本发明属于鸭病学研究领域，具体涉及一组鸭腺病毒dadv-3和dadv-a通用型检测引物及其应用。
背景技术：
腺病毒颗粒为无囊膜、核衣壳呈二十面体对称、线性、双链dna病毒，其基因组全长约为33kd左右。其中，六邻体蛋白（hexon）是腺病毒科各属病毒最主要的结构蛋白，每个hexon蛋白表面携带有病毒主要的属的种特异性抗原决定簇，是病毒中和抗体的靶目标，含有病毒主要的保护性抗原基因簇，与病毒的致病性密切相关。
根据国际病毒分类委员会（internationalcommitteeontaxonomyofviruses，ictv）的最新分类（https://talk.ictvonline.org/），腺病毒科（family:adenoviridae）下设5个属（genera），分别为富at腺病毒属(genus:atadenovirus)、禽腺病毒属(genus:aviadenovirus)、鱼腺病毒属(genus:ichtadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(genus:mastadenovirus)和唾液酸酶病毒属(genus:siadenovirus)。
研究发现，禽类中存在多种腺病毒感染，其中感染鸡的腺病毒有5种：禽腺病毒a型（fowlaviadenovirusa，fadv-a）、禽腺病毒b型（fowlaviadenovirusb，fadv-b）、禽腺病毒c型（fowlaviadenovirusc，fadv-c）、禽腺病毒d型（fowlaviadenovirusd，fadv-d）、禽腺病毒e型（fowlaviadenoviruse，fadv-e），均属于禽腺病毒属。感染火鸡（turkey）的腺病毒有4种，分别属于腺病毒科的两个属，其中火鸡腺病毒b型（turkeyaviadenovirusb）、火鸡腺病毒c型（turkeyaviadenovirusc）和火鸡腺病毒d型（turkeyaviadenovirusd）属于禽腺病毒属；而火鸡唾液酸酶病毒a型（turkeysiadenovirusa）属于唾液酸酶病毒属。感染鹦鹉(psittacine)的的腺病毒有2种，分别属于腺病毒科的两个属，其中鹦鹉富at腺病毒属a型（psittacineatadenovirusa）属于富at腺病毒属；而鹦鹉腺病毒b型（psittacineaviadenovirusb）属于禽腺病毒属。
近年来，随着我国水禽（尤其是鸭）饲养规模的不断扩大，养殖模式的发展，水禽中新发疫病也越来越多、越来越复杂。鸭群中腺病毒感染也存在分属腺病毒科不同腺病毒属的相关报道，有属于富at腺病毒属的鸭腺病毒a型（duckadenovirusa，缩写为dadv-a）。2014年，随着高通量技术的发展，mareka等测定了1株鸭源腺病毒（gr株，genbank登录号nc024486）全基因组序列，将其命名为鸭腺病毒2型（duckadenovirus2），并基于基因组特点和遗传进化特征将其归为禽腺病毒属成员（mareka,kajángl,kosiolc,etal.completegenomesequencesofpigeonadenovirus1andduckadenovirus2extendthenumberofspecieswithinthegenusaviadenovirus[j].virology,2014,462-463:107-114.），随后ictv将其科学命名为鸭腺病毒b型（以区别属于富at腺病毒属的dadv-a）。2014年以来，在我国番鸭中出现一种新的鸭腺病毒（ch-gd-2014株，genbank登录号kr135164），该病毒和鸭腺病毒2型（duckadenovirus2）gr株存在以下明显区别：①其全基因组序列和gr株的核苷酸同源性仅为92.3%；②ch-gd-2014株和gr株的hexon基因的核苷酸同源性仅为76.6%；③ch-gd-2014株有2个纤突蛋白（fiber1、fiber2），而gr株只有1个纤突蛋白（fiber）。基于上述特征表明，我国鸭群中流行一种新的鸭腺病毒，并将其命名为鸭腺病毒3型（duckadenovirus3，dadv-3）（周镇海．鸭腺病毒3型基因组序列分析及致病性研究[d]．华南农业大学硕士论文，2016．）。这就给dadv-3和dadv-a带来现实需求，一般而言，对两个病原进行检测，需要针对2个病原的分别设计引物（即共需要4条引物），来建立检测方法。
