本发明涉及的是一种医疗药物制备领域的技术，具体是一种降血糖的低极性罗汉果皂苷群及其制备方法。
背景技术：
罗汉果为葫芦科植物罗汉果[siraitiagrosvenorii(swingle)c.jefferyexluetz.y.zhang]的干燥成熟果实，其皂苷提取物具有显著降低糖尿病模型大鼠、小鼠血糖的作用。鲜罗汉果皂苷提取物对正常小鼠餐后血糖生成有明显的抑制作用。
但最新研究表明，罗汉果三萜皂苷经糖尿病人源肠道菌代谢发生脱糖反应，代谢成赛门苷ⅰ、罗汉果苷ⅳe、罗汉果苷ⅱ、罗汉果苷ⅰa1和罗汉果苷ⅰe1等产物，以低于4个糖基的低极性三萜皂苷类成分为主。罗汉果苷v在糖尿病大鼠体内亦代谢产生1-3个糖基的低极性三萜皂苷类成分。因此，对1-3个糖基的低极性三萜皂苷类成分进行制备及活性研究具有重要意义。然而，含1～3个糖基的皂苷在罗汉果药材中含量极低，仅约为罗汉果苷v含量的8％，难以规模制备。
技术实现要素：
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种降血糖的低极性罗汉果皂苷群及其制备方法，针对罗汉果降糖的有效部位—罗汉果低极性皂苷群，采用酸水解方法定向制备低极性罗汉果皂苷，得到的有效部位有明显降低ii型糖尿病血糖的效果。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种低极性罗汉果皂苷群的工业制备方法，首先以罗汉果酸水解得到皂苷粗提物，然后采用大孔树脂和聚酰胺综合吸附进一步纯化得到低极性罗汉果皂苷群。
所述的酸水解，以干燥成熟罗汉果为原料，经浓缩得到干浸膏后通过硫酸和/或盐酸水解制备皂苷粗提物。
所述的干浸膏，通过选取罗汉果经破碎后加入乙醇，经加热回流后过滤浓缩得到。
所述的通过硫酸和/或盐酸水解是指：将干浸膏稀释后加入硫酸和/或盐酸并加热孵育，然后将水解上清通过有机试剂萃取后浓缩得到。
所述的有机试剂包括乙酸乙酯和正丁醇。
所述的综合吸附是指：取ab-8大孔吸附树脂和聚酰胺用乙醇浸泡后，装柱，用蒸馏水洗至无醇味，再经酸碱冲洗后用蒸馏水冲洗至中性；然后经水溶解后取上清溶液，上样于预处理好的大孔树脂柱吸附后，分别用水和乙醇除去水溶性杂质后，再用乙醇进行5～27个柱体积洗脱，得到含低极性罗汉果皂苷群的乙醇洗脱液，浓缩、低温减压干燥，得干燥粉末；最后将干燥粉末以干法上样于预处理好的聚酰胺柱，用水除去水溶性杂质，再用乙醇进行5个柱体积洗脱，得到含罗汉果低极性皂苷群的乙醇洗脱液，将其浓缩，低温减压干燥，得低极性罗汉果皂苷群。
所述的低极性罗汉果皂苷群，采用uplc测定低极性罗汉果皂苷群的含量，计算总含量。uplc检测条件为：采用c18色谱柱，以水(a)-乙腈(b)梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～30min20％～50％b，30～32min50％～20％b，20％b32～33min，检测波长为205nm，流速为0.6ml/min。
本发明涉及上述方法制备得到的低极性罗汉果皂苷群，包含罗汉果苷ⅲ、罗汉果苷ⅲa1、罗汉果苷ⅱe、罗汉果苷ⅱa1和罗汉果苷ⅰa1的混合物，其中：罗汉果苷ⅲ、罗汉果苷ⅲa1、罗汉果苷ⅱe、罗汉果苷ⅱa1和罗汉果苷ⅰa1的含量分别为0.5％～5％、0.5％～5％、1％～20％、1％～20％、2％～40％，总含量大于60％。
本发明涉及上述低极性罗汉果皂苷群的应用，将其用于制备治疗ii型糖尿病的药物。
所述的应用，具体为制备显著降低ii型糖尿病血糖的药物。
技术效果
与现有技术相比，本发明针对罗汉果中低极性皂苷含量低，直接从药材中提取得率低，操作繁琐等问题，采用酸水解方法定向制备低极性罗汉果皂苷。该方法具有操作简便、得率高(超过5％)、纯度高(超过60％)、活性强(其降低2型糖尿病大鼠血糖的作用明显优于罗汉果提取物及罗汉果总苷)等优点。
