本发明属于农药检测技术领域，具体涉及一种基于数字pcr的有机磷农药残留生物条形码免疫分析试剂盒及其应用。
背景技术
三唑磷农药是一种光谱性的有机磷杀虫剂，杀螨剂。三唑磷农药已在2016年12月31日禁止在蔬菜中使用，并且日本规定稻米中三唑磷的最大残留限量(mrl)为不得检出；欧盟除茶叶为0.05mg/kg、棉籽0.1mg/kg外，其余样品为0.02mg/kg；我国三唑磷的最大残留限量一般都限定为0.05mg/kg。因此加强对于三唑磷的残留检测方法具有重要意义。
相对于gc-ms/ms，lc-ms/ms，gc等方法来说，免疫分析方法具有快速简便，不需要专门的技术人员，价格成本低等优点，免疫分析方法主要包括荧光免疫分析，酶联免疫分析，化学发光免疫分析，生物条形码免疫分析。生物条形码免疫分析方法以其高灵敏度在近几年迅速发展。数字pcr技术是一种可以对待检物进行绝对定量分析的技术。在1992年，sykes等在正常体细胞和非淋巴细胞背景下检测白血病细胞时提出要将体系进行有限稀释，终点信号的有无，根据泊松分布的原理处理数据。在当时并没有提出数字pcr的概念，但是却为数字pcr的产生奠定了基础。在1999年，vogelstein等正式提出了数字pcr的概念。deborahpersaud等利用微滴式数字pcr技术确认全球首例hiv感染患儿功能性治愈冯兆民等基于微滴式数字pcr技术对甲型流感病毒进行检测。数字pcr以及广泛应用于基因表达分析，临床诊断，转基因成分定量，微生物检测等方面的应用，现阶段还没有关于农药等小分子物质的检测。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于数字pcr的有机磷农药残留生物条形码免疫分析试剂盒及其应用，提高检测灵敏度。
本发明提供了一种基于数字pcr的有机磷农药残留生物条形码免疫分析试剂盒，所述试剂盒包括如下组成：胶体金探针溶液、磁性纳米探针溶液、磁分离装置、洗液、微滴发生器、pcr引物对、pcr探针和pcrmix液；所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和特异性单克隆抗体的金纳米粒子；所述生物条形码利用所述pcr引物对扩增得到；所述pcr探针的核苷酸序列与所述生物条形码的部分序列互补配对；所述磁性纳米探针为表面修饰有机磷农药抗原的磁球。
优选的，生物条形码的修饰方法通过固定在金纳米粒子表面的生物条形码互补链互补配对实现。
优选的，所述生物条形码的序列如seqidno.1所示；所述pcr引物对包括扩上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如seqidno.2所示；所述下游引物的序列如seqidno.3所示；所述pcr探针的序列如seqidno.4所示。
优选的，所述胶体金探针溶液中特异性单克隆抗体的浓度为40～50mg/l；所述胶体金探针溶液中生物条形码的浓度为1～3μmol/l；所述磁性纳米探针溶液中抗原的浓度为70～80mg/l；
优选的，所述有机磷农药包括三唑磷，所述有机磷农药抗原包括三唑磷半抗原与ova偶联形成的完全抗原，所述特异性单克隆抗体包括抗三唑磷单克隆抗体。
优选的，所述金纳米粒子的粒径≤0.22μm；所述洗液为0.005～0.015mol/l的ph值为7～8的pbs缓冲液。
优选的，所述试剂盒中还包括有机磷农药标准品。
本发明还提供了上述试剂盒在检测有机磷农药残留中的应用。
优选的，所述检测有机磷农药残留的方法包括如下步骤：
(1)将胶体金探针溶液与待测样品和磁性纳米探针溶液混合，37℃孵育0.5～2h，得到反应液；
(2)将反应液用磁分离装置吸附后，弃去溶液，用洗液进行洗涤，得到磁性纳米探针和胶体金探针的复合物；
(3)将所述步骤(2)得到的磁性纳米探针和胶体金探针的复合物置于50～65℃水中震荡解离0.5～2h，得到生物条形码溶液；
