本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法和试剂盒。
背景技术
环介导恒温扩增反应(lamp)是2000年由日本学者notomi等发明的一种恒温核酸体外扩增技术，该方法利用一套(4种)特异性引物，以识别靶基因的六个特定区域。该技术原理是：在bst大片段聚合物的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标dna的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。sybrgreenⅰ是一种荧光染料，根据反应液中成分的变化而呈现出不同的颜色，阴性(没有扩增产物)时为橙色，阳性(有扩增产物)时为绿色。lamp的方法优势是在恒温条件下进行，不需要pcr仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，适于苗期杂草的快速诊断及检测。
日本看麦娘(alopecurusjaponicussteud.)与看麦娘(alopecurusaequalissobol.)都属于禾本科看麦娘属，是我国范围内普遍存在的冬季作物田优势杂草，其生活史与作物(如小麦和油菜)相似，可使这些作物产量和质量显著下降。
农田杂草防治宜早不宜迟，这是由于大龄杂草对除草剂的代谢能力远高于苗期杂草，且如果防治失败，杂草得以繁殖下一代，农田土壤种子库中该种杂草的数量将逐渐增加。这个结果将导致来年杂草防除难度加大，同时也会提高抗药性杂草突变株产生的概率。由于同一属内形态学差异较小，对于日本看麦娘与看麦娘的区别往往是到了抽穗开花期才能鉴别，在苗期一般很难区分。因此，农民在杂草防治时往往将这两种杂草归为一类，甚至有时将菵草也与其归为一类，导致用药不当，防除效果不佳。近年来，抗性日本看麦娘已在国内多个省市如江苏、安徽均有发现，且在不同地区日本看麦娘的抗性程度也有差异。因此，在苗期及时区别日本看麦娘、看麦娘不仅有助于指导农民正确用药，也可以降低日本看麦娘的抗性发生水平，减少除草剂用药量。但经检索，目前国内外尚未对苗期日本看麦娘的lamp快速分子检测有相关报道。
技术实现要素：
本发明针对麦田恶性杂草日本看麦娘、看麦娘苗期难以鉴定，从而导致用药选择不当(尤其是在抗药性发生的种群中)、草害防治效果不佳的现象，提供一种具有简便、快速、省时省力、灵敏高的检测方法。根据日本看麦娘的保守基因序列(its)，优化反应条件，能对苗期的日本看麦娘进行检测，可以及时发现田间优势种是否是日本看麦娘，从而指导正确田间用药，及时控制苗期的草害，可以减少农民的经济损失，具有很强的实用价值。
本发明提供一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法，包括以下步骤:
(1)、分别提取待测样品的基因组dna；
(2)、设计特异性引物，进行lamp恒温扩增；
(3)、在lamp扩增产物中加入荧光染料，观察其颜色变化；和/或，在琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果；
(4)、根据结果，鉴定是否为日本看麦娘。
优选的是，所述步骤(2)中特异性引物为在日本看麦娘的保守基因its上设计的1对外引物和1对内引物。
上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中的两对引物分别是：
外引物：
f3:5’-gcctcggggtaaaagaacc-3’
b3:5’-cgcgggattctgcaattcac-3’
内引物：
fip:5’-ggctagcaagccagccgcagcgccgaaggcgtcaa-3’
bip:5’-atccacatgactctcggcaacg-3’
上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中lamp恒温扩增反应体系：
上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中反应温度为60℃--66℃。
上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中反应温度为60℃。
上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中反应温度为66℃。
上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中反应温度为62℃。
上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中反应条件为63℃60min，80℃10min。
