施方式以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。生长抑素粗品购自杭州肽佳生物科技有限公司，经检测其hplc纯度为93.02％。实施例1步骤1：用ph6.0的25mm磷酸钠缓冲液(第一缓冲液)洗涤羧甲基琼脂糖柱进行预平衡后，用第一缓冲液溶解生长抑素粗品，按40g生长抑素粗品/l树脂/循环进行上样；用10-60％梯度第二缓冲液(20mm磷酸钠、110mm氯化钠，ph6.5)经20倍柱体积；流速为7ml/分钟，并且洗脱液通过在215nm处检测来监控，收集特征峰洗脱液；步骤2：用ph值为7.0磷酸盐缓冲液将洗脱液的ph调节到5.0，得到溶液；步骤3：用ph4.0的20mm醋酸钠缓冲液(第三缓冲液)洗涤苯基琼脂糖凝胶hp柱进行预平衡后，用第三缓冲液溶解步骤2所得溶液，按照30g生长抑素粗品/l树脂/循环进行上样；用0-20％第四缓冲液(20mm醋酸钠、1m氯化钠，ph7.5)的梯度经25倍柱体积洗脱；流速为5ml/分钟并且洗脱液通过在215nm处uv检测来监控；收集特征峰洗脱液，浓缩干燥，得纯度为99.93％的生长抑素25.73g，纯化总收率为64.32％。实施例2步骤1：用ph6.0的25mm磷酸钠缓冲液(第一缓冲液)洗涤羧甲基琼脂糖柱进行预平衡后，用第一缓冲液溶解生长抑素粗品，按100g生长抑素粗品粗品/l树脂/循环进行上样；0-40％梯度第二缓冲液经20倍柱体积，然后40-80％第二缓冲液经3倍柱体积的梯度进行洗脱；流速为7ml/分钟，并且洗脱液通过在215nm处检测来监控；收集特征峰洗脱液；步骤2：用ph值为7.0磷酸盐缓冲液将洗脱液的ph值到6.0，得到溶液；步骤3：用ph4.0的20mm醋酸钠缓冲液(第三缓冲液)洗涤苯基琼脂糖凝胶hp柱进行预平衡后，用第三缓冲液溶解步骤2所得产物，按20g生长抑素粗品/l树脂/循环进行上样；用0-20％第四缓冲液(20mm醋酸钠、1m氯化钠，ph4.5)的梯度经25倍柱体积洗脱；流速为5ml/分钟并且洗脱液通过在215nm处uv检测来监控；收集特征峰纯洗脱液，浓缩干燥，得纯度为99.81％的生长抑素63.21g，纯化总收率为63.21％。实施例3步骤1：用ph6.0的25mm磷酸钠缓冲液(第一缓冲液)洗涤羧甲基琼脂糖柱进行预平衡后，用第一缓冲液溶解生长抑素，按50g生长抑素/l树脂/循环进行上样；用10-60％第二缓冲液(20mm磷酸钠、110mm氯化钠，ph6.5)的梯度经20倍柱体积；流速为7ml/分钟，并且洗脱液通过在215nm处检测来监控；收集特征峰洗脱液；步骤2：用ph值为6.0磷酸盐缓冲液将洗脱液的ph值到4.5，得到溶液；步骤3：用ph4.0的20mm醋酸钠缓冲液(第三缓冲液)洗涤苯基琼脂糖凝胶hp柱进行预平衡后，用第三缓冲液溶解步骤2所得产物，按30g生长抑素/l树脂/循环进行上样；用0-20％的第四缓冲液(20mm醋酸钠、1m氯化钠，ph4.5)的梯度经25倍柱体积洗脱；流速为5ml/分钟并且洗脱液通过在215nm处uv检测来监控；收集特征峰纯洗脱液，浓缩干燥，得纯度为99.81％的生长抑素31.89g，纯化总收率为63.78％。测试例1：有关物质取本品，加水溶解并制成每1ml中含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取2ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液，照高效液相色谱法(2015版药典)测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸溶液(取磷酸11ml，加水800ml，用三乙胺调节ph值至2.3，加水稀释至1000ml)为流动相a，乙腈为流动相b；流速为每分钟1.5ml；检测波长为215nm。按表1进行梯度洗脱；取生长抑素对照品约10mg，置20ml量瓶中，加30％过氧化氢溶液1ml，室温放置1小时，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液50ml，注入液相色谱仪，理论板数按生长抑素峰计算不低于2000，生长抑素主峰与其相对保留时间约为1.1的氧化降解物峰的分离度应不小于2.0。取对照溶液50ml注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为满量程的20％。精密量取供试品溶液和对照溶液各50ml，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。表1梯度洗脱时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)07921186040206040217921267921含量测定照高效液相色谱法(2015版药典)测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸溶液(取磷酸11ml，加水800ml，用三乙胺调节ph值至2.3，用水稀释至1000ml)-乙腈(75∶25)为流动相；流速为每分钟1.5ml；检测波长为215nm。