(4)以所述步骤(3)中得到的生物条形码溶液为扩增模板，用pcr引物对和pcrmix液配制pcr反应体系；
(5)将所述pcr反应体系利用微滴发生器进行数字pcr扩增，得到生物条形码的绝对定量结果；
(6)以有机磷农药标准品为待测样品，按步骤(1)～(5)的方法测定绝对定量结果，将有机磷农药标准品浓度的log值与抑制率绘制成标准曲线，计算得到标准方程式；
(7)将所述步骤(5)得到的生物条形码量绝对定量计算得到的抑制率代入标准方程式中，计算得到有机磷农药残留量；
所述步骤(6)和步骤(1)～(5)之间没有时间顺序的限制。
优选的，所述步骤(4)中pcr反应体系包括10μl的pcrmix液，2μl模板，1μl200～300nmol/l的上游引物，1μl200～300nmol/l的下游引物，0.5μl100～150nmol/l的pcr探针和5.5μl的ddh2o；所述步骤(5)中数字pcr扩增的反应程序为：95℃，8:00；94℃，30s，57℃，40s，40个循环；98℃，8:00；4℃hold。
有益效果：
本发明提供了一种基于数字pcr的有机磷农药残留生物条形码免疫分析试剂盒，所述试剂盒包括胶体金探针溶液、磁性纳米探针溶液、磁分离装置、洗液、微滴发生器和pcrmix液；所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和特异性单克隆抗体的金纳米粒子；所述pcr引物对能对所述生物条形码进行扩增；所述pcr探针与所述生物条形码互补；所述磁性纳米探针表面修饰有抗原。本发明提供的试剂盒利用生物条形码进行信号放大，同时利用数字pcr对生物条形码的数量进行绝对定量，能显著提高检测灵敏度至0.002ng/ml。
附图说明
图1为本发明实施例1所述方案流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于数字pcr的有机磷农药残留生物条形码免疫分析试剂盒，所述试剂盒包括如下组成：胶体金探针溶液、磁性纳米探针溶液、磁分离装置、洗液、微滴发生器、pcr引物对、pcr探针和pcrmix液；所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和特异性单克隆抗体的金纳米粒子；所述生物条形码利用所述pcr引物对扩增得到；所述pcr探针的核苷酸序列与所述生物条形码的部分序列互补配对；所述磁性纳米探针为表面修饰有机磷农药抗原的磁球。
本发明提供的免疫分析试剂盒包括胶体金探针溶液。在本发明中，所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和特异性单克隆抗体的金纳米粒子。所述生物条形码是具有一定序列的寡核苷酸链，一般具有特异性，标记于纳米粒子表面用于信号放大。在本发明中，所述生物条形码的修饰方法通过固定在金纳米粒子表面的生物条形码互补链互补配对实现，便于生物条形码的解离。所述生物条形码互补链通过巯基与金纳米粒子相固定。在本发明所述胶体金探针溶液中，所述生物条形码的浓度优选为1～3μmol/l，更优选为2μmol/l。本发明对生物条形码的具体序列形式不作特别限定，本领域常规市售的生物条形码产品均可用于本发明所述技术方案。在本发明的实施例中，所述生物条形码由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列如seqidno.1所示。在本发明所述胶体金探针溶液中，所述特异性单克隆抗体的浓度优选为40～50mg/l，更优选为47.6mg/l。本发明所述特异性单克隆抗体能与有机磷农药抗原特异性结合。本发明所述胶体金探针溶液在竞争反应过程中优选稀释15～25倍后使用，更优选稀释20倍使用。
在本发明中，所述述胶体金探针的制备方法，包括如下步骤：胶体金的合成，生物条形码互补链的活化，特异性单克隆抗体的标记、生物条形码互补链的标记、封闭与离心、生物条形码的标记与离心。