上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中在3.0％琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果。
上述任一方案优选的是，所述步骤(3)荧光染料为sybrgreenⅰ。
上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中鉴定是否为日本看麦娘通过lamp扩增产物颜色和电泳图谱条带进行判断。
上述任一方案优选的是，所述步骤(4)中lamp扩增产物显示绿色，和/或，电泳图谱为梯状条带时，判定为日本看麦娘；若lamp扩增产物为橙色，和/或，电泳图谱无条带扩增，判定为看麦娘。
一种用于快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的检测试剂盒，包含如下反应体系：
上述任一方案优选的是，所述试剂盒内的两对特异性引物为，
f3:5’-gcctcggggtaaaagaacc-3’
b3:5’-cgcgggattctgcaattcac-3’
fip:5’-ggctagcaagccagccgcagcgccgaaggcgtcaa-3’
bip:5’-atccacatgactctcggcaacg-3’
上述任一方案优选的是，试剂盒内反应体系包括bstdna聚合酶(8u/μl)(4-16u)、mg2+(100mm)浓度(1-3μl)、引物fip/bip(20μm)及f3/b3(10μm)浓度(0.5-4μl)、甜菜碱(8m)浓度(2-8μl)。
上述任一方案优选的是，试剂盒反应体系包括bstdna聚合酶(8u/μl)1μl，10×thermopolbuffer2.5μl，100mmmgso42μl，10mmdntp2μl，20umfip1μl，20umbip1μl，10umf31.5μl，10umb31.5μl，8m甜菜碱4μl，盒反应体系加入无菌超纯水制备，100次包装，低温运输，-20℃保存，有效期1年。
本发明提供一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法，本发明针对麦田恶性杂草日本看麦娘、看麦娘苗期难以鉴定，从而导致用药选择不当(尤其是在抗药性发生的种群中)、草害防治效果不佳的现象，提供一种具有简便、快速、省时省力、灵敏高的检测方法。根据日本看麦娘的保守基因序列(its)，优化反应条件，能对苗期的日本看麦娘进行检测，可以及时发现田间优势种是否是日本看麦娘，从而指导正确田间用药，及时控制苗期的草害，可以减少农民的经济损失，具有很强的实用价值。本发明提供一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法，植物条形码研究发现，核糖体核dna候选条形码its在被子植物中的通用性较高且具有最高的物种分辨率。为了能够及时鉴别日本看麦娘、看麦娘，控制田间杂草种群的蔓延及指导田间农民正确用药，设计了以日本看麦娘its序列为模板，以lamp技术为基础的分子生物学检测方法快速检测苗期的日本看麦娘，该方法具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，从而大大提高检测效率。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明提供的分子检测方法能够快速检测苗期日本看麦娘、看麦娘并进行区分，具有灵敏度高，特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益结果是；
(1)简便易行：该检测方法通过恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能进行实验，通过反应产物验收变化即可判定结果，不需要昂贵的仪器设备以及繁琐的电泳过程；
(2)检测高效性：该检测方法所用检测时间仅需1小时左右，而pcr扩增时间较长，大大提高了检测的效率；
(3)灵敏度高：以dna为模板，该方法的检测下限为5×10-3ng/μl，是常规pcr的100倍；
(4)准确性高：该方法几乎不受反应混合液中存在的大量外源dna和杂质的影响，不需要从样本中纯化dna，可直接利用粗提的dna进行快速检测，大大提高检测的准确性；
(5)特异性强：该方法通过2对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于pcr引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大大提高，假阳性出现的概率也随之减低；
