本发明涉及食品检测领域，尤其涉及用于评价啤酒酵母活力的多重引物、试剂盒及评价方法。
背景技术：
在啤酒酿造过程中，酵母活力的高低严重影响着啤酒的发酵速度、啤酒品质以及啤酒厂的生产效率。酵母活力越高，啤酒发酵速度越快，啤酒发酵周期短，发酵设备周转快，生产效率高。同时，酵母活力反映了酵母的生理状态，酵母活力旺盛，有利于减少杂菌污染的几率，降低异味的产生，保证成品啤酒的风味和质量。目前评价酵母活力的方法主要有次甲基蓝染色法、血球计数板培养法、活力滴定法等。其中，次甲基蓝染色法只能区分活、死酵母，当酵母活力低时无法检测；血球计数板培养法对操作要求高；活力滴定法操作较复杂，测定误差大。技术实现要素：本申请针对传统评价酵母活力的方法存在的评价结果不准确、评价范围小、操作要求高及操作复杂等问题，提出了一种评价啤酒酵母活力的多重引物、试剂盒及评价方法。为了达到上述目的，本发明提供了一种用于评价啤酒酵母活力的多重引物，包括根据酵母蛋白酶a关键基因pep4的同源基因pep4-sc和pep4-sb分别设计特异性上下游引物，具体包括：本发明还提供了一种试剂盒，包含如上述技术方案所述的用于评价啤酒酵母活力的多重引物。本发明还提供了一种利用如上述技术方案所述的多重引物评价啤酒酵母活力的方法，包括以下步骤：以酵母菌株总rna为模板依次进行反转录合成cdna模板、多重pcr扩增反应、毛细管电泳分离，并利用gexp系统对毛细管电泳分离结果进行分析；以内参基因为对照，结合关键基因对应峰的峰面积计算蛋白酶a基因的表达量；采用与荧光底物结合法测定蛋白酶a的活力；根据蛋白酶a基因表达量与蛋白酶a活力的比值判断酵母活力为较好、适中或较差。作为优选，所述内参基因包括act1的同源基因act1-sc、act1-sb，根据内参基因设计特异性上下游引物，具体包括：作为优选，以内参基因为对照，结合关键基因对应峰的峰面积计算蛋白酶a基因的表达量的具体计算方法为：pep4-sc基因表达量＝pep4-sc峰面积/(act1-sc峰面积+act1-sb峰面积)/2。作为优选，根据蛋白酶a基因表达量与蛋白酶a活力的比值判断酵母活力的具体方法为：当比值≤0.1时，判定酵母活力较差；当0.1<蛋白酶a基因表达量<0.3时，判定酵母活力适中；当比值≥0.3时，判定酵母活力较好。作为优选，以酵母菌株总rna为模板、以序列seqidno.2、seqidno.4、seqidno.6和seqidno.8所示的下游引物为特异性引物反转录合成cdna模板第一链。作为优选，所述反转录合成cdna模板的反应参数设置为：48℃，1min；42℃，60min；95℃，5min。作为优选，以合成的cdna模板第一链为模板、以序列seqidno.1、seqidno.3、seqidno.5和seqidno.7所示的上游引物为特异性引物进行多重pcr扩增反应。作为优选，所述多重pcr扩增反应的参数设置为：95℃预变性10min；94℃变性30s；退火温度55℃，30s；70℃延伸1min，整个pcr扩增反应过程循环35次。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：1、通过检测酵母蛋白酶a基因表达量和蛋白酶a活力，能够真实反映酵母细胞的活力状况，便于有效检测啤酒发酵过程中的酵母活力，有利于提高啤酒的品质。2、采用gexp多功能遗传分析系统，能够高通量、准确地检测酵母蛋白酶a关键基因的表达量，具有更强的特异性、灵敏性、自动化程度等特点，保证了结果的可靠性和可重复性。附图说明图1为实施例1中的酵母蛋白酶a关键基因及内参基因的多重扩增产物电泳结果。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1一种快速检测工业巴氏酵母蛋白酶a基因的方法，包括总rna的提取、反转录反应制备cdna模板、多重pcr反应、毛细血管电泳、产物片段分析。(1)多重引物设计根据工业巴氏酵母蛋白酶a基因pep4-sc，pep4-sb以及内参基因act1-sc、act1-sb的全长序列，设计适用于gexp检测的特异性上下游多重引物(表1)。表1工业巴氏酵母蛋白酶a基因以及内参基因的特异性上下游引物(2)总rna提取与纯化1)收集酵母取发酵液或酵母泥，12000rpm离心2min；弃上清，每3×108个酵母细胞迅速加入0.5-1ml的rnalater溶液；震荡后重悬，分装，4℃冰箱存放1h，12000rpm离心2min，弃上清。