理论板数按生长抑素峰计算不低于1500。测定法取本品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中含0.1mg的溶液，精密量取20ml注入液相色谱仪，记录色谱图；另取生长抑素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。结果表2。表2不同样品样品总有关物质(％)单个最大杂质(％)杂质个数实施例10.110.023实施例20.100.033实施例30.090.034原料4.671.3224结论：上述结果表明本发明制备的生长抑素的总有关物质均小于0.1％，单个最大杂质小于0.05％，均优于原料。实施例4在洁净的条件下，将18.5gα,α-双羧海藻糖和26.5g半乳糖投入配液器具中，加入注射用水700ml中搅拌溶解，冷却至室温，待上述配制液降至室温后，加入1g生长抑素(按实施例1所述方法制得)，测ph值，用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1m，ph＝4.5)调节ph至5.2，加入注射用水至全量，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到生长抑素滤液。分装3ml于安培瓶中，冷冻干燥72小时制成无菌冻干粉针剂。实施例5在洁净的条件下，将18gα，β-双羧海藻糖和22g半乳糖投入配液器具中，加入注射用水700ml中搅拌溶解，待上述配制液降至室温后，加入1.0g生长抑素(按实施例3所述方法制得)，测ph值，用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1m，ph＝4.5)调节ph至5.1，加入注射用水至全量，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到生长抑素滤液。分装3ml于安培瓶中，冷冻干燥72小时制成无菌冻干粉针剂。实施例6在洁净的条件下，将23.7gβ,β-双羧异海藻糖和26.3g半乳糖投入配液器具中，加入注射用水700ml中搅拌溶解，待上述配制液降至室温后，加入1.0g生长抑素(按实施例2所述方法制得)，测ph值，用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1m，ph＝4.5)至5.0，加入注射用水至全量，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到生长抑素滤液。分装3ml于安培瓶中，冷冻干燥72小时制成无菌冻干粉针剂。实施例7在洁净的条件下，将5gα,α-双羧海藻糖、5gβ,β-双羧异海藻糖和20g半乳糖投入配液器具中，加入注射用水700ml中搅拌溶解，待上述配制液降至室温后，加入1.0g生长抑素(按实施例1所述方法制得)，测ph值，用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1m，ph＝4.5)调节ph至4.9，加入注射用水至全量，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到生长抑素滤液。分装3ml于安培瓶中，冷冻干燥72小时制成无菌冻干粉针剂。实施例8在洁净的条件下，将3gα,α-双羧海藻糖、7gβ,β-双羧异海藻糖、8gα，β-双羧海藻糖和20g半乳糖投入配液器具中，加入注射用水700ml中搅拌溶解，待上述配制液降至室温后，加入1.0g生长抑素，测ph值，用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1m，ph＝4.5)调节ph至4.9，加入注射用水至全量，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到生长抑素滤液。分装3ml于安培瓶中，冷冻干燥72小时制成无菌冻干粉针剂。处方筛选试验1、制剂溶液中赋型剂的筛选(一)含有生长抑素1mg/ml。且分别含有4％(w/v)的甘露醇、海藻糖与半乳糖(重量比3:1)的组合物、海藻糖、半乳糖作为赋型剂。放置于37℃孵箱孵浴，检测各时间点溶液中生长抑素的稳定性。并进行冻干(冻干程序为：－40℃预冻4小时；抽真空至300mt；设置升温程序1℃/分钟，升至－20℃；冻干12小时；设置升温程序1℃/分钟，升至30℃；干燥4小时；压塞并轧盖。)，观察其冻干形式制剂的外观，试验结果如表3。从稳定性和冻干外观角度判断，制剂溶液优选甘露醇或海藻糖与半乳糖的组合物作为赋型剂。表3生长抑素在含有赋型剂制剂溶液中的纯度(％)和冻干外观2、制剂溶液中赋型剂的筛选(二)含有生长抑素0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.2或6.0mg/ml。且分别含有4％(w/v)的甘露醇、海藻糖与半乳糖的组合物、海藻糖、半乳糖作为赋型剂。