在本发明中，所述胶体金的合成的方法优选包括以下步骤：将haucl4水溶液在磁力搅拌下加热至沸腾，加入柠檬酸三钠溶液，伴随磁力搅拌和加热直至溶液变为深红色，反应15min，得到胶体金溶液。所述胶体金溶液合成后，本发明优选过滤。所述过滤后金纳米粒子溶液的粒径≤0.22μm，更优选为粒径13nm。haucl4水溶液的浓度为1mmol/l，所述柠檬酸三钠溶液的浓度为38.8mmol/l；haucl4水溶液和柠檬酸三钠溶液的体积比为10:1。所述过滤后金纳米粒子溶液优选在4℃储存备用。
在本发明中，当所述生物条形码的核苷酸序列如seqidno.1所示时，所述生物条形码互补链的核苷酸序列如seqidno.5所示。所述生物条形码互补链的活化方法优选包括以下步骤：将生物条形码互补链离心0.5～3min，用te缓冲液溶解后，加入活化液，室温下震荡2～3h。在本发明中，所述活化液优选为tcep溶液，所述tcep溶液的浓度优选为15～25mmol/l，更优选为20mmol/l。所述tcep的添加量与生物条形码的质量比优选为150～250:1，更优选为200:1。所述活化的温度优选为20～28℃，更优选为25℃。所述活化的时间优选为2～3h，更优选为2.5h。
本发明用特异性单克隆抗体标记金纳米粒子。所述特异性单克隆抗体的标记方法优选包括以下步骤：将特异性单克隆抗体与上述胶体金溶液混合，孵育。所述胶体金溶液在混合时的ph值优选为8.5～9.5，更优选为9.0。所述孵育的温度优选为20～28℃，更优选为25℃。本发明优选使用0.1mol/l的k2co3溶液对胶体金溶液的ph值进行调节。
本发明用生物条形码互补链标记金纳米粒子。所述生物条形码互补链的标记方法优选包括以下步骤：将上述活化的生物条形码互补链加入到特异性单克隆抗体标记的胶体金溶液中，依次加入peg溶液和pbs溶液，孵育。所述peg溶液优选为质量浓度30％的peg20000。所述peg溶液加入的终浓度优选为质量浓度0.5～2％，更优选为质量浓度1％。加入peg溶液可以有效防治胶体金的不可逆聚集。所述pbs溶液的浓度优选为0.1mol/l，所述pbs溶液加入的终浓度优选为0.005～0.02mol/l，更优选为0.01mol/l。所述孵育的温度优选为20～28℃，更优选为25℃，所述孵育的时间优选为0.5～2h，更优选为1h。
本发明对上述特异性单克隆抗体和生物条形码互补链标记的金纳米粒子进行封闭和离心。所述封闭优选使用质量浓度3％的bsa溶液进行，所述bsa溶液的添加终浓度优选为质量浓度0.5～2％，更优选为质量浓度1％。所述封闭的时间优选为15～45min，更优选为30min。所述离心的转速优选为11000～13000rpm，更优选为12000rpm，所述离心的时间优选为10～30min，更优选为20min。离心后去上清液，得到红色沉淀加探针重悬液，所述探针重悬液优选包括0.01mol/l的pbs(ph7.4)，1％bsa，和1％peg20000。
得到重悬液后，本发明向重悬液中加入生物条形码进行标记。所述生物条形码的标记包括如下步骤：向上述重悬液中加入生物条形码，静置，离心。所述生物条形码的添加量终浓度优选为1～3μmol/l，更优选为2μmol/l。所述静置的时间优选为3～5h，更优选为4h。所述离心的转速优选为11000～13000rpm，更优选为12000rpm。所述离心的时间优选为10～30min，更优选为20min。离心后去上清液，得到红色沉淀加探针重悬液，所述探针重悬液优选包括0.01mol/l的pbs(ph7.4)，1％bsa，和1％peg20000。重悬后的胶体金探针溶液中特异性单克隆抗体的浓度优选为40～50mg/l，更优选为47.6mg/l。重悬后的胶体金探针优选置于4℃温度下保存。
