本发明属于基因工程领域，涉及一种中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用。
技术背景
大豆为一年生草本植物，起源于中国，在我国已有5000多年的种植历史。大豆含有丰富的蛋白质、脂肪及一些对人体有益的活性成分，能够为人类提供植物蛋白和油脂。大豆花叶病毒(smv)病严重影响着大豆的产量和品质，且在我国及世界各大豆产区均有发生。大豆花叶病毒(smv)为rna病毒，构建侵染性克隆载体可以实现在dna水平上开展smv致病机理等多方面的研究，解决了rna病毒基因组难以操作的难题。
植物病毒侵染性克隆可以分为侵染性cdna克隆和具有侵染能力的体外转录物两种类型。侵染性cdna克隆是将植物病毒的全长cdna构建在35s启动子的下游，将载体直接摩擦接种或者用基因枪轰击的方法使载体进入宿主细胞内，成功进入宿主细胞的cdna在35s启动子的作用下先转录成病毒rna，再通过复制达到侵染植物的目的。侵染性体外转录物，主要是基于一些噬菌体强启动子构建载体，病毒基因组与噬菌体启动子相连构建载体，将载体线性化后在体外利用相应的rna聚合酶转录出具有侵染性的rna。本发明所构建的侵染性克隆载体属于侵染性cdna克隆载体。
植物病毒侵染性cdna克隆的构建根据植物病毒基因组的不同而有所差别，一些基因组较小的病毒可直接利用rt-pct进行反转录获得病毒全基因组。基因组较大的植物病毒由于反转录酶与基因组受二级结构的影响不适合用rt-pct直接获得病毒全基因组。一般采用的cdna合成的方法有：1、直接在体外拼接构建全长cdna；2、设计特异引物，利用rt-pcr分段克隆病毒cdna，然后对获得的片段逐步拼接，最后将全序列整合到载体骨架中。3、先扩增部分cdna片段并将其构建到载体骨架中，然后扩增剩余部分将其连接到中间载体，再通过酶切连接的方法整合到载体中，从而完成侵染性载体的构建。本发明采用的是第3种方法。
侵染性克隆载体能够实现dna水平上开展rna病毒分子的相关研究，从而深入地了解病毒与寄主间的互作机制，因此，其应用范围非常广泛。主要包括1、用于研究寄主及病毒的基因功能；2、与血清学、体外翻译及序列分析技术相结合能提高其检测效率；3、在侵染性克隆基础上，通过添加一个或多个多克隆位点构建新植物病毒表达载体以开展双分子荧光互补、大豆体内蛋白互作和免疫共沉淀等研究。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对中国没有大豆花叶病毒中国株系且含报告基因(yfp)侵染性克隆载体的问题，提供一种构建中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体的方法。
本发明的另一目的在于提供构建的中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体。
本发明的又一目的在于提供提供该中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体的构建方法，包含以下步骤：
(1)以中国大豆花叶病毒sc3的cdna为模板，设计smv病毒基因组分段扩增引物a-noti、b-kpni、c-ka、d-aa、e-ac，引物中引入酶切位点，利用高保真酶分段扩增smv基因组；选择扩增引物对应的内切酶noti、kpni、agei、apai、clai分别酶切smv病毒基因组扩增片段和载体骨架，并通过t4连接酶连接；采用此方法依次将smv基因组的片段与载体骨架pbr322相连，使smv病毒基因组完整地连接到载体骨架中，并修复载体中smv基因组出现的碱基突变，获得smv侵染性克隆载体psmv:sc3；其中扩增引物a-noti上游引物序列如seqidno.3所示，下游引物序列如seqidno.4所示；扩增引物b-kpni上游引物序列如seqidno.5所示，下游引物序列如seqidno.6所示；扩增引物c-ka上游引物序列如seqidno.7所示，下游引物序列如seqidno.8所示；扩增引物d-aa上游引物序列如seqidno.9所示，下游引物序列如seqidno.10所示；扩增引物e-ac上游引物序列如seqidno.11所示，下游引物序列如seqidno.12所示；
(2)分别利用引物mlui-noti和smai-kpni以载体psmv:sc3为模板进行pcr扩增，扩增后采用over-lap方法，利用mlui-noti的上游引物和smai-kpni的下游引物将两条pcr产物扩增为一条，在sc3病毒基因p1和hc-pro处通过酶切连接的方法将该pcr产物替换psmv:sc3中的原有片段，引入多克隆位点smai和mlui,于多克隆位点处插入外源蛋白yfp基因序列，构建成含荧光蛋白yfp的侵染性克隆载体psmv:yfp；所述的引物mlui-noti上游引物序列如seqidno.21所示，下游引物序列如seqidno.22所示；扩增引物b-kpni上游引物序列如seqidno.23所示，下游引物序列如seqidno.24所示。
作为所述的中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体构建方法的优选，所述的中国大豆花叶病毒sc3的cdna是通过在感病大豆品种南农1138-2上人工接种大豆花叶病毒sc3株系，发病后取大豆花叶病症状典型的叶片提取smv病毒rna，利用反转录试剂盒将rna反转录为cdna获得。
作为所述的中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体的构建方法的优选，smv侵染性克隆载体psmv:sc3序列如seqidno.2所示。
