本发明属于流行病学诊断防治领域，涉及一种登革热和登革出血热的基因诊断标志物。
背景技术：
从公元2世纪的antonine瘟疫(shrapr,lotkaaj.aprobleminagedistribution[j].philosophicalmagazine,1911,21:35-438)开始，传染病就一直危害人类的健康，给社会稳定带来了巨大的影响。近年来，登革热传染病的发病率迅速增长，已经成为世界公共卫生问题，而且作为一种疾病记录在新修订的国际卫生条例(2005)的附录ii中。登革热(denguefever)是登革热病毒引起，伊蚊传播的一种急性传染病。开始,人们根据它的症状将其命名为关节热和骨折热(monath,t.p.dengue:therisktodevelopedanddevelopingcountries:proc.nat.acad.sci.usa91(1994),2395-2400)。1869年由英国伦敦皇家内科学会将其命名为登革热(m.g.guzman,g.p.kouri,l.valdes,j.bravo,m.alvares,s.vasquez,i.delgadoands.b.halstead,epidemiologicstudiesondengueinsantiagodecuba.am.j.epidemiol,152(2000),793-799)。登革热是一种流行于热带和亚热带地区的传染病，临床表明，登革热早在200多年前已经被发现，最早于1779年在埃及开罗，印度尼西亚雅加达及美国费城被发现，但它的病因只到1944年才被发现。登革热的传染物是黄病毒科中的一种，此后，于1979，1980，1985年的小流行中分离出ⅰ，ⅱ，ⅲ型病株(centersfordiseasecontrolandprevention,23,(2010),129-145)。1978年登革热在我国广东流行，并分离出第ⅳ型登革热病株(rico-hesse,r.harrison,l.m.salas,r.a.tovar,d.nisalak,a.ramos,c.boshell,j.demesa,t.r.nogheira,m.r.tavassosdarosa,originsofdenguetype2virusesassociatedwithincreasedpathogenicityintheamericas.journalofclinicalvirol-ogy,230(1997),244-251)。
登革出血热是登革热的一种严重临床类型。起病类似典型登革热，发热2～5天后病情突然加重，发生多器官较大量的出血和休克，出现血液浓缩、血小板减少、白细胞增多、肝大。多见于青少年患者，病死率较高。
登革热和登革出血热的发病机理迄今尚未完全阐明，近年来的研究有如下看法。
(1)免疫机理halstead等认为初次感染登革病毒的人，临床上表现为典型登革热，不发生出血和休克；再次感染异型登革病毒时，病毒在血液中与原有的抗体结合，形成免疫复合物，激活补体，引起组织免疫病理损伤，临床上呈现出血和休克。
(2)病毒的变异
hammon认为登革热和登革出血热的不同临床表现与病毒的变异有关。通过塔希堤、斐济等太平洋岛屿的流行病学观察，发现不少初次感染的登革热病人也出现登革出血热临床经过，病人的血清反应也属初次感染类型，且儿童占多数。有人认为登革病毒感染的临床病情轻重与病毒的毒力有关。登革病毒通过变异产生毒力更强的病毒株可能是登革出血热发生的重要原因。
(3)病理变化
a、登革热本病肝、肾、心和脑均有退行性变。心内膜、心包、胸膜、腹膜、胃肠粘膜、肌肉，皮肤及中枢神经系统有不同程度的出血。皮疹中小血管内皮肿胀、血管周围水肿及单核细胞浸润。瘀斑中广泛血管外溢血。
b、登革出血热本病的主要病变为全身血管损害引起的血管扩张、充血，导致出血和血浆外渗。消化道、心内膜下、皮下、肝包膜下、肺及软组织出血。内脏小血管及毛细血管周围出血、水肿及淋巴细胞浸润，肝脾及淋巴结中的淋巴细胞及浆细胞增生，吞噬现象活跃，肺充血及出血，间质细胞增多，肝实质脂肪变并有灶性坏死，汇管区有淋巴细胞、组织细胞及浆细胞浸润。肾上腺毛细血管扩张、充血及灶性出血，球状带脂肪消失，有灶性坏死。骨髓示巨核细胞成熟障碍。
登革热病毒感染的临床表现十分复杂，而且多数症状与疟病、伤寒以及基孔肯亚热等疾病难以区分，单纯依据患者的流行病资料和临床表现很难明确诊断，因此需要实验室检测进一步确诊。目前常用的实验室检测包括：
(1)一般常规检查
a、周围血象登革热患者的白细胞总数起病时即有减少，至出疹期尤为明显；中性粒细胞百分比也见降低，并有明显核左移现象，有异常淋巴细胞，退热后1周血象恢复正常。登革出血热患者的白细胞总数正常或增多，后者见于严重病例及有继发感染者，一般在1万/mm3以上。血小板减少，最低可达1万/mm3以下。
b、尿常规可有少量蛋白、红细胞、白细胞，有时有管型。
(2)病毒分离取早期病人血液，接种于白纹伊蚊细胞株(c6/36)、分离病毒后须经型特异性中和试验或血凝抑制试验加以鉴定。
(3)血清免疫学检查取双份血清作补体结合试验、中和试验或血凝抑制试验，以血凝抑制试验的灵敏性较高，而以补体结合试验最具特异性。恢复期单份标本补体结合抗体效价达到1∶32以上有诊断意义；双份血清效价递升4倍以上可确诊。
(4)其他在登革出血热病例中尚可见血液浓缩，出、凝血时间延长，血清谷草转氨酶升高，凝血酶原时间延长，电解质紊乱，血白蛋白降低，代谢性酸中毒等。各种凝血因子轻度降低，纤维蛋白原减少，纤维蛋白原降解物轻至中度增加。半数以上的休克病例有dic表现。
但是上述常规实验室检测方法的敏感度低，因此开发一种敏感性高、有效检测登革热和登革出血热的方法是亟待解决的问题。
本申请对登革热患者、登革出血热患者以及正常对照组血液样本高通量转录组数据进行多中心、多样本的数据整合分析，获得登革出血热疾病发生发展中关键的mrna、可能的登革出血热早期诊断的生物标志物。深入研究登革出血热和登革热疾病相关基因的调控机制，以及随着登革热疾病的严重程度，基因表达水平的变化情况，为登革出血热和登革热的诊疗提供理论依据。