2)酵母细胞rna的提取按照rna提取试剂盒的流程，逐步操作，提取酵母rna。向样品中加入200μl磷酸缓冲液，12000rpm离心，去上清。加入200μl磷酸缓冲液重悬再加入20μl溶壁酶，30℃处理45min；加入600μl裂解液，1ml裂解液中加入10μl2-巯基乙醇，12000rpm室温离心2min，转移上清至rnase-free的离心管中；加入587μl无水乙醇，充分涡旋。取500μl到柱子，12000rpm离心15s；加入700μl洗涤缓冲液i，12000rpm离心15s。加入500μl洗涤缓冲液ii，12000rpm离心15s；加入30μl80℃的rnase-free水，室温12000rpm离心2min；加入2μldnasei于37℃处理40min，加入2μldnase失活剂于室温放置5min，12000rpm离心2min，即可得到纯化的总rna，立即检测浓度，-80℃冰箱保存；rna纯度测定：如果测定的od260/280在1.8-2.1之间，即可用于后续实验，否则重新提取。(3)反转录反应制备cdna模板以酵母总rna为模板合成cdna第一链，表1中多重引物的下游引物为特异性引物。反转录反应制备cdna模板反应参数设置如下：48℃，1min；42℃，60min；95℃，5min。(4)多重pcr反应以上述合成的cdna第一链为模板，表1中多重引物的上游引物为特异性引物，进行多重pcr扩增反应。pcr扩增参数设置如下：95℃预变性10min；94℃变性30s；退火温度55℃，30s；70℃延伸1min，整个pcr扩增反应过程循环35次。(5)多重pcr产物毛细管电泳取1μlpcr多重产物加到分装有39μl的95％去离子甲酰胺(sls)和400bpmarker混合液的上样板的孔中，用移液枪混匀后覆盖一滴石蜡油。另外在缓冲液板每孔中加入250μl的分离缓冲液。全部准备完后，上机进行毛细管电泳。分离胶、分离缓冲液购自beckmancoulter。(6)产物片段分析按照gexp多功能遗传分析系统的检测流程进行蛋白酶a基因表达量的检测：首先进行毛细管电泳分离，结果见图1，利用gexp系统参数对毛细管电泳结果进行分析，记录结果。每个峰均表示相应的基因，每个峰的面积对应着基因的表达量，其中每个峰的峰面积结果见表2。根据蛋白酶a基因大小、内参基因大小、系统对照大小查找其对应的峰面积。系统对照的峰图代表了毛细管电泳结果是否正常。表2蛋白酶a关键基因和内参基因对应的峰面积结果序号基因名称峰面积1pep4-sc294862pep4-sb75753act1-sc25784act1-sb1115(7)以内参基因为对照，计算蛋白酶a基因的表达量。pep4-sc基因表达量＝pep4-sc峰面积/(act1-sc峰面积+act1-sb峰面积)/2pep4-sb基因表达量＝pep4-sb峰面积/(act1-sc峰面积+act1-sb峰面积)/2计算得到pep4-sc基因表达量为15.97，pep4-sb基因表达量为4.10，由于sc来源的蛋白酶a基因表达量远高于sb来源的基因表达量，且其表达量在不同条件下的波动较大，受外界环境影响大，表明sc来源的蛋白酶a基因在酵母菌株中起主导作用，因此用sc来源的蛋白酶a基因表达量来代表蛋白酶a基因的表达量。实施例2取a、b、c三个工厂的回收酵母，12000rpm离心2min，上清液用来测定蛋白酶a活力，下层酵母用来提取rna，采用实施例1所述的方法测定蛋白酶a基因表达量。同时采用活力滴定法(vt值)测定酵母活力作比较。并跟踪分析使用此回收酵母生产的8°p成品啤酒的质量指标。结果如表3：表3a、b、c三个工厂的回收酵母的活力评价结果a工厂的蛋白酶a基因表达量与蛋白酶a活力比值较低，酵母活力较差，其成品酒的发酵度偏低，成熟度指标双乙酰和乙醛偏高，泡持性较差。c工厂的蛋白酶a基因表达量与蛋白酶a活力比值较高，酵母活力较好，其成品酒的发酵度高，成熟度指标双乙酰和乙醛低，泡持性好。基于上述结论可知，本实施例可通过蛋白酶a基因表达量与蛋白酶a活力比值有效评价酵母活力，这主要是因为：蛋白酶a存在于啤酒酵母的液泡内，当酵母活力降低或酵母细胞受到外界环境不良影响时就会被释放出来。蛋白酶a从胞内释放到胞外的比例，反映了酵母活力的水平。蛋白酶a由pep4基因编码，监控酵母细胞内pep4基因的表达量，检测分泌到胞外的发酵液中的蛋白酶a活力，根据两者的比值可以准确高效地评价酵母的活力状况。