同时配制不含有赋型剂的制剂溶液。取玻璃瓶，按1ml/瓶分装上述制剂溶液，冻干。考察冻干形式的药物制剂复溶情况。试验结果如表4。表4制剂溶液中含有不同赋型剂时冻干制剂，复溶后制剂的澄清度注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液本试验结果显示，引入甘露醇、海藻糖与半乳糖的组合物(重量比3:1)、海藻糖、半乳糖等赋型剂等溶质分子，仅将制备可溶解冻干制剂的药物制剂溶液中生长抑素的浓度范围由0～0.1mg/ml提高到0～0.25mg/ml，稍微提高了冻干后可复溶药物制剂中生长抑素浓度；有些赋型剂的引入(例如半乳糖)对提高冻干后可复溶药物制剂中生长抑素浓度的影响不大。3、制剂溶液中赋型剂的筛选(三)配制制剂溶液，其中不同重量比海藻糖和半乳糖组合物、生长抑素1mg/ml，用水调配而成。采用pb-10型ph计(美国sartorius公司)，按照《中华人民共和国药典2015版》有关ph值检测的要求进行检测。检测制剂溶液中生长抑素的溶解度。将制剂溶液装入2ml玻璃冻干瓶，1ml/瓶，移入低温冷冻干燥机(supermodulyo型，0.4m2，e-capparatus公司)产品柜冻干。以1ml注射用水复溶冻干的制剂，考察冻干形式的药物制剂复溶情况。冻干的制剂放入37℃孵箱，孵浴8周后每瓶用1ml注射用水复溶，检测制剂溶液中生长抑素的纯度。不同重量比的海藻糖和半乳糖的制剂溶液ph值、冻干后冻干形式制剂的外观和复溶情况，以及冻干形式的制剂在37℃放置8周后生长抑素的纯度如表5所示，各制剂溶液冻干后生长抑素的纯度检测均为99.86％。通过制剂溶液ph、冻干形式制剂外形和冻干制剂的稳定性综合判断，优选海藻糖和半乳糖重量比为(0.5～0.9)：1。冻干形式的药物制剂均可用1ml至5ml注射用水复溶，重新制成液体药物制剂。表5不同赋形剂下的ph、冻干外观、重溶时间和8周稳定性注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液试验结论：上述试验表明，采用重量比为(0.5～0.9)：1海藻糖：半乳糖的赋形剂，作为生长抑素的制剂的赋形剂，产品质量更加优秀。注射用生长抑素试验例1、仪器与药品高效液相色谱仪(hp1100型，美国惠普公司)，dad检测器，agilentchemstation色谱工作站：yb-2型澄明度检查仪(天津大学精密仪器厂)；du640型紫外分光光度仪(美国贝克曼公司)；phs-3c型数字酸度计(上海雷磁仪器厂)；ws/08-0l型调温调湿箱(杭州蓝天仪器生产有限公司)；metyler.ae200型分析天平(瑞士)；注射用生长抑素(根据实施例4-8所述制备的样品)。2、方法酸度取本品，加水溶解并制成每1ml中含0.5mg的溶液，混匀，依法测定(附录ⅵh)，ph值应为4.5～6.5。含量测定取本品10瓶，分别加水适量，使内容物溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为供试品溶液，照生长抑素项下的方法测定，计算每瓶的含量，求出10瓶的平均含量，即得。2.3影响因素实验在上市药品包装条件下，将三批实施例5样品(批号为160321、160407、160610)在高温(60℃)、强光(4500lx)、高湿条件下考察5、10天，对其酸度、含量及有关物质等指标进行考察，各项指标均符合规定。测定结果见表6。表6影响因素试验结果a、b、c代表实施例5的三批样品，批号为160321、160407、160610的样品。2.6加速实验在上市药品包装条件下，将三批实施例5样品(批号为160321、160407、160610)在温度(40±2)℃、相对湿度75％土5％条件下存放，分别于0、1、2、3、6个月末取样，测定各项指标。各批样品性状均为白色疏松块状物。酸度、有关物质和含量测定结果见表7。2.7长期实验在上市药品包装条件下，将三批实施例5样品(批号为160321、160407、160610)在温度(25±2)℃、相对湿度60％±10％条件下存放，分别于0、3、6、12、18、24个月末取样，测定各项指标。各批样品性状均为白色疏松块状物，酸度、有关物质和含量测定结果见表7。表7加速试验和长期试验考察结果a、b、c代表实施例5的三批样品，批号为160321、160407、160610的样品。结论：影响因素试验、加速试验结果显示，注射用生长抑素各项测定指标无明显变化，稳定性良好；长期室温条件下放置注射用生长抑素24个月各项质量指标无明显变化，产品稳定性良好。注射用生长抑素复溶后的稳定性测定试验将160321、160407、160610的样品用注射用水250ml复溶后，置于4℃冰箱中，每天测定一次，连续测定14天，以测定值(y)对时间(x)进行直线回归分析。结果如表8所示。表8注射用生长抑素复溶后的稳定性p>0.05说明生长抑素的浓度在所测定的时间内基本稳定。结论：从表8可知，本发明三批产品复溶后连续测定14天后，生长抑素保持含量稳定。说明本发明所示方法制备的注射用生长抑素复溶后性质稳定。当前第1页12