技术实现要素：
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于登革热和/或登革出血热的早期诊断的分子标志物。相比传统的登革热和/或登革出血热的诊断方法，使用基因标志物来诊断登革热和/或登革出血热的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测ciita基因表达的产品在制备诊断登革热和/或登革出血热的工具中的应用。
进一步，上面所提到的检测ciita基因表达的产品包括：通过反转录pcr、荧光实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测ciita基因表达以诊断登革热和/或登革出血热的产品。
进一步，所述用反转录pcr诊断登革热和/或登革出血热的产品至少包括一对特异扩增ciita基因的引物；所述用荧光实时定量pcr诊断登革热和/或登革出血热的产品至少包括一对特异扩增ciita基因的引物；所述用免疫检测诊断登革热和/或登革出血热的产品包括：与ciita蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断登革热和/或登革出血热的产品包括：与ciita基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断登革热和/或登革出血热的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与ciita蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与ciita基因的核酸序列杂交的探针。
在本发明的具体实施方案中，所述用反转录pcr诊断登革热和/或登革出血热的产品至少包括一对特异扩增ciita基因的引物的序列如seqidno.1和seqidno.2所示。
优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测ciita基因表达的产品可以应用于该平台实现对ciita基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知ciita基因的异常与登革热和/或登革出血热相关也属于ciita基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种诊断登革热和/或登革出血热的工具，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测ciita基因转录水平的针对ciita基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的ciita蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括ciita基因在内的多个基因(例如，与登革热和/或登革出血热相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括ciita蛋白在内的多个蛋白质(例如与登革热和/或登革出血热相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与登革热和/或登革出血热的标志物同时检测，可大大提高登革热和/或登革出血热诊断的准确率。
其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测ciita基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括ciita蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用反转录pcr、荧光实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测ciita基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对ciita基因的引物和/或探针。根据ciita基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测ciita基因表达水平的引物和探针。
与ciita基因的核酸序列杂交的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
所述高通量测序平台包括检测ciita基因表达水平的试剂。
所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测ciita基因的转录水平。
进一步，所述ciita蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述ciita蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能够保留与ciita蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
在本发明的具体实施方案中，所述针对ciita基因的引物序列如下：上游引物序列如seqidno.1所示，下游引物序列如seqidno.2所示。
用于诊断登革热和/或登革出血热的ciita基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组dna的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断登革热和/或登革出血热的ciita基因及其表达产物的来源是血液。
在本发明的上下文中，“诊断登革热和/或登革出血热”既包括判断受试者是否已经患有登革热和/或登革出血热、也包括判断受试者是否存在患有登革热和/或登革出血热的风险。
