本发明涉及微生物检测
技术领域：
，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测猪圆环病毒3型的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
背景技术：
：圆环病毒（pcv）属于圆环病毒科，是目前已知脊椎动物病毒中最小的一种。猪是圆环病毒的主要宿主，各种年龄的猪对圆环病毒均有较强易感性。胚胎期或生后早期感染的猪，往往在断奶后才发病，一般集中在5周龄~18周龄，尤其在6周龄~12周龄最多见。怀孕母猪感染圆环病毒后，导致繁殖障碍，并可经胎盘垂直传染给仔猪。感染猪可自鼻液、粪便等排泄物中排出病毒，经消化道、呼吸道引起感染。圆环病毒3型（pcv3）引起的感染尤为严重，可造成严重的繁殖障碍，导致母猪发情率增加、产木乃伊胎、流产以及死产和产弱仔等，给养猪业带来严重威胁和巨大的经济损失。对圆环病毒3型（pcv3）的快速准确诊断是临床上防治猪圆环病毒3型（pcv3）的关键。目前实验室诊断pcv的方法大致可分为2类：①病毒的分离与鉴定；②分子生物学方法。病毒分离与鉴定具有结果准确可靠的特点，多用于急性病例的确诊和新疫区的确定，但此方法需要多次操作程序，影响因素较多，且费时费力，不适于此病的快速诊断。分子生物学方法包括pcr、定量pcr、套式pcr，虽然pcr方法较病毒分离鉴定方法快速准确，但需要昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，也不适合基层和现场检测。技术实现要素：本发明的目的是为了解决实验室检测鉴别猪圆环病毒3型困难、耗时长和仪器昂贵等问题，提供一种简便、快捷准确地定量检测猪圆环病毒3型的lamp引物、试剂盒及应用，为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种检测猪圆环病毒3型的实时定量lamp引物，所述lamp引物如seqidno：1~6所示，具体的引物序列如下：seqidno：1(pcv3-f3):tccagttttttccgggacatseqidno：2(pcv3-b3):aacacttggctccaagacgseqidno：3(pcv3-fip):ctttttctccagacccaccccaaaagcagtgctccccattgseqidno：4(pcv3-bip):ttcccgccagaattggtttggggcggaaagttccactcgtaaseqidno：5(pcv3-lf):acacatatgaccccaccgtseqidno：6(pcv3-lb):ggtgaagtaacggctgtgttt。优选的，所述的seqidno：1和seqidno：2序列可用于pcr检测，用于pcr检测的引物seqidno：1和seqidno：2为外引物f3和b3，其扩增片段大小为237bp。本发明还公开了一种检测猪圆环病毒3型的实时定量lamp试剂盒，所述的试剂盒包括具有seqidno:1~6所示核苷酸序列的引物。优选的，所述的试剂盒还包括2×反应缓冲液、bstdna聚合酶、超纯水和猪圆环病毒3型dna模板。优选的，所述的猪圆环病毒3型dna模板是提取自猪圆环病毒3型细胞培养物，是使用病毒基因组dna/rna提取试剂盒提取。本发明还公开了一种检测猪圆环病毒3型的实时定量lamp试剂盒的应用，具体步骤包括：（1）样品准备（2）lamp引物的设计与合成（3）病毒基因组dna模板的提取（4）lamp反应体系建立（5）lamp检测方法。优选的，所述的样品准备包括试验毒株、菌株复壮培养，临床组织样品采集，试剂配制。优选的，所述的lamp反应体系建立以25μl计，2×反应缓冲液12.5μlbstdna聚合酶1μlseqidno：15pmolseqidno：25pmolseqidno：340pmolseqidno：440pmolseqidno：525pmolseqidno：625pmol猪圆环病毒3型dna模板2μl超纯水补足25μl。优选的，所述lamp检测方法的反应温度为63℃，反应在12-15min出现扩增。优选的，所述的lamp检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和定量检测的方法本发明的实质性特点和进步是：1）特异性强所检测的对照病毒和水对照均无阳性结果出来，与pcr检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器。2）灵敏度高普通pcr检测方法的灵敏度为4.39×10-2ng/μl，而使用本发明的lamp检测方法，检测限约为4.39×10-4ng/μl，是普通pcr的100倍。3）迅速获得结果普通的pcr整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的lamp反应方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从病毒基因组dna提取到获取试验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的lamp检测方法反应在12分钟左右出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，依据反应管浊度值的变化情况即可判断结果，扩增反应结束即可获得试验结果，不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从基因组dna提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。