本研究基于dadv-3和dadv-a的hexon基因保守区核苷酸序列特征，建立一种仅需2条引物即可dadv-3和dadv-a进行同时扩增，建立鸭腺病毒（dadv-3和dadv-a）通用型检测pcr方法。该方法的敏感性和pcr相当，简单实用、方便快捷，当前尚未见基于类似原理的dadv-3和dadv-a的通用型检测引物的报道，本研究可填补相关研究领域空白。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一组鸭腺病毒dadv-3和dadv-a通用型检测引物及其应用，建立能够对鸭群中出现的两种鸭腺病毒dadv-3和dadv-a的鉴别诊断方法，该方法不仅能同时检测dadv-3和dadv-a两种鸭腺病毒，还具有重复性好、特异性强、敏感性高的特点。
为实现上述目的采用以下技术方案：
一组鸭腺病毒dadv-3和dadv-a通用型检测引物，所述引物如下：
dadv-3a-f0：5’-actacatwggttttmgsgataatt-3’，
dadv-3a-r0：5’-arctwagytcastattcctgtc-3’。
本发明的另一个目的是提供含有所述的引物的鸭腺病毒dadv-3和dadv-a通用型检测试剂盒。
按照dreamtaqgreenpcrmastermix(2×)试剂盒推荐的的50μl体系进行扩增，其中2×pcrmastermix扩增反应液25μl、10μm引物dadv-3a-f0和dadv-3a-r0分别为1.0μl、提取的核酸模板1.0μl、补充灭菌去离子水至终体积50μl，混匀后进行pcr扩增。
扩增条件为95℃预变性3min后进入循环，95℃变性30s、△t（52℃-62℃）退火30s、72℃延伸30s，40个循环结束后，72℃终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。△t（52℃-62℃）表示退火温度在此区间进行优化。经优化后的最佳退火温度为56℃。
本发明的优点在于：
本发明基于dadv-3和dadv-a的hexon基因保守区核苷酸序列特征，优化设计了dadv-3和dadv-a通用型引物，最终实现了鸭腺病毒（dadv-3和dadv-a）的快速检测。该方法不仅能同时检测dadv-3和dadv-a两种鸭腺病毒，还具有重复性好、特异性强、敏感性高的特点，为在鸭群中开展腺病毒分子流行病毒学调查和科学防控相关疫病提供支撑，具有十分重要的研究意义。
附图说明
图1上游引物设计区。
图2下游引物设计区。
图3pcr产物的电泳，其中m：dl2000分子量标准；1：dadv-3；2：dadv-a；3：dev；4：mdpv；5：ducv；6：gpv；7：e.coli；8：r.a.；9：p.m.；10：dadv-2；11：灭菌去离子水。
具体实施方式
实施例1
1、材料
1.1毒株和菌株
试验用病原dadv-3（w1fj株，genbank登录号mh349774）、dadv-a（fj12025株，genbank登录号kf286430）由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。
试验用对照毒株鸭肠炎病毒（dev）、番鸭细小病毒（mdpv）、鸭圆环病毒（ducv）、鸭源鹅细小病毒（gpv）；试验用对照菌株鸭大肠杆菌（e.coli）、鸭疫里氏杆菌(r.a.)和鸭源禽多杀性巴氏杆菌(p.m.)，均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。鸭腺病毒2型（dadv-2）的hexon基因（gr株，genbank登录号nc024486）序列全长由上海生工股份有限公司合成。
1.2引物设计
根据美国国家生物技术信息中心(nationalcenterofbiotechnologyinformation，ncbi）数据库genbank上腺病毒科dadv-3代表株：ch-gd-2014株（kr135164）、w1gd株（mh349773）、w1fj株（mh349774）、w1ah株（mh349775）和dadv-a代表株：e05株（ef532411）、fj12025株（kf286430）、d11-jw-012株（kj452170）、d11-jw-017株（kj452171）的hexon基因，利用lasergenednastarmegalign进行核苷酸系列分析比对，确定dadv-3和dadv-a基因保守区分别作为上游通用引物设计区(图1)和下游通用引物设计区(图2)。
利用引物设计软件oligo7.0设计一套引物，如下：
dadv-3a-f0：5’-actacatwggttttmgsgataatt-3’，
dadv-3a-r0：5’-arctwagytcastattcctgtc-3’，该引物对dadv-3和dadv-a均可扩增，目的条带大小为135bp。
1.3主要试剂