本发明的“ciita基因”序列(nc_000016.10(10866208..10941562))可在ncbi公共数据库中获取。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现并证实ciita基因表达与登革热和/或登革出血热的密切相关性，验证的样本量多，结果准确。该相关性的提出为登革热和/或登革出血热的诊断与治疗提供了新的途径。
本发明发现了一种既可以诊断登革热又可以诊断登革出血热的分子标志物，该分子标志物不仅可以区分正常人和登革热患者，还可以有效区分登革出血热患者和登革热患者。
本发明开发出了适合于进行登革热和/或登革出血热检测的试剂或试剂盒，检测灵敏度和特异性良好。
附图说明
图1显示利用反转录pcr检测ciita基因mrna在登革热和/或登革出血热患者和正常人中的表达差异。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选登革热和/或登革出血热患者和正常人中差异表达的基因
1、研究对象：
疾病组：收集5名登革热患者，5名登革出血热患者，所有患者根据“who/tdr.dengue-guidelinesfordiagnosis，treatment，preventionandcontrol.2009；http：//www.who.int/tdr/publications/training-guideline-publications/dengue-diagnosis-treatment/en/index.html.dateofaccess:12/05/2015.2009”进行确诊。
正常组：选取健康志愿者4例。
两组之间年龄、性别差异无统计学意义(p>0.10)，具有可比性。
所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书。
2、血液中总rna的提取
(1)新鲜全血，红细胞裂解液(1：1)，颠倒混匀数次，静置5min。10000g，4℃，10min。此时可见白细胞沉淀和上层亮红色的液体。
(2)加入trizol(106-107细胞加500μl)，反复抽吸，直至有大量泡沫产生(细胞裂解的标志之一)，常温孵育5min。
(3)加入氯仿(氯仿：trizol＝1：5)，剧烈混匀15s,室温静置10min。
(4)离心，12,000g15min，4℃。
(5)小心吸取上清液，转移到新ep管中,加入异丙醇(异丙醇：trizol＝1:2),充分混匀(8-10次),室温孵育10min。
(6)离心，12,000g10min，4℃。
(7)可见管底有凝胶状沉淀，弃去上清液，加入75％乙醇(乙醇：trizol＝1:1)，温和混匀，7500g，5min。
(8)弃尽上清液，倒扣在滤纸片上(放在玻璃皿中)室温干燥5min(不要干透，即rna略微出现透明时)，加入60μldepc水溶解沉淀。
3、高通量转录组测序
(1)rna-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用tophatv1.3.1将清洁片段与ucsch.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，h.sapiensucschg19版的预先构建的索引从tophat主页下载，并作为参考基因组，利用tophat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。tophat根据外显子区域和gt-ag剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用tophat方法的系统默认参数。
(2)转录丰度评估
匹配上的读段文件通过cufflinksv1.0.3处理，cufflinksv1.0.3将rna-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。fpkm值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算fpkm估计值的置信区间。cufflinks使用的参考的gtf注释文件从ensembl数据库下载(homo_sapiens.grch37.63.gtf)。
(3)差异表达基因的检测
将下载的ensemblgtf文件和通过tophat匹配的原始文件传输到cuffdiff，cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算gtf文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
4、结果
rna-seq结果显示，登革热患者和正常人之间、登革出血热患者和正常人之间、登革热患者和登革出血热患者之间均存在的差异表达基因共有1789个，差异均具有统计学意义(p<0.05)。
实施例2反转录pcr实验验证登革热和/或登革出血热患者和正常人中差异表达的基因
选择实施例1筛选出来的差异表达基因-ciita基因进行大样本验证。
1、研究对象：
疾病组：收集30名登革热患者，25名登革出血热患者，所有患者根据“who/tdr.dengue-guidelinesfordiagnosis，treatment，preventionandcontrol.2009；http：//www.who.int/tdr/publications/training-guideline-publications/dengue-diagnosis-treatment/en/index.html.dateofaccess:12/05/2015.2009”进行确诊。
正常组：选取健康志愿者30例。
两组之间年龄、性别差异无统计学意义(p>0.10)，具有可比性。
所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书。
2、血液中总rna的提取
使用a&dpure全血总rna提取试剂盒(产品组成见表1)提取外周血样本中的总rna。
表1产品组成