4）准确性高本lamp方法检测敏感度比常规pcr方法高，因此在鉴定结果更为准确。此外，目前lamp方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，但显色法只能是反应结束后开盖加入荧光染料进行显色反应，观察是否有显色来判读试验结果，或者通过跑电泳的方法进行结果判定，无法区分特异性扩增与非特异性扩增，因此增加了假阳性诊断结果的几率；而且对于弱阳性反应，通过人为肉眼判读的方式很可能误判为阴性，本方法通过浊度仪实时监控反应管的扩增情况，能够避免上述的缺陷，具有更高的准确性。5）不造成污染常规的lamp方法在反应结束后通过凝胶电泳的方法来判读结果，或者开盖加入荧光染料进行判断，增加了试验成本、耗时间，凝胶电泳使用的染料对环境也造成污染，且打开反应管容易造成实验室气溶胶污染。本方法通过浊度仪实时监控反应管的扩增情况，反应结束即可获得结果，不需要打开反应管的盖子，能有效避免气溶胶污染。6）可实时定量本发明利用tubidimeterreal-timela-320浊度仪来实时分析lamp反应的结果，不同标准样品浓度的负对数及其对应的浊度值达到0.1所需的时间成线性关系，由此绘制标准曲线，获得标准曲线方程，即可进行定量检测。附图说明图1是本发明的lamp方法特异性检测结果，其中1：猪圆环病毒3型、2：猪圆环病毒2型、3：猪瘟病毒、4：蓝耳病毒、5：伪狂犬病毒、6：猪支原体、7：水对照；结果显示，只有猪圆环病毒3型反应管出现浊度的上升曲线，5株对照反应管和水对照反应管均无扩增。图2和图3是分别使用本发明lamp方法和普通pcr方法进行的猪圆环病毒3型敏感性检测的结果；其中1：4.39×101ng/μl、2：4.39×100ng/μl、3：4.39×10-1ng/μl、4：4.39×10-2ng/μl、5：4.39×10-3ng/μl、6：4.39×10-4ng/μl、7：4.39×10-5ng/μl、8：4.39×10-6ng/μl；结果显示本发明的lamp法检测限约为4.39×10-4ng/μl，而普通pcr方法检测限约为4.39×10-2ng/μl。图4是本发明猪圆环病毒3型定量标准曲线：利用不同的标准样品的浓度对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出猪圆环病毒3型拷贝数。具体实施方式下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1建立检测猪圆环病毒3的lamp方法1、材料的准备猪圆环病毒3型阳性病料来自兽医临床，经广西兽医研究所鉴定，猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、蓝耳病毒、伪狂犬病毒和猪支原体疫苗均为市售疫苗。bstdna聚合酶购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号lmp204；病毒基因组dna/rna提取试剂盒，购自康为世纪生物科技有限公司，货号cw0548。2、lamp引物的设计与合成根据genbank中的圆环病毒3型的衣壳蛋白编码基因序列，设计特异性lamp引物，其中f3、b3为外引物，fip、bip为内引物，lf和lb为环引物，其中seqidno：1(pcv3-f3):tccagttttttccgggacatseqidno：2(pcv3-b3):aacacttggctccaagacgseqidno：3(pcv3-fip):ctttttctccagacccaccccaaaagcagtgctccccattgseqidno：4(pcv3-bip):ttcccgccagaattggtttggggcggaaagttccactcgtaaseqidno：5(pcv3-lf):acacatatgaccccaccgtseqidno：6(pcv3-lb):ggtgaagtaacggctgtgttt。3、病毒基因组dna提取使用病毒基因组dna/rna提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，货号cw0548）提取猪圆环病毒3型、对照病毒的基因组dna/rna，以及组织样品的病毒基因组dna。4、lamp反应体系建立按照试剂盒说明书，按25μl体系配置：2×反应缓冲液12.5μlbstdna聚合酶1μlf35pmolb35pmolfip40pmolbip40pmollf25pmollb25pmolpcv3dna2μl超纯水补足25μl。lamp反应在以实时浊度仪(la-320c，日本荣研公司)进行密闭全程监控的形式监测本方法的检出情况，反应温度为63℃，反应时间为60min。5、lamp检测方法1）特异性检测以猪圆环病毒3型，以及对照毒株猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、蓝耳病毒、伪狂犬病毒、猪支原体的基因组dna/rna，作为lamp反应的模板，同时以水作为空白对照，检验lamp方法的特异性。