dreamtaqgreenpcrmastermix(2×)购自thermoscientific公司，easypuregenomicdnakit、easypurebacteriagenomicdnakit均购自北京全式金生物技术有限公司；dna分子量标准dl500、dna分子量标准dl2000和quickcutsalⅰ酶均购自宝日医生物技术(北京)有限公司。
试验方法的建立
2.1基因组dna的提取
dadv-3、dadv-a、dev、mdpv、ducv、gpv按照easypuregenomicdnakit试剂盒的方法提取相应的基因组dna，-80℃冻存备用。
e.coli、r.a.和p.m.按照easypurebacteriagenomicdnakit试剂盒的方法提取相应的基因组dna，-80℃冻存备用。
2.2反应液的配置和退火温度的优化
按照dreamtaqgreenpcrmastermix(2×)试剂盒推荐的的50μl体系进行扩增，其中2×pcrmastermix扩增反应液25μl、引物dadv-3a-f0/dadv-3a-r0（10μm）分别为1.0μl、提取的核酸模板（dadv-3、dadv-a）各1.0μl、补充灭菌去离子水至终体积50μl，混匀后进行pcr扩增。
扩增条件为95℃预变性3min后进入循环，95℃变性30s、△t（52℃-62℃）退火30s、72℃延伸35s，40个循环结束后，72℃终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。△t（52℃-62℃）表示退火温度在此区间进行优化。经优化后的最佳退火温度为56℃。
结果可见（图3），当模板仅加入dadv-3时，出现大小为135bp的条带（第1泳道）；当模板仅加入dadv-a时，出现大小为135bp的条带（第2泳道）。
2.3特异性试验
将优化后的pcr体系和扩增条件，对dev、mdpv、ducv、gpv、e.coli、r.a.和p.m.以及灭菌去离子水对照进行扩增，均未见扩增条带。结果见图3，dev（第3泳道）、mdpv（第4泳道）、ducv（第5泳道）、gpv（第6泳道）、e.coli（第7泳道）、r.a.（第8泳道）和p.m.（第9泳道）、dadv-2（第10泳道）和灭菌去离子水（第11泳道），表明建立的方法特异性强，对常见水禽病原均无交叉反应（见图3）。
临床应用
对29份临床送检鸭源病料按照常规方法研磨处理后，利用easypuregenomicdnakit提取相应的核酸dna，利用优化后的方法进行鸭腺病毒（dadv-3和dadv-a）感染的检测。结果可见，检测到阳性样品为7份，阳性率为24.14%。
将pcr反应结束后的阳性目的片段利用琼脂糖凝胶回收试剂盒（dp209，天根生化科技（北京）有限公司）分别进行切胶回收。按照peasy-t1simplecloningkit克隆连接试剂盒（ct111-01，北京全式金生物技术有限公司）说明书将hexon基因片段克隆到peasy-t1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100μg/ml）抗性的lb液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒（dp105，天根生化科技（北京）有限公司）提取相应的质粒。采用pcr扩增时的引物和条件对提取的质粒分别进行pcr鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在ncbi上进行blast分析验证，均为相应的dadv-3和dadv-a的hexon基因片段，其中dadv-3阳性片段4份，均和和dadv-3（w1fj株，genbank登录号mh349774）的hexon基因同源性在99.0%以上；dadv-a阳性片段3份，均和dadv-a（fj12025株，genbank登录号kf286430）的hexon基因同源性在99.0%以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
sequencelisting
<110>福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120>鸭腺病毒dadv-3和dadv-a通用型检测引物及其应用
<130>2
<160>2
<170>patentinversion3.3
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<212>dna
<213>人工序列
<400>1
actacatwggttttmgsgataatt24
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
arctwagytcastattcctgtc22