本发明提供的免疫分析试剂盒包括pcr引物对和pcr探针。所述pcr引物对能对所述生物条形码进行扩增；所述pcr探针与所述生物条形码互补，可实现生物条形码检测。当所述生物条形码的核苷酸序列如seqidno.1所示时，所述pcr引物对中的上游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；下游引物的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述pcr探针的核苷酸序列如seqidno.4所示。在本发明中，所述pcr探针上标记有荧光基团和猝灭基团(fam和bq1)，能用于数字pcr扩增后的信号检测。
本发明提供的免疫分析试剂盒包括磁性纳米探针溶液。在本发明中，所述磁性纳米探针为表面修饰有机磷农药抗原的磁球。所述磁性纳米探针与待测样品能竞争性的与胶体金探针表面修饰的抗体发生特异性结合。在本发明所述磁性纳米探针溶液中，所述有机磷农药抗原的浓度优选为70～80mg/l，更优选为75.2mg/l。本发明所述有机磷农药优选包括三唑磷。所述有机磷农药抗原优选包括三唑磷半抗原与ova偶联形成的完全抗原，相应的标记在金纳米粒子上的特异性单克隆抗体优选包括抗三唑磷单克隆抗体。本发明所述磁性纳米探针溶液在竞争反应过程中优选稀释70～90倍后使用，更优选稀释80倍使用。
在本发明中，所述述磁性纳米探针的制备方法优选包括如下步骤：磁性颗粒的活化，磁性颗粒与半抗原-ova的偶联，封闭。
在本发明中，所述磁性颗粒的活化优选包括以下步骤：将磁性纳米颗粒置于mes缓冲液中洗脱2～3次，加入nhs和edc，震荡，pbst洗脱2～3次。在本发明中，所述mes缓冲液作为洗脱液使用；所述nhs和edc的作用为活化羧基。所述mes缓冲液优选为0.01mol/l的mesbuffer(ph6.0)。所述nhs加入后的浓度优选为5～15mg/ml，更优选为10mg/ml。所述edc加入后的浓度优选为5～15mg/ml，更优选为10mg/ml。所述震荡的时间优选为10～20min，更优选为30min。
在本发明中，所述磁性颗粒与半抗原-ova的偶联优选包括以下步骤：向活化后的磁性颗粒中加入半抗原-ova和mes缓冲液，震荡。所述mes缓冲液的浓度优选为0.01mol/l。以所述mes缓冲液为分散系，所述磁性颗粒的浓度优选为10mg/ml(购自于thermofisherscientific)。
本发明优选对上述磁性颗粒与半抗原-ova的偶联产物进行封闭。所述封闭前优选使用pbst洗脱液(所述psbt洗脱液中优选包括0.01mol/l的pbs(ph7.4)和0.5％的t-20)洗脱3～4次，然后加入bsa溶液封闭。所述bsa溶液的质量浓度优选为1～5％，更优选为2％。所述封闭的时间优选为20～60min，更优选为40min。封闭后，本发明优选将磁珠置于0.1％bsa和0.1％吐温的pbs缓冲液中4℃保存。
本发明提供的免疫分析试剂盒包括磁分离装置。所述磁分离装置利用磁性作用力能将与磁性纳米探针结合的胶体金探针分离出来。本发明对所述磁分离装置不做特别限定，本领域常规使用的磁分离装置均可。
本发明提供的免疫分析试剂盒包括洗液。所述洗液用于清洗磁分离装置分离得到的磁性纳米探针结合的胶体金探针。所述洗液优选使用pbst洗脱液(所述pbst洗脱液中优选包括0.01mol/l的pbs(ph7.4)和0.5％t-20)。
本发明提供的免疫分析试剂盒包括微滴发生器。所述微滴发生器用于数字pcr中微滴的形成。本发明对所述微滴发生器的来源不作特别限定，本领域常规用于数字pcr的微滴发生器均可。
本发明提供的免疫分析试剂盒包括pcrmix液。所述pcrmix液用于配制pcr反应体系。本发明对所述pcrmix液的来源不作特别限定，本领域常规市售pcrmix液均可。
本发明提供的免疫分析试剂盒还包括有机磷农药标准品。所述有机磷农药标准品用于标准曲线的绘制，可实现待测样品的定量分析。所述有机磷农药标准品由浙江大学提供。
