本发明属于基因领域，尤其是一种基于pcr-dgge技术的沙门氏菌分型方法。
背景技术：
食品种类繁多,富含丰富的营养物质。它是微生物生长繁殖的天然培养基。因此对食品中复杂的混合微生物群落进行及时监测和准确鉴定变得越来越重要。传统微生物检测方法主要是依赖于富集培养、选择性分离、菌落计数和生化鉴定等方法，检测步骤繁琐、培养时间长、工作量大、检出率及灵敏度不高，容易出现假阴性。而以pcr(polymerasechainreaction)技术为主的一些分子生物学检测技术因具有快速、灵敏的特点，正逐渐取代传统检测方法成为食品安全监督的有力工具。如变性梯度凝胶电泳(denaturedgradientgelelectrophoresis,dgge)技术是根据dna在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同但碱基排列不同的dna片段分开，从而了解微生物的分布情况。它是研究微生物群落组成及亲缘关系的主要分子生物学检测技术之一，是研究微生物群落组成分析的重要技术，dgge技术不依赖于培养过程，缩短了样品分析时间，能显示环境样品中不可培养微生物的遗传信息。近年来，食源性病原菌污染食品引起的食源性疾病逐年呈上升趋势，引起了人们的广泛关注。由于食源性致病菌的广泛空间性、时间性复杂因子的存在，一直难以得到及时有效的监控。不仅对食品安全卫生和人民健康构成严重威胁，也对食品工业和国民经济造成很大的影响。因此迫切需要深入了解主要食源性致病菌的生物学特性和致病机理，控制致病菌的危害，切断其感染途径，对食品安全实行全程监测。近年来，随着分子生物学技术的发展，对食源性致病菌的检测方法不断改进，检测技术日趋完善.目前用于微生物溯源的分型方法包括表型分型和基因分型。如血清型、碳源利用及抗生素抗性等，均可以进行表型分型；利用现代分子生物学方法，如脉冲场凝胶电泳、限制性片段多态性、重复序列分型等方法进行基因分型。然而，这些都需要分离培养的方法来进行分型。由于食源性致病菌有些很难分离培养，很多容易发生变异，需要直接利用分子生物学方法进行分型鉴定，变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,dgge)以特异性基因的差异来表征菌株之间的差异，可以达到不经分离培养致病菌进行检测分型的目的。细菌dna序列的变化是所有基因分型的依据,所以理论上只要完成对种内多株细菌的全基因组测序就可得到精确分型。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一中具有分离快速简便、重复性好pcr-dgge技术的沙门氏菌分型方法。本发明实现目的的技术方案如下：一种基于pcr-dgge技术的沙门氏菌分型方法，步骤如下⑴提取供试样品的dna，并进行样品编号；⑵以样品基因组dna为模板，采用引物gc-rpob1/rpob3r扩增样品；⑶pcr产物的变性梯度凝胶电泳分析；取10μlpcr的产物进行变形梯度凝胶电泳分析，采用变形梯度为35％～55％、浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶在1×tae缓冲液中100v60℃下电泳15小时；然后染色；⑷dgge图谱中优势条带的回收与测序用灭菌的手术刀切下待回收dgge条带，采用omega公司poly-geldnaextractionkit回收目的条带；⑸dgge凝胶条带回收后，以rpob1f/rpob3r为引物进行pcr扩增。pcr产物纯化后连接到pmd18-t载体上，转化至dh5α感受态细胞中，筛选阳性克隆测序。⑹采用mega5软件，neighbor-joining法构建系统发育树，自展数(bootstrap)为1000，根据测序结果进行比对，鉴定样品分型。而且，变形梯度凝胶电泳完毕后、采用银染法染色、步骤如下：⑴固定液(乙醇50ml、冰醋酸2.5ml、定容500ml)固定15min；⑵milli-q纯水清洗、20s和2min各一次；⑶银染液(硝酸银1g、37％甲醛0.75ml、定容500ml)染色15min；⑷milli-q纯水清洗、20s和2min各一次；⑸显色液(氢氧化钠7.5g、37％甲醛2.5ml、定容500ml)显色5-7min；⑹最后用终止液(乙醇50ml、冰醋酸2.5ml、定容500ml)终止反应。本发明的优点和积极效果是：变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,dgge)以特异性基因的差异来表征菌毒株之间的差异，可以达到不经分离培养致病菌进行检测分型的目的。细菌dna序列的变化是所有基因分型的依据,所以，只要完成对种内多株细菌的全基因组测序就可得到精确分型。pcr-dgge技术具有分离快速简便、重复性好等优点，避免了分离纯化和培养所造成的分析上的误差，通过指纹图谱直接再现菌群结构，并且通过序列分析切下的带或者通过独特的探针杂交鉴定其种类，是一种快速高效的病原微生物分型检测方法。附图说明图1gc-pcr检测(m：dl2000)扩增产物大小为250bp左右；图2dgge电泳图；图3标记差异条带克隆测序；图4量化分析胶图；图5依据样品间的相似系数构建的聚类图(upgma)；图6采用mega5软件，neighbor-joining法构建系统发育树图。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。一种基于pcr-dgge技术的沙门氏菌分型方法，步骤如下：1、材料和样品由甲方提供5个样品。样品编号为：1,2,3,4,5,m(m为商用marker:dl2000)表1样本来源信息1.2dna提取1.2.1挑取纯化后的样本接种于10mlbhi肉汤中，36℃±1℃过夜摇床培养，吸取1.5ml培养液于灭菌eppendorf管中，将培养液离心收集细菌(12000r/min，1min)，用灭菌0.85％生理盐水洗涤两次后离心(12000r/min，1min)将上清液吸取干净。使用dna提取试剂盒进行提取。1.2.2向离心管内加入200μl的细胞悬浮液，涡旋混匀，至菌体彻底悬浮。1.2.3向eppendorf管中加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。