按照所述的构建方法构建的含荧光蛋白yfp的中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体psmv:yfp。
本发明所述的含荧光蛋白yfp的中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体psmv:yfp在smv在大豆体内运动踪迹可视化研究中的应用。
本发明所述的含荧光蛋白yfp的中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体psmv:yfp在dna水平上开展rna病毒smv研究中的应用。
人工气候箱中培养感病大豆品种南农1138-2，于第一对真叶展开时接种载体psmv:yfp质粒，先用移液器吸取20ul的质粒滴到叶片上，质粒浓度约为200ng/ul，在pe手套上蘸取少量600目的金刚砂直接摩擦叶片造成微伤口以便质粒侵染。接种后，在接种叶上喷洒少量水并在人工气候箱中继续培养，直至大豆叶片出现典型的花叶症状。利用elisa和rt-pcr检测出现花叶的大豆叶片，证明大豆确为smv感染。在体视荧光显微镜下观察到大豆体内yfp的表达(绿色荧光)。至此，完成大豆花叶病毒侵染性克隆载体psmv：yfp的构建，能用于smv在大豆体内系统转运的研究。
本发明的优势与价值：
1、本发明首次将中国大豆花叶病毒sc3株系构建成侵染性克隆载体，并通过表型、rt-pcr、elisa和体视荧光显微镜对载体的侵染性进行了验证，证明该载体在感病大豆品种南农1138-2中具有侵染活性。该载体能够实现在dna水平上开展rna病毒smv的相关研究。
2、通过在侵染性克隆载体中引入外源基因yfp可以对smv在大豆体内的系统转运进行时空观察研究，达到smv在大豆体内运动踪迹可视化的目的。
3、利用构建的中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体成功观测了smv在大豆体内系统转运，证明了本发明使smv在大豆中运动踪迹可视化技术的可靠性。
附图说明
图1：以中国大豆花叶病毒sc3株系rna反转录获得的cdna为模板，利用pcr分段扩增获得的sc3基因组片段。
图2：psmv:sc3载体结构图。
图3：载体psmv:sc3菌液pcr结果。
图4：载体psmv:sc3双酶切检测结果。
图5：载体psmv:sc3的质粒图谱。
图6：载体psmv:yfp感染南农1138-2后的表型症状。
a:未接种smv的大豆叶片；b：接种野生型sc3后出现的症状；c:接种psmv:yfp后出现的症状。
图7：载体psmv:yfp感染南农1138-2后进行rt-pcr检测结果。
a:被sc3感染的南农1138-2作为阳性对照；b:未接种smv的南农1138-2作为阴性对照；c-e:psmv:yfp接种南农1138-2的3个样品。
图8：利用体视荧光显微镜在接种psmv:yfp后不同时间点观察yfp在大豆叶片中的表达情况。a:接种psmv:yfp后7天时yfp在大豆叶片中的表达情况；b:接种psmv:yfp后14天时yfp在大豆叶片中的表达情况；c:接种psmv:yfp后28天时yfp在大豆叶片中的表达情况；d:接种psmv:yfp后2个月时yfp在大豆叶片中的表达情况；e:接种psmv:yfp后3个月时yfp在大豆叶片中的表达情况；f:未接种psmv:yfp的大豆叶片，阴性对照。
图9：利用体视荧光显微镜观察psmv:yfp在大豆各组织中的表达情况。
a-e:接种psmv:yfp后,yfp在大豆根、茎、叶、花和种子中的表达情况；
f-j:未接种psmv:yfp的大豆根、茎、叶、花和种子，阴性对照。
图10：利用体视荧光显微镜观察yfp在大豆种子中的分布情况。
a:yfp在种皮中的表达；b:yfp在子叶中的表达；c:yfp在胚中的表达；d:未接种psmv:yfp的大豆种子，阴性对照。
图11：收获感染psmv:yfp的南农1138-2种子，并进行萌发处理后，在萌发出的下一代幼苗中yfp的表达情况。
a-c:yfp在萌发后的下一代幼苗中的表达；d-f:阴性对照。
图12：在接种psmv:yfp后5-10天时yfp在接种叶中的表达情况。
a:接种psmv:yfp后5天时yfp在接种叶中的表达情况；b:接种psmv:yfp后6天时yfp在接种叶中的表达情况；c:接种psmv:yfp后7天时yfp在接种叶中的表达情况；d:接种psmv:yfp后8天时yfp在接种叶中的表达情况；e:接种psmv:yfp后9天时yfp在接种叶中的表达情况；f:接种psmv:yfp后10天时yfp在接种叶中的表达情况。
图13：接种psmv:yfp后7-9天时yfp在接种叶与上位叶中的表达情况。
a1、a2、a3:接种psmv:yfp后7、8、9天时yfp在接种叶一中的表达情况。
b1、b2、b3:接种psmv:yfp后7、8、9天时yfp在接种叶二中的表达情况。
c1、c2、c3:接种psmv:yfp后7、8、9天时yfp在接种叶上位叶中的表达情况。
图14：v3期真叶接种mcs:yfpv5期时yfp分布情况。
a:接种示意图；b:接种叶(初真叶)；c:第一片复叶；d:第一片复叶叶柄；e:第二片复叶；f:第二片复叶叶柄；g:第三片复叶；h:第三片复叶叶柄；i:第四片复叶；j:第四片复叶叶柄；k:第五片复叶。
图15：v3期真叶接种mcs:yfpv6期时yfp分布情况。
a:接种示意图；b:接种叶(初真叶)；c:第一片复叶；d:第一片复叶叶柄；e:第二片复叶；f:第二片复叶叶柄；g:第三片复叶；h:第三片复叶叶柄；i:第四片复叶；j:第四片复叶叶柄；k:第五片复叶；l:第五片复叶叶柄；m:第六片复叶；n:第六片复叶叶柄.