本发明提供了上述免疫分析试剂盒在检测有机磷农药残留中的应用。
在本发明中，所述检测有机磷农药残留的方法优选包括如下步骤：
(1)将胶体金探针溶液与待测样品和磁性纳米探针溶液混合，37℃孵育0.5～2h，得到反应液；
(2)将反应液用磁分离装置吸附后，弃去溶液，用洗液进行洗涤，得到磁性纳米探针和胶体金探针的复合物；
(3)将所述步骤(2)得到的磁性纳米探针和胶体金探针的复合物置于50～65℃水中震荡解离0.5～2h，得到生物条形码溶液；
(4)以所述步骤(3)中得到的生物条形码溶液为扩增模板，用pcr引物对和pcrmix液配制pcr反应体系；
(5)将所述pcr反应体系利用微滴发生器进行数字pcr扩增，得到生物条形码的绝对定量结果；
(6)以有机磷农药标准品为待测样品，按步骤(1)～(5)的方法测定绝对定量结果，将有机磷农药标准品浓度的log值与抑制率绘制成标准曲线，计算得到标准方程式；
(7)将所述步骤(5)得到的生物条形码量绝对定量计算得到的抑制率代入标准方程式中，计算得到有机磷农药残留量；
所述步骤(6)和步骤(1)～(5)之间没有时间顺序的限制。
在本发明中，步骤(1)所述磁性纳米探针溶液优选稀释80倍再使用，所述磁性纳米探针稀释80倍后的使用体积与所述待测样品的使用体积比例优选为1：1。所述胶体金探针溶液的使用体积与所述待测样品的使用体积比例优选为5:2。
在本发明中，所述步骤(4)中pcr反应体系包括10μl的pcrmix液，2μl模板，1μl200～300nmol/l的上游引物，1μl200～300nmol/l的下游引物，0.5μl100～150nmol/l的pcr探针和5.5μl的ddh2o；
在本发明中，步骤(5)所述数字pcr扩增的反应程序优选为：95℃，8:00；94℃，30s，57℃，40s，40个循环；98℃，8:00；4℃hold。
在本发明中，步骤(6)所述抑制率的计算方法为：
i＝(qmax-qx)/(qmax-q0)
式中：i——抑制率；
qmax——不加农药竞争的含量；
qx——农药浓度为x时的含量；
q0——只加pbs的空白对照孔的含量。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于数字pcr的有机磷农药残留生物条形码免疫分析试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)胶体金的合成
将100ml1mmol/l的haucl4水溶液加入圆底烧瓶中，连接冷凝管并开始回流。在磁力搅拌下加热至沸腾，迅速加入10ml新制备的38.8mmol/l的柠檬酸三钠溶液，随着搅拌和加热的进行，溶液的颜色由黄色先变黑后逐渐变为深红色，反应15min后，在室温条件下自然冷却至室温，4℃储存备用。
(2)胶体金探针的制备
1)生物条形码互补链的活化：将由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的生物条形码dna链按照说明书在12000rpm下离心1min，用te缓冲液溶解后，加入tcep(20mmol/l)溶液，使tcep与dna的比例为200：1，室温下震荡2～3h.。
2)抗体的标记：胶体金溶液过0.22μm孔径的滤膜后，分别取1ml的胶体金溶液，用0.1mol/l的k2co3调节ph值至9.0左右。将18.12μg三唑磷单克隆抗体加入到调节好ph值的胶体金溶液中，充分吹打混匀，室温孵育1h。
3)生物条形码互补链的标记：将活化的生物条形码互补链加入到对应的上述混合液中，充分混匀。加入30％的peg20000至终浓度为1％，充分混匀后一次性加入0.1mol/l的pbs至终浓度为0.01mol/l。静置1h。
4)封闭与离心：加入3％的bsa至终浓度为1％，继续静置30min以上，12000rpm离心20min，弃去上清液，得到的红色沉淀加探针重悬液，用移液器轻轻吹打，使沉淀重悬浮混匀。