由以上实验结果可以发现，通过测定蛋白酶a基因表达量与蛋白酶a活力比值可以对啤酒的酵母活力进行评价，从而实现对啤酒发酵过程中成品酒发酵度以及成熟度指标进行监控。与传统啤酒酵母活力的评价方法相比，该方法能够真实反映酵母细胞的活力状况，便于有效检测啤酒发酵过程中的酵母活力，有利于提高啤酒的品质；采用gexp多功能遗传分析系统，能够高通量、准确地检测酵母蛋白酶a关键基因的表达量，具有更强的特异性、灵敏性、自动化程度等特点，保证了结果的可靠性和可重复性。序列表<110>青岛啤酒股份有限公司<120>用于评价啤酒酵母活力的多重引物、试剂盒及评价方法<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>38<212>dna<213>上游引物pep4-sc<400>1aggtgacactatagaatatggtcagcgccaaccaagtt<210>2<211>40<212>dna<213>下游引物pep4-sc<400>2gtacgactcactatagggagggcaacttcggggttagctt<210>3<211>42<212>dna<213>上游引物pep4-sb<400>3aggtgacactatagaatacggactgtaacactagagacggct<210>4<211>43<212>dna<213>下游引物pep4-sb<400>4gtacgactcactatagggagccccgtaaatggagtagtatttg<210>5<211>35<212>dna<213>上游引物act1-sc<400>5aggtgacactatagaataacgctcctcgtgctgtc<210>6<211>38<212>dna<213>下游引物act1-sc<400>6gtacgactcactatagggatagaaggctggaacgttaa<210>7<211>36<212>dna<213>上游引物act1-sb<400>7aggtgacactatagaataggcatcacaccttttaca<210>8<211>39<212>dna<213>下游引物act1-sb<400>8gtacgactcactatagggaattccgactcgtccaacatc。序列表<110>青岛啤酒股份有限公司<120>用于评价啤酒酵母活力的多重引物、试剂盒及评价方法<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1aggtgacactatagaatatggtcagcgccaaccaagtt38<210>2<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gtacgactcactatagggagggcaacttcggggttagctt40<210>3<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aggtgacactatagaatacggactgtaacactagagacggct42<210>4<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gtacgactcactatagggagccccgtaaatggagtagtatttg43<210>5<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aggtgacactatagaataacgctcctcgtgctgtc35<210>6<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gtacgactcactatagggatagaaggctggaacgttaa38<210>7<211>36<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7aggtgacactatagaataggcatcacaccttttaca36<210>8<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gtacgactcactatagggaattccgactcgtccaacatc39当前第1页12