2）敏感性检测以本lamp方法设计的外引物f3和b3为pcr扩增引物，将pcr扩增得到的目的基因片段连接于载体pmd18-t，转化大肠杆菌感受细胞dh5a，氨苄西林抗性筛选获得单克隆菌，提取重组的质粒dna，经测序确认后，测定重组质粒的起始浓度，作为标准样品，用rna-freewater进行连续10倍倍比稀释8个稀释度，取各稀释度2μl作为模板进行lamp扩增和pcr扩增，对比两种检测方法的敏感性3）定量检测设置对照：浓度为1：4.39×101ng/μl；2：4.39×100ng/μl；3：4.39×10-1ng/μl；4：4.39×10-2ng/μl；5：4.39×10-3ng/μl；6：4.39×10-4ng/μl的重组质粒标准样品各一个，因为标准样品浓度的负对数值与其扩增浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1）做成标准曲线，获得标准曲线方程，即可对未知样品的基因拷贝数进行定量检测。实施例2lamp检测方法的特异性结果对1株猪圆环病毒3型、5株对照病毒和水对照进行lamp扩增，结果如图1所示，猪圆环病毒3型反应管在12分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，5株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增情况出现，为阴性结果。实施例3lamp检测方法的敏感性结果猪圆环病毒3型的重组质粒起始浓度为4.39×10ng/μl，用rna-freewater进行连续10倍倍比稀释8个稀释度，取各稀释度2μl作为模板，结果如图2和图3所示，结果显示本发明的lamp法检测限约为4.39×10-4ng/μl，而普通pcr法检测限为4.39×10-2ng/μl。实施例4猪圆环病毒3型定量标准曲线的绘制设置对照：浓度为1：4.39×101ng/μl；2：4.39×100ng/μl；3：4.39×10-1ng/μl；4：4.39×10-2ng/μl；5：4.39×10-3ng/μl；6：4.39×10-4ng/μl的重组质粒标准样品各一个，因为浓度的负对数值与浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1）做成标准曲线，获得标准曲线方程，y=0.509x-7.083，如图4所示。从标准曲线方程来看相关系数r2为0.993，呈良好的线性关系。以时间为x值，可求出y值即浓度的负次方数，则浓度为10-y，再乘以基数4.39，即为4.39×10-yng/μl。依据拷贝数换算公式copies/μl=（6.02×1023×(ng/ul×10-9)）/(dnalength×660)，dnalength为载体序列大小加上目的基因序列大小，为2693+237=2930bp，将其换算成拷贝数（copies/μl）：6.02×1023×（2.05×10-y×10-9）/(2930×660)，简化为：6.38×108×10-y。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为20分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出y等于3.097，则拷贝数为6.38×108×10-3.097，即为6.38×104.903copies/μl，从而达到定量的效果。表1时间（min）12.413.515.717.719.921.8标准值（-log）-101234以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。序列表<110>广西壮族自治区兽医研究所<120>一种检测猪圆环病毒3型的实时定量lamp引物、试剂盒及应用<141>2018-05-30<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequencelatin)<400>1tccagttttttccgggacat20<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequencelatin)<400>2aacacttggctccaagacg19<210>3<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequencelatin)<400>3ctttttctccagacccaccccaaaagcagtgctccccattg41<210>4<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequencelatin)<400>4ttcccgccagaattggtttggggcggaaagttccactcgtaa42<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequencelatin)<400>5acacatatgaccccaccgt19<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequencelatin)<400>6ggtgaagtaacggctgtgttt21当前第1页12