5)生物条形码的标记与离心：加入一定量的生物条形码使溶液中生物条形码的浓度为2μmol/l，并在室温下静置4h，12000rpm离心20min，弃去上清液，得到的红色沉淀加探针重悬液，用移液器轻轻吹打，使沉淀重悬浮混匀。并放于4℃下保存。
(3)磁性纳米探针的制备
1)磁性颗粒的活化：取1ml磁性纳米颗粒，并用mes缓冲溶液洗脱3次，随后加入10mg/ml的nhs和edc，并在振荡仪上轻微震荡反应30min，随后用pbst洗脱3次。
2)磁性颗粒与半抗原-ova的偶联：加入800μg的半抗原-ova和500μl的mes缓冲溶液，室温条件震荡一夜。
3)封闭：用pbst洗脱3～4次，然后加入含有3％的bsa溶液封闭40min，最后将磁珠重悬于500μl的含有0.1％bsa，0.1％吐温的pbs的缓冲液中，最终制得磁性纳米探针。并放于4℃。
(4)三唑磷农药残留检测步骤
1)间接竞争免疫反应：首先加入50μl胶体金探针溶液，再先后加入20μl稀释80倍的磁性纳米探针溶液和20μl的三唑磷农药标准品或是待测样品，在微量震荡仪上轻微震荡1min混合后，37℃孵育1h。在此过程中，三唑磷农药标准品或样品中的待测农药分别与包被抗原竞争结合相应胶体金探针上的抗体。磁性纳米探针在磁铁的作用下将与磁性纳米探针结合的胶体金纳米探针留下，其余胶体金纳米探针被洗脱除去。
2)生物条形码的解离：向洗脱完的溶液中加入60μl的超纯水，并将其放入60℃水浴锅中震荡1h。在磁铁的作用下，取出解离下的生物条形码链。
3)数字pcr反应体系制备：每个体系中加入10μl的探针法mix，2μl的模板，1μl的上游引物，1μl的下游引物，0.5μl的探针，5.5μl的ddh2o。
4)微滴制备：将反应体系放入微滴发生器芯片的小孔中，并加入70μl微滴生成油，将微滴发生器的芯片放入微滴发生器中，并用移液枪将生成的微滴转入到96孔板中并进行密封。
5)数字pcr的扩增反应：将96孔板放入pcr扩增仪中进行行扩增，条件如下：在95℃下反应8:00，94℃下反应30s，57℃下反应40s，将步骤2和步骤3反应34个循环，再98℃下反应8:00，最后在4℃下保存。
6)微滴分析：pcr反应结束后将96孔板放入微滴分析仪中，分析每个样品的荧光信号，软件根据阴性微滴的比例结合泊松分布的原理对每个孔的模板数目进行绝对定量。
7)利用有机磷农药标准品绘制标准曲线，形成标准方程式；将得到的生物条形码量绝对定量结果代入标准方程式中，计算得到有机磷农药残留量。
结果：以log[c(ng/ml)]为横坐标，抑制率为纵坐标，得到标准方程式：y＝19.914x+60.84，r2＝0.9712。ic50为0.28ng/ml，ic10为0.002ng/ml。(其中，ic50表示反应被抑制一半时抑制剂的浓度，ic10表示检测限)
对比例1
基于qpcr的生物条形码免疫分析方法，步骤如下：
(1)制备胶体金探针和磁性纳米探针。
(2)在每个反应管中加入胶体金纳米探针，磁性纳米探针和待测的农药分子，进行竞争免疫反应。
(3)竞争结束的反应进行洗脱，将体系放入60℃下，震荡反应1h。并将生物条形码解离下来，加入超纯水。
(4)制备qpcr反应体系，经解离下来的dna链加入到体系中进行pcr扩增，从而进行定量。
与对比例1相比，本发明具有高灵敏度、对含有抑制pcr反应的抑制剂的样品耐受力更强的优势。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
<120>一种基于数字pcr的有机磷农药残留生物条形码免疫分析试剂盒及其应用
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
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