图16：v3期于第三片复叶接种mcs:yfpv5期时yfp分布情况。
a:接种示意图；b:第五片复叶；c:第四片复叶；d:第四片复叶叶柄；e:第三片复叶(接种叶)；f:第三片复叶叶柄；g:第二片复叶；h:第二片复叶叶柄；i:第一片复叶；j:第一片复叶叶柄.
图17：v3期于第三片复叶接种mcs:yfpv6期时yfp分布情况。
a:接种示意图；b:第六片复叶；c:第五片复叶；d:第五片复叶叶柄；e:第四片复叶；f:第四片复叶叶柄；g:第三片复叶(接种叶)；h:第三片复叶叶柄；i:第二片复叶；j:第二片复叶叶柄；k:第一片复叶；l:第一片复叶叶柄.
具体实施方式(结合附图具体说明)
以下实例用于说明本发明，但不限制本发明的使用范围。
实施例1：构建大豆花叶病毒sc3株系侵染性克隆载体
1、sc3病毒基因组的分段扩增
在感病大豆品种南农1138-2上人工接种大豆花叶病毒sc3株系，发病后取大豆花叶病症状典型的叶片提取smv病毒rna，利用反转录试剂盒将rna反转录为cdna，设计smv病毒基因组分段扩增引物a-noti、b-kpni、c-ka、d-aa、e-ac，引物中引入酶切位点noti、kpni、agei、apai、clai(见图2)。以反转录获得的cdna为模板，利用高保真酶分段扩增smv基因组。扩增基因组所用引物见表1，扩增电泳结果见图1。
表1实验中所用引物
2、大豆花叶病毒sc3株系侵染性克隆载体的构建及检测
选择合适的内切酶noti、kpni、agei、apai、clai分别酶切smv病毒基因组扩增片段noti、kpni、ka、aa、ac(见图1)和载体骨架，并通过t4连接酶连接。采用此方法依次将smv基因组的片段与载体骨架pbr322相连，使smv病毒基因组完整的连接到载体骨架中，完成smv侵染性克隆载体的构建，载体命名为psmv:sc3。载体结构图见图2。对载体进行菌液pcr、质粒双酶切检测，选择载体中smv病毒基因组中的35s、p1和hc-pro以及cp的三段位置处设计引物35s-p1、p1-hcpro和smv-cp进行菌液pcr的检测，pcr结果中扩增条带大小与目的片段大小一致，载体初步构建成功，菌液pcr结果见图3，质粒双酶切检测结果见图4。载体全测序后发现载体中smv基因组出现个别碱基突变，故对其进行碱基修复以确保所构建载体的准确性。载体质粒图谱见图5，载体全测序结果见seqidno.2。
3、构建含yfp基因的侵染性克隆载体
分别利用引物mlui-noti和smai-kpni以载体psmv:sc3为模板进行pcr扩增，扩增后采用over-lap方法，利用mlui-noti的上游引物和smai-kpni的下游引物将两条pcr产物扩增为一条，在sc3病毒基因p1和hc-pro处通过酶切连接的方法替换原有片段，并引入多克隆位点smai和mlui，于多克隆位点处插入外源蛋白yfp基因序列，构建成含荧光蛋白yfp的侵染性克隆载体psmv:yfp，yfp基因序列见seqidno.1，所用引物yfp-f/r见表1。yfp基因扩增模板为质粒pearleygate101。
4、侵染性克隆载体psmv:yfp的接种验证
在人工气候箱中培养感病大豆品种南农1138-2，于第一对真叶展开时接种载体psmv:yfp质粒，先用移液器吸取20ul的质粒滴到叶片上，质粒浓度约为200ng/ul，在pe手套上蘸取少量600目的金刚砂直接摩擦叶片上的载体质粒，造成微伤口时质粒进入大豆叶片进行侵染。接种后，在接种叶上喷洒少量水，之后将接种大豆放回人工气候箱中继续培养，直至大豆叶片出现典型的花叶症状，见图6。对出现花叶的大豆叶片进行elisa和rt-pcr检测(表2、图7)，其与阳性对照一致，证实为smv病毒。接种psmv:yfp后不同时间点时在体视荧光显微镜下能够观察到大豆植株中有yfp的表达(绿色荧光)。结果见图8。
表2elisa96孔板于酶标仪中在od＝405nm下的吸光度
注：p：感病烟草回接南农1138-2的od405nm，取三次重复的平均值；
n：阴性对照，其od405nm三次重复的平均值＝0.159；
+：smv阳性；—：smv阴性
实施例2：侵染性克隆载体psmv:yfp在研究smv在大豆体内系统运转中的应用
1.psmv:yfp在大豆组织中的表达
在光培箱中种植感病大豆品种南农1138-2，待其第一对真叶展开时接种psmv:yfp，观察大豆不同生长时期其组织中yfp的表达情况(绿色荧光)，结果见图9。大豆的根、茎、叶、花和种子中均能观察到yfp的表达。
2.yfp在大豆种子中的分布情况
psmv:yfp接种南农1138-2，收获被感染的大豆种子，利用体视荧光显微镜观察大豆种子中yfp的表达情况(绿色荧光)，发现在种皮、子叶和胚中均有yfp表达，结果见图10。
3.psmv:yfp侵染南农1138-2后能够通过种子传递到下一代
psmv:yfp接种南农1138-2，收获被感染的大豆种子，对大豆种子进行萌发处理，在萌发出的下一代幼苗中有yfp的表达(绿色荧光)，结果见图11。
4.接种psmv:yfp后5-10天时yfp在接种叶中的表达情况
在光培箱中种植感病大豆品种南农1138-2，待其第一对真叶刚展开时接种psmv:yfp，在接种psmv:yfp后的5-10天连续观察接种叶中的yfp(绿色荧光)，结果见图12。smv在侵染点附近复制并积累，然后沿着叶脉向外扩散，最终布满整个叶片。
5.psmv:yfp在接种叶与上位叶中的侵染速度不同
在光培箱中种植感病大豆品种南农1138-2，待其第一对真叶刚展开时接种psmv:yfp，在接种psmv:yfp后的7、8、9天连续观察接种叶和上位叶中的yfp(绿色荧光)，结果见图13。观察结果表明smv在接种叶中的复制速度明显低于上位叶(新生叶)中的复制速度。
6.在不同叶位侵染大豆时smv的运动情况不尽相同
在南农1138-2第三片复叶展开时(v3期)，真叶(vc)接种psmv:yfp。v5期发现接种叶、v3-v5叶、茎和叶柄基部中都能观察到yfp荧光，而在v1、v2叶片和叶柄中观察不到yfp荧光(图14)。在v6期时发现大豆整株各个部位均观察到yfp荧光(图15)。说明此时大豆植株已被smv系统感染。
当v3对叶展开时接种psmv:yfp，v5期时，v3叶及其上位叶、茎和叶柄基部均观察到yfp荧光，但第一片复叶(v1)与第二片复叶(v2)此时观察不到yfp荧光(图16)。v6期时大豆整株各个部位的叶、茎等均可观察到yfp荧光(图17)。说明此时大豆植株已被smv系统感染。
序列表
<110>南京农业大学
<120>一种中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用
<160>24
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>732
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tctagacccggggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtc60
gagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgat120
gccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccc180
tggcccaccctcgtgaccaccttcggctacggcctgcagtgcttcgcccgctaccccgac240
cacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgc300
accatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggc360
gacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatc420
ctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaag480
cagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtg540
cagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgccc600
gacaaccactacctgagctaccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgat660
cacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctg720
tacaagacgcgt732
<210>2
<211>14298
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
aaattaaaactactcataaagacaacaaacaattcagacgcaaacagaaattttcagaac60
tacatttcttcgagcaactataattccagtaatttgcagtttcacaagtctctcacagca120
acagtagatcaaatggcaacaatcatgattggaagtgtggcgattcctgtgccaaacact180
cgcatctcttgtgcatcgaacactgtgatgccaattcaagcggtccaaatggcaacacaa240
gtgccttctgctaaaggagtgttatacacactcaaaagagagggtaacacacaagtgcgc300
aagcatgaggaagcgctgcgcaaatttcaagaagcattcgaccaagatgctggcacccag360
cgaaggcttctggtgaacaagcatagttccatacaatccacaaagaagagtggcttaacc420
ctgcgtcgcataactttagagcaggctcaagcaaaagaagcggcaattgcaaggcagaag480
caagaagaggaagactttcttaatgggaagtatgaacagcaattctatgctggggtatcc540
actacaaagctcacaaagtttgaaggaagaagtgttggtttcaggacaaaatactggaga600
ccaactccaaagaagactaaagaaaagcgtgcaataccacaatgtagggaaccgacatat660
gtcttagaagaggttctttcttcagcctcaaagagtggcaagctagttgaatttatcaca720
gaaggtaaaggcaggaatgtcaaaatccgttatgtgcggaagcatggcgcaacattgccc780
aagttctctcttccgcatgaagaaggtaaatatgttcatcaggagcttcaatatgcacgc840
atatatgattttcttccttacatttgcatgtttgcaaagtataagagcataagtgcggat900
gatataacttatggagatagtggtttactgtttgatgagcgatcatctttaaccacaaat960
cacactaagttaccgtacttcgtcatcagagggagagaaaatgggaagctcgttaatgcc1020
tttgaagtggttgcaaacatagaggatgttcagcattactctcaaactcctgaagcccag1080
tttttccgtggttggaagaaagtgtttgataaaatgccgccacatgtggagaatcatgaa1140
tgcaccattgattttacaaatgaacaatgtggtgaattggcagcggcaattagccaatca1200
gtttttccagttaagaagttatcatgtgggcaatgtcggcagcacatcaagaacctaagt1260
tgggaggagtataaacaattccttttagctcatatgggttgtcataagaccgaatgggag1320
aatatccagaaagttgatggtatgaagtacgtgaagaaagtgattgagacatcaactgca1380
gaaaacgcaagtctgcaaacatcaatggagattgtgcgcttaacacagaactataagagt1440
actcacatgctgcagatacaagacatcaataaggctctaatgaaaggtccatcagtgacg1500
caaagtgagctagagcaggcctccaaacagctacttgcaatgacacaatggtggaagaat1560
cacatggctttaactaatgaagatgcacttaaagtgttcaggaacaagcgatcttccaaa1620
gcactactcaatccaagcttactttgtgataaccagttagacaagaatggtaattttgtt1680
tggggagagcgtggcaggcattcaaagcgattctttgcaaattactttgaagaggtaatt1740
ccctctgaagggtacagcaagtatgtgattaggaagaatccaaatggacaaagggaatta1800
gcgattggatctctaattgtgccgctggattttgaacgcgctcggatggcatcacagggc1860
aagagcgtcacaagagagccgattacaatgtcatgtatatcaagacaggatggaaacttt1920
gtgtatccttgttgttgtgtcacgcatgatgatgggaaagctttctattctgagctcaag1980
agtcctacaaagcgccacttggttattggaacatctggcgatccaaaatatattgattta2040
ccagccactgatgcagacaggatgtacatagctaaagaaggatattgttacctaaatatc2100
ttcttggcaatgttggtcaatgtaaatgaagatgaagccaaagatttcacaaagatggta2160
agggatgttattgtaccaagactaggaaagtggccaacaatgttagatgtggcaacagct2220
gcatatatgctaacagtctttcaccctgaaactaggaatgctgagctcccgcgtattttg2280
gttgaccatgcgtgtcaaaccatgcacgtgatagactcttttggatctttaacagttggg2340
taccatgttcttaaagctggtacagttaaccaattgattcagtttgcttctaatgacctt2400
cagagtgagatgaaattttatagagttggtggggaagtgcaacaaaggatgaagtgtgaa2460
acagcactcataacaagcattttcaagcctaagagaatggttcaaatccttgagaatgac2520
ccatacattcttttgatgggcttagtttcaccttctattctgattcacatgtatcgtttg2580
aagcattttgagaaaggggtggagttgtggataagtaaagaacatagtgtggcaaagatt2640
ttcatcatattggagcaactcactaagagggtcgctgcaaatgacgtgttacttgagcaa2700
cttgaaatgatttcagaaacttctgagagattcatgagcattctagaggactgtcctcaa2760
gctccacagtcatacaagacggcaaaagatttgctgacaatgtacatagaaagaaaagca2820
tctaatagccaattagtggagaatggttttgtagatatgaatgataaactgtatatggca2880
tatgaaaaaatctattcagatcgcttgaagcaggaatggcgcgcattaagctggttggaa2940
aaattttctacaacatggcaattgaaaagatttgctccatatacggagaaatgtttgaca3000
aagaaagttgtagaagaaagcagcgcatcttcaggaaactttgcgagtgtgtgcttcatg3060
aatgcccagtcacacctaagaaatgtaagaaatacacttttccaaaaatgtgatcaggtt3120