按照试剂盒的说明书记载的步骤进行总rna提取，步骤大致如下描述：
1)在1.5ml离心管中加入1mlbufferl9，再加入500μl全血，漩涡振荡30秒混合均匀。
2)13000rpm离心10分钟。在一个洁净的1.5ml离心管中加入400μl无水乙醇备用。
3)吸取700μl离心上清转移到装有无水乙醇的1.5ml离心管中，勿弃吸头，直接用吸头吸注两次混匀，吸取混合液进入步骤4)的操作。
4)转移550μl步骤3)中的混合液转移到核酸纯化柱(核酸纯化柱置于2ml离心管中)中，盖上管盖，12000rpm离心30秒。
5)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，将1.5ml离心管中剩余的液体全部倒入核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rpm离心30秒。
6)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500μlbufferwa,盖上管盖，12000rpm离心30秒。
7)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入700μlbufferwbr，盖上管盖，12000rpm离心30秒。
8)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。
9)弃2ml离心管，将核酸纯化柱置于一个rnase-free的1.5ml离心管中，在纯化柱中加入50μlbufferte，盖上管盖，室温静置1分钟，12000rpm离心30秒。
10)弃纯化柱，洗脱的rna可立即用于各种分子生物学实验；或者将rna储存于-70℃备用。
3、反转录pcr(reversetranscription，rt-pcr)
3.1逆转录
cdna第一链的合成(reversetranscription)：使用gibicol公司提供的superscripttmpreamplificationsystemforfirststrandcdnasynthesis试剂盒完成：
a、在0.5ml微量离心管中，加入总rna1-5μg，补充适量的depch2o使总体积达11μl。在管中加10μmoligo(dt)12-181μl，轻轻混匀、离心。
b、70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列试剂的混合物：
轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。
c、加入superscriptⅱ1μl，在42℃水浴中孵育50min。
d、于70℃加热15min以终止反应。
e、将管插入冰中，加入rnaseh1μl，37℃孵育20min，降解残留的rna。-20℃保存备用。
3.2pcr
(1)取0.5mlpcr管，依次加入下列试剂：
(2)加入适量的ddh2o，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。
(3)设定pcr程序：
30个循环，4℃保温。为了保证实验结果的可靠与准确，可在pcr扩增目的基因时，加入一对内参(如gapdh)的特异性引物，同时扩增内参dna，作为对照。
(4)电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
(5)密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描，电泳条带的密度值大小代表基因mrna表达水平高低。
引物设计
根据genbank中ciita基因和gapdh基因的编码序列设计rt-pcr扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
ciita基因：
上游引物为5’-atggaaggtgatgaagaga-3’(seqidno.1)；
下游引物为5’-ggagtcctggaagacatac-3’(seqidno.2)，
gapdh基因：
上游引物为5’-tcaagatcatcagcaatg-3’(seqidno.3)；
下游引物为5’-cgataccaaagttgtcat-3’(seqidno.4)。
5、统计学方法
结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。
6、结果
经检测，与正常人相比，30例登革热患者中有26例患者血液中ciita基因mrna表达水平显著降低；25例登革出血热患者中有23例患者血液中ciita基因mrna表达水平显著降低。以正常人血液中ciita基因的表达水平设为基准为1，结果如图1所示，与正常人相比，登革热和/或登革出血热患者血液中ciita基因的mrna水平显著降低，差异具有统计学意义(p<0.05)，其中，与登革热患者相比，登革出血热患者血液中ciita基因的mrna水平降低，差异具有统计学意义(p<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110>北京泱深生物信息技术有限公司
<120>ciita基因作为诊断登革热和登革出血热的生物标志物
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
atggaaggtgatgaagaga19
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ggagtcctggaagacatac19
<210>3
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tcaagatcatcagcaatg18
<210>4
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
cgataccaaagttgtcat18