(6)本发明是国内外首次利用lamp技术对苗期日本看麦娘、看麦娘进行检测，这种方法快速简便，对指导农民正确科学用药，减少除草剂使用量、降低成本和减少环境污染具有重要的现实意义。
附图说明
图1a：含有日本看麦娘的lamp反应电泳图谱：m-2000bpmarker；1-未加dna的清水对照(ck)；2-加入日本看麦娘dna(ajaponicus,标记为j)；3-加入看麦娘dna为阴性对照(a.aequalis,标记为a)；
图1b：含有日本看麦娘的lamp反应正常光照下的产物颜色：pcr产物加入少许同等剂量的sybrgreenⅰ颜色变化情况；
图1c：含有日本看麦娘的lamp反应紫外光照下的产物颜色；
图2a：含有日本看麦娘lamp灵敏度检测反应紫外灯下及正常光照下的产物颜色；其中：ck-未加dna的清水对照；其余从左至右依次为50，5，5×10-1，5×10-2，5×10-3，5×10-4，5×10-5ng/μl。
图2b：含有日本看麦娘lamp灵敏度检测反应电泳图谱；其中：m-2000bpmarker；ck-为未加dna的清水对照；其余从左至右依次为50，5，5×10-1，5×10-2，5×10-3，5×10-4，5×10-5ng/μl。
图3：日本看麦娘普通pcr灵敏度检测电泳图谱。
图4：反应温度优化过程电泳图谱。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
实施例1
lamp反应组合物的特异性实验
为了验证lamp反应引物组合物的特异性，以日本看麦娘保守鉴定基因its序列(genbank:kp711080.1)为依据，设计lamp引物，并用植物dna提取试剂盒分别提取日本看麦娘和看麦娘dna为模板进行lamp实验，优选出能特异性鉴定苗期日本看麦娘的lamp引物组合物。
各引物序列具体如下：
(1)内引物对：
fip:5’-ggctagcaagccagccgcagcgccgaaggcgtcaa-3’
bip:5’-atccacatgactctcggcaacg-3’
(2)外引物对：
f3:5’-gcctcggggtaaaagaacc-3’
b3:5’-cgcgggattctgcaattcac-3’
实施例2lamp反应体系及检测试剂盒体系优化
为了节省检测成本，保证该检测方法的稳定性和可靠性，对反应体系中的bstdna聚合酶(8u/μl)(4-16u)、mg2+(100mm)浓度(1-3μl)、引物fip/bip(20μm)及f3/b3(10μm)浓度(0.5-4μl)、甜菜碱(8m)浓度(2-8μl)进行了优化，确定了试剂盒最佳反应体系为：bstdna聚合酶(8u/μl)1μl，10×thermopolbuffer2.5μl，100mmmgso42μl，10mmdntp2μl，20umfip1μl，20umbip1μl，10umf31.5μl，10umb31.5μl，8m甜菜碱4μl，加入无菌超纯水7.5μl制备，100次包装，低温运输，-20℃保存，有效期1年。
各引物序列具体如下：
fip:5’-ggctagcaagccagccgcagcgccgaaggcgtcaa-3’
bip:5’-atccacatgactctcggcaacg-3’
f3:5’-gcctcggggtaaaagaacc-3’
b3:5’-cgcgggattctgcaattcac-3’
图1a为含有日本看麦娘的lamp反应电泳图谱，为电泳图谱，1b为含有日本看麦娘的lamp反应正常光照下的产物颜色，其中ck和a产物颜色为暗红色，j产物为绿色，1c为含有日本看麦娘的lamp反应紫外光照下的产物颜色，其中ck和a颜色相近，均为橙色，j为亮绿色。
实施例3lamp反应条件优化
为了得到最适的反应温度，保证该检测方法的高效性，对反应参数中的反应温度进行了优化，在反应温度为60℃--66℃的条件下均有dna条带扩增，如图4所示，从高效性考虑，得出最适反应温度为63℃。
实施例4lamp反应灵敏度检测
为了确定lamp反应的检测下限，本实验中用试剂盒提前纯化的基因组dna作为模板以10倍梯度稀释。以上述稀释的基因组dna为模板，分别进行lamp及pcr扩增。图2a为含有日本看麦娘lamp灵敏度检测反应紫外灯下及正常光照下的产物颜色，ck组颜色和5×10-5ng组颜色相近正常状态下为暗红色，紫外灯下为橙色，其余组正常光照下均为绿色，紫外灯下为亮绿色，但亮度随浓度降低也逐渐降低；图2b为含有日本看麦娘lamp灵敏度检测反应电泳图谱，图3为日本看麦娘普通pcr灵敏度检测电泳图谱。从图2和图3的对比可知，本实验中lamp技术的最低检测下限为5×10-3ng，而普通pcr检测下限为5×10-1ng。