tggactgcatcggtgcgagcctttgtgaggttcataatttcaacacttcacaggtgctat3180
agtgatatagtttatctggtgaacatctgcataatcttttcattgcttgtccaaatgact3240
agtgtgctgcagggcattgtcaatacagcaaggagggacaaagcactcttgaatggatgg3300
aaaaggaaagaagatgaagaggccgtgattcatttgtacgaaatgtgtgaaaagatggaa3360
ggtggacatccaagtattgagaaatttttggaccatgtcaagggagttagacccgatcta3420
ctccccatagcagtgagcatgacaggacaatcagaagatgtctccgcacaggccaaaaca3480
gcaactcaattgcaacttgagaaaattgtggcattcatggctttgttgaccatgtgtata3540
gataatgaaaggagtgatgcggtcttcaaagtattgagcaaattaaagacattcttcagc3600
acaatgggtgaggatgttaaagtgcagagtcttgatgagattcaaaacatagatgaagat3660
aagaagctcacaattgatttcgaccttgaaacaaataaggagtcttccagcgtttctttt3720
gatgttaaattcgaagcctggtggaatagacagttggaacagaatagagtaattccacac3780
tacaggtcgacaggtgagtttctggagttcacaagagaaacagcagccaaaattgcaaat3840
ttggtagcaacatcaagtcacacagaatttctgattagaggtgcagttggctcagggaaa3900
tcaacaggtttaccacatcacctctcaaagaagggcaaagttctgctgctggagccaact3960
agaccgttagcagagaatgtcagtaagcagttgagctttgaacctttctatcataatgta4020
acattgagaatgagagggttgagtaagtttggctcaagcaacatagttgtcatgacaagt4080
gggtttgcgtttcattactacgttaacaatccacaacagctatctgatttcgattttatc4140
ataatagatgagtgtcatgttcaagatagcccaacgattgcattcaactgtgcgcttaaa4200
gagtttgaattcagtggcaagcttataaaagtgtctgcaacgcctccaggaagagagtgc4260
gagttcacaacgcaacatccagtaaagttgaaagttgaagaccatttgtcttttcagaac4320
tttgtgcaagctcaaggtacaggatcaaatgctgatatgattcaacatgggaacaactta4380
cttgtatatgttgcaagctacaatgaagttgaccaactgtcacgattgttaactgaaaaa4440
cattacaaggtgacaaaggttgacgggagaacaatgcaaatgggaaatgtagagattgca4500
accacaggcacggaaggaaaaccacacttcatagttgcaacaaacatcatcgagaatgga4560
gtgactcttgatattgattgcgtaattgattttgggcttaaagtggtggctactcttgat4620
acagataaccggtgtgtgcgttacaacaaacaatcagtttcttatggagagcgaattcaa4680
agacttggcagagttggtcgttgtaaacctggatttgcgcttaggattggacacacggga4740
aagggaattgaggaagttcccgagttcatagctacagaggcggcttttctatcctttgct4800
tatgggttgccagttacaacacaaagtgtctcgaccaatatactgtcccgttgcacagtg4860
aagcaagctcgagtagctttgaattttgagctaactccatttttcaccactaacttcata4920
aagtatgatggtagcatgcacccagaaattcacagactgctcaagtcatacaaactgagg4980
gagtctgagatgttgctgactaagttagccataccatatcagtttgttgggcagtggata5040
acagtcaaggaatacgaacgtcaaggtgttcaccttaattgtccagagaaagtgaaaata5100
cctttctatgtgcatgggataccagataagttgtatgagatgttgtgggacacagtttgt5160
aaatacaagaatgatgccgggttcggctcaattaagagtgtgaacgcaacgaagattagc5220
tacactctaagcactgatccaacagcaattcctcgtacacttgcaatactggaccatttg5280
ttgagtgaggagatgaccaagaagagtcactttgacacaattggttctgctgtcactggg5340
tattccttttcccttgcaggcatagctgatggatttaggaagaggtacttgaaggactac5400
acacagcataatatagccgtcttacaacaggccaaagcacagctgctagaatttgactgc5460
aataaagttgacatcaacaacctgcacaatgttgagggtataggcattttaaatgcagtt5520
caactacagagcaaacatgaggtgagcaaatttttgcagctcaaaggaaagtgggatgga5580
aagaaattcatgaatgatgctgttgtggctatcttcactttagtgggtggcggttggatg5640
ttatgggattacttcacaagagttatacgtgagccagtatcaactcaaggaaagaagagg5700
cagatacaaaaactcaaatttagggatgcctttgatagaaaagtaggccgtgaggtgtat5760
gcagatgactacaccatggagcacacctttggggaggcctacaccaagaaaggaaagcag5820
aaaggtagcactcgcacaaaagggatgggtcgcaagtccagaaatttcatacacttgtat5880
ggagttgagccagagaattacagcatgatcagatttgttgacccgctaactggacacacg5940
atggatgaacaccccagagttgatatcagaatggtgcaacaagagtttgaggagataagg6000
aaagacatgattggagagggtgaactggatcggcaaagagtctaccacaatcctggtcta6060
caggcttatttcattgggaaaaatacagaggaagcactcaaggttgatctcacaccacac6120
agacccacactactttgccaaaatagtaatgctatagcaggtttccctgagagggaggat6180
gaattgcgtcagacaggattgccacaagtagtttctaagtcagatgtcccacgtgccaaa6240
gaaagggttgaaatggaaagcaaatctgtctacaaaggacttagagattatagtggcatt6300
tccacactaatatgccaacttacaaattcatcagatgggcataaagaaacaatgtttggg6360
gttggctatggttctttcattatcacaaatggacacttgttcagaaggaacaatgggatg6420
cttacagttaagacatggcatggcgagtttgtgatacacaacaccacacaactcaagata6480