再向离心管内加入220μl的裂解液，于涡旋混匀仪上震荡15sec，在70℃水浴锅中放置10min。1.2.4向水浴后的离心管内加入220μl无水乙醇，充分震荡混匀15sec。将离心管内所有液体转移至专用吸附柱中，离心(12000r/min，30sec)，弃掉废液。1.2.5将吸附柱放入至收集管中，向吸附柱中央滴加500μl去蛋白漂洗液，离心(12000r/min，30sec)，弃掉废液。1.2.6再向吸附柱内加入600μlpw漂洗液，离心(12000r/min，30sec)，弃掉废液。共漂洗两次。1.2.7将吸附柱于生物安全柜内放置数分钟，以彻底晾干管内残余液体。将吸附柱重新转移至另一个无菌eppendorf管中，向吸附柱中央悬滴te洗脱液150μl，于室温放置2-5min后，离心(12000r/min，2min)，将溶液收集到eppendorf管中。-20℃冷冻保存备用。1.3pcr扩增以样品基因组dna为模板，采用引物gc-rpob1/rpob3r扩增样品表2引物信息pcr扩增体系(50μl)为：10×pcrbuffer5μl；dntp(2.5mm)3.2μl；rtaq(5u/μl)0.4μl；gc-rpob1(20μm)1μl；rpob3r(20μm)1μl；模板dna50ng；补ddh2o至50μl。pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，53℃(-0.5℃)30s，72℃延伸1min，10个循环后进入第二个循环程序：94℃变性1min，48℃30s,72℃1min，25个循环后，72℃持续7min。pcr产物采用omega公司dnagelextractionkit纯化回收。pcr仪为biometra公司生产的t-gradient，凝胶成像仪为bio-rad公司的gel-doc2000凝胶成像系统。1.4pcr产物的变性梯度凝胶电泳(dgge)分析取10μlpcr的产物进行变形梯度凝胶电泳(dgge)分析。采用变形梯度为35％～55％、浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶在1×tae缓冲液中100v60℃下电泳15小时。变形梯度凝胶电泳(dgge)完毕后、采用银染法染色、步骤如下：a)固定液(乙醇50ml、冰醋酸2.5ml、定容500ml)固定15minb)milli-q纯水清洗、20s和2min各一次c)银染液(硝酸银1g、37％甲醛0.75ml、定容500ml)染色15mind)milli-q纯水清洗、20s和2min各一次e)显色液(氢氧化钠7.5g、37％甲醛2.5ml、定容500ml)显色5-7min最后用终止液(乙醇50ml、冰醋酸2.5ml、定容500ml)终止反应1.5dgge图谱中优势条带的回收与测序用灭菌的手术刀切下待回收dgge条带，采用omega公司poly-geldnaextractionkit回收目的条带。以2μl回收产物为模板，rpob1f/rpob3r为引物进行pcr扩增。pcr扩增体系(50μl)为：10×pcrbuffer5μl；dntp(2.5mm)3.2μl；rtaq(5u/μl)0.4μl；rpob1f(20mm)1μl；rpob3r(20mm)1μl；模板dna1μl；补ddh2o至50μl。pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，53℃(-0.5℃)30s，72℃延伸1min，10个循环后进入第二个循环程序：94℃变性1min，48℃30s,72℃1min，25个循环后，72℃持续7min。将重新扩增的dna片段切胶回收、纯化后，连接到pmd18-t载体上，并转化至dh5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，进行序列测定。2结果与分析2.1pcr扩增以gc-rpob1/rpob3为引物扩增，得到目的dna片段(图1)用于dgge分析。样本排序为:1-2-3-4-5-m。2.2pcr产物的变性梯度凝胶电泳(dgge)变性梯度凝胶电泳(dgge)分析结果如图2..标记菌带如图3表3每个样本含有菌带样本编号含有菌带1s2,s42s1,s53s1,s44s1,s35s1,s4根据实验胶图,用quantityone软件生成数字量化图,以样本1为参照,设置100％,进行排序.同一个水平线,视为菌带为一致,随机选择一个菌带进行回收测序.表4戴斯系数比较pcr-dgge图谱的相似性(％)聚类是依据戴斯相似系数upgma形成，以说明样本的关系,分析得出,样本3和样本5含有的菌的种类最为相似，1号样本与其他样本菌群差的比较多。2.3主要电泳条带的序列测定dgge凝胶条带回收后，以rpob1f/rpob3r为引物进行pcr扩增。pcr产物纯化后连接到pmd18-t载体上，转化至dh5α感受态细胞中，筛选阳性克隆测序。测序结果与genbank中的序列进行比对，得到条带所代表的细菌类型。每个回收条带选取3个克隆子进行了序列测定，如下表。表5序列比对分析结果采用mega5软件，neighbor-joining法构建系统发育树，自展数(bootstrap)为1000，系统发育树如图6。序列表<110>北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心<120>一种基于pcr-dgge技术的沙门氏菌分型方法<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>58<212>dna<213>引物gc-rpob1(unknown)<400>1cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggaacatcggtttgatcaac58<210>2<211>18<212>dna<213>引物rpob1f(unknown)<400>2aacatcggtttgatcaac18<210>3<211>20<212>dna<213>引物rpob3r(unknown)<400>3cgttgcatgttggtacccat20当前第1页12