cattttattcaagggaaggatgtgattctgattcgcatgccaaaggattttcctccattt6540
ggaaaacgcaacctctttagacaaccaaagcgtgaggaacgggtttgtatggttggtaca6600
aatttccaagagaagagtttgcgtgcaacagtctcagaatcttctatgatattgcctgag6660
gggaagggctctttctggatacattggatcacaacccaggatggtttttgtgggttgcct6720
cttgtttctgttaatgatgggcacattgttggaatacatggattaacatccaatgattca6780
gaaaagaacttctttgtcccgctcactgatgggtttgagaaagaatatctagagaatgct6840
gacaacttgtcatgggataagcattggttttgggaaccaagcaagatagcatggggctct6900
ttgaacttagttgaggaacaaccaaaagaggagttcaaaatatcaaagcttgtgtcagat6960
atttttggaagtacagtgacagtacaagggaagaaggaaagatgggttttggatgcaatg7020
gaaggcaacctagtggcttgtgggcaggcagacagtgcattggtgacgaagcacgttgtt7080
aaaggaaaatgcccttattttgcacaatatctttcagtgaatcaagaggcaaagtccttc7140
tttgaaccacttatgggtgcgtatcaaccaagtcggttaaacaaagatgcattcaaacga7200
gacttcttcaaatacaacaaaccagttgttttaaatgaagttgattttcaatcttttgag7260
aaggcagtggctggagtgaaacttatgatgatggaatttgatttcaaggagtgtgtgtat7320
gtgactgatcctgatgaaatatacgactccttgaatatgaaagctgcagttggtgcacaa7380
tacaaagggaagaagcaagattatttctctggaatggacagtttcgacaaggaacgcttg7440
ctctatctcagttgtgaaaggttattttatggggaaaaaggagtgtggaatggatccttg7500
aaagcagagttgaggccaattgaaaaagtgcaagcaaacaaaacaaggacattcacagca7560
gcaccaattgatacattacttggagcaaaggtttgtgttgatgatttcaacaatcaattt7620
tacagtctcaatcttatatgcccatggacagttgggatgaccaagttttatagaggttgg7680
gacaagttgatgagaagtttacctgatggatgggtgtattgtcatgcagatggctcacag7740
tttgatagttccttgacacccttactactgaatgcagttctggatgttaggagctttttc7800
atggaagattggtgggttggacgagaaatgcttgaaaatctctatgctgagatagtttac7860
acaccaattttagcacctgatggtacaatttttaagaagttcagaggaaacaacagtggg7920
caaccatctacagttgtggacaacaccttgatggtggtcattgctatgtactattcttgt7980
tgtaagcaagggtggtcagaggaggacattcaggaaagattagtgtttttcgccaatggt8040
gatgacatcattctggcagttggtgagaaggacacatggctgtacgacactctcagcact8100
tcgttcgctgaacttggtctcaattacaactttgaggaacggacaaagaaaagggaggaa8160
ttgtggtttatgtcacatcaagccatgttagttgatggaatctatattccaaaacttgaa8220
cctgagagaattgtctctatcctagaatgggacaggagcaaagagcttatgcatcgcact8280
gaggcgatatgtgcagcaatgattgaggcatggggatacactgaattgctgcaagagatc8340
cgcaaattttatttatggctcctaaacaaggatgaatttaaggagctcgcttcgtctgga8400
aaagcaccatatattgcagagacagctttgagaaagctgtacacagatatcaatgctcaa8460
acaagtgagctacaaagatatcttgaagtgctggatttcaatcatgctgatgactgttgt8520
gaatcagtttccttacaatcaggcaaggagaaagaaggagacatggatgcaggtaaggat8580
ccaaagaagagcaccagcagtagcaaaggagctggtacgagcagcaaagatgtaaatgtt8640
ggatcaaaaggaaaggtggttccgcgtttgcagaagattacaagaaagatgaatcttccg8700
atggttgaagggaagatcatccttagcttggaccacttgcttgagtataaacctaatcag8760
gttgatttattcaacactcgagcaacaagaacacagtttgaagcgtggtacaatgcagtt8820
aaagatgaatatgagcttgatgatgagcagatgggtgtggtcatgaatggtttcatggtt8880
tggtgtattgacaatggcacatctccagatgccaatggcgtgtgggtgatgatggatgga8940
gaggaacaaattgaatatccgttgaagcccattgtcgaaaatgcaaaaccaactttgagg9000
caaatcatgcatcatttttcagatgcagcagaagcttacattgagatgaggaattctgaa9060
agtccgtatatgcctagatatggactactgaggaatttgagagatagagagctagcccgc9120
tatgcttttgacttctatgaggtcacttctaaaacaccaaacagggcaagggaagcaata9180
gcgcaaatgaaggctgcagctctctcgggagttaacaacaagttgtttggacttgatgga9240
aatatctcaaccaactccgaaaatactgaaaggcacactgcaagggatgtgaatcaaaac9300
atgcacactcttctgggcatgggcccacagcagtaaaggtcaagtaaattggccacagtt9360
atcatttcgggtcgctttatagtttactataatatagtagttgcactttctttgagtata9420
gtgtgattgcatcaccaaatagtactcttgtttagtgtggttttaaccacctcagtgtgt9480
tttatattatagtttatgaatggcagggagaaccattgtgttactggagccctttgaaga9540
gtgattttatcatgtttagtggccgaggtacggcaatgtttgttgtcctaaaaaaaaaaa9600
aaaaaaaaaaaatcgatagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtt9660
tcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaatt9720
acgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggttttta9780
tgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaa9840
actaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattcttgaaga9900
cgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttct9960
tagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttc10020
taaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataa10080
tattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattccctttttt10140
gcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgct10200
gaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatc10260
cttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgcta10320
tgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacac10380
tattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggc10440
atgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaac10500
ttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggg10560
gatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgac10620
gagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggc10680
gaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagtt10740
gcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctgga10800
gccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcc10860
cgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacag10920
atcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactca10980
tatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatc11040
ctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtca11100
gaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgc11160
tgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagcta11220
ccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtcctt11280
ctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctc11340
gctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg11400
ttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcg11460
tgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgag11520
ctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggc11580
agggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttat11640
agtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggg11700
gggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgc11760
tggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtatt11820
accgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtca11880
gtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggt11940
atttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagc12000
cagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaa12060
cacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctg12120
tgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcga12180
ggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgtt12240
catccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagc12300
gggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggat12360
ttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggtta12420
ctgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatgga12480
tgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatg12540
taggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgc12600
agggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatg12660
ttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcg12720
gtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgaca12780
ggagcacgatcatgcgcacccgtggccaggacccaacgctgcccgagatgcgccgcgtgc12840
ggctgctggagatggcggacgcgatggatatgttctgccaagggttggtttgcgcattca12900
cagttctccgcaagaattgattggctccaattcttggagtggtgaatccgttagcgaggt12960
gccgccggcttccattcaggtcgaggtggcccggctccatgcaccgcgacgcaacgcggg13020
gaggcagacaaggtatagggcggcgcctacaatccatgccaacccgttccatgtgctcgc13080
cgaggcggcataaatcgccgtgacgatcagcggtccaatgatcgaagttaggctggtaag13140
agccgcgagcgatccttgaagctgtccctgatggtcgtcatctacctgcctggacagcat13200
ggcctgcaacgcgggcatcccgatgccgccggaagcgagaagaatcataatggggaaggc13260
catccagcctcgcgtcgcgaacgccagcaagacgtagcccagcgcgtcggccgccatgcc13320
ggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttg13380
agcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctcca13440
gcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttg13500
catgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaa13560
ggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagcggccgcctactccaagaa13620
tatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaat13680
atccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagt13740
ggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttga13800
agatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtgga13860
aaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatactccaaaaat13920
atcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaata13980
tccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtg14040
gaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaa14100
gatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaa14160
aaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgac14220
gtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagt14280
tcatttcatttggagagg14298
<210>3
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tcgagcggccgcctactccaagaatatcaa30
<210>4
<211>40
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
tttatgagtagttttaatttcctctccaaatgaaatgaac40
<210>5
<211>40
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
gttcatttcatttggagaggaaattaaaactactcataaa40
<210>6
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
catggtacccaactgtcaaggatcc25
<210>7
<211>26
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
ttgggtaccatgttcttaaagctggt26
<210>8
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
cacaccggttatctgtatcaagagc25
<210>9
<211>27
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
ataaccggtgtgtgcgttacaacaaac27
<210>10
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
tgtgggcccatgcccaaaagagaat25
<210>11
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>11
catgggcccacagcagtaaaggctaggt28
<210>12
<211>31
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>12
gctatcgattttttttttttttttttttttt31
<210>13
<211>31
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>13
tcccccggggtgagcaagggcgaggagctgt31
<210>14
<211>29
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>14
cgacgcgtcttgtacagctcgtccatgcc29
<210>15
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>15
ataagtgcggcgacgatagt20
<210>16
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>16
tcgccacacttccaatcatg20
<210>17
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>17
caggagcttcaatatgcac19
<210>18
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>18
tgtatctgcagcatgtgag19
<210>19
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>19
atgctcagacaagtgagct19
<210>20
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>20
ctccctgccattcataaac19
<210>21
<211>50
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>21
tcgagcggccgcctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagacc50
<210>22
<211>50
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>22
tcccccgggggaaaaacgcgttttcctctccaaatgaaatgaacttcctt50
<210>23
<211>50
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>23
aaaaggcctttttcccccgggggaaaattaaaactactcataaagacaac50
<210>24
<211>50
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>24
catggtacccaactgtcaaggatccaaaagagtcaatcacatgcatggtt50