具体实施方式
实施例1
本实施例包括以下步骤：
步骤1)罗汉果100g，破碎，按照原料重量(kg)比溶剂体积(l)为1:6向原料中加入50％乙醇，在80℃回流提取1次，每次提取0.5h，将提取液滤过，合并，浓缩，减压干燥，得干浸膏。
步骤2)向步骤1)中的干浸膏按照质量比1:3的比例加入水，充分搅拌，2500r/min离心，取上清液。加入体积比为1:0.5浓度为0.5m的盐酸水溶液，在70℃水浴中孵育0.5h，水解液离心，取上清。
步骤3)将步骤2)中的水解液上清用乙酸乙酯以体积比为1:1萃取2次，合并萃取液，将萃取液调节至中性，浓缩，减压干燥，得皂苷粗提物。
步骤4)将步骤3)得到的皂苷粗提物，以质量比为1:3的水溶解，取上清溶液，上样于预处理好的ab-8大孔吸附树脂柱，吸附2h后，分别用水、10％乙醇和50％乙醇进行5个柱体积洗脱，将50％乙醇洗脱液浓缩，低温减压干燥，得干燥粉末。
步骤5)将步骤4)中50％乙醇洗脱部位干燥粉末，干法上样于预处理好的聚酰胺柱，分别用水和10％乙醇进行5个柱体积洗脱，将10％乙醇洗脱液浓缩，低温干燥成粉末即得到低极性罗汉果皂苷群5.7g。
本实施例基于上述过程制备得到的低极性罗汉果皂苷群经uplc检测含量，其中罗汉果苷ⅲ、罗汉果苷ⅲa1、罗汉果苷ⅱe、罗汉果苷ⅱa1和罗汉果苷ⅰa1的质量百分比分别为5％、5％、19％、20％、14％，其总含量为63％。
所含成分化学结构如下：
本实施例技术效果评价方法如下：
i)参考文献[施红，等，诱导构建最类似人ii型糖尿病大鼠的造模方式，中国临床康复，2005，9(39)，69-71]构建肥胖型ii型糖尿病大鼠模型；
ii)对造模成功的ii型糖尿病大鼠灌胃给予分离纯化方法(3)中得到的低极性罗汉果皂苷群水溶液，两周后，尾静脉针刺取血，用血糖仪测定ii型糖尿病大鼠空腹血糖(fbg，mmol/l)值，本实施例制备得到的低极性罗汉果皂苷群可使ii型糖尿病大鼠空腹血糖值降低31％，其抗糖尿病作用显著优于罗汉果提取物(血糖值降低21％)及罗汉果总苷(血糖值降低25％)。
实施例2
本实施例包括以下步骤：
步骤1)罗汉果50g，破碎，按照原料重量(kg)比溶剂体积(l)为1:10向原料中加入50％乙醇，在90℃回流提取2次，每次提取1h，将提取液滤过，合并，浓缩，减压干燥，得干浸膏。
步骤2)向步骤1)中的干浸膏按照质量比1:5的比例加入水，充分搅拌，2500r/min离心，取上清液。加入体积比为1:1浓度为1m的盐酸水溶液，在75℃水浴中孵育2h，将水解液离心，取上清。
步骤3)将步骤2)中的水解液上清用正丁醇以体积比为1:1萃取2次，合并萃取液，将萃取液调节至中性，浓缩，减压干燥，得皂苷粗提物。
步骤4)将步骤3)得到的皂苷粗提物，以质量比为1:5的水溶解，取上清溶液，上样于预处理好的ab-8大孔吸附树脂柱，吸附4h后，分别用水、20％乙醇和60％乙醇进行15个柱体积洗脱，将60％乙醇洗脱液浓缩，低温减压干燥，得干燥粉末。
步骤5)将步骤4)中60％乙醇洗脱部位干燥粉末，干法上样于预处理好的聚酰胺柱，分别用水和20％乙醇进行5个柱体积洗脱，将20％乙醇洗脱液浓缩，低温干燥成粉末即得到低极性罗汉果皂苷群2.8g。
本实施例基于上述过程制备得到的低极性罗汉果皂苷群经uplc检测含量，其中罗汉果苷ⅲ、罗汉果苷ⅲa1、罗汉果苷ⅱe、罗汉果苷ⅱa1和罗汉果苷ⅰa1的含量分别为3％、3％、13％、13％、29％，其总含量为61％。
将本实施例得到的低极性罗汉果皂苷群采用与实施例1相同方法评测，可使ii型糖尿病大鼠空腹血糖值降低43％，其抗糖尿病作用显著(p<0.05)优于罗汉果提取物(血糖值降低21％)及罗汉果总苷(血糖值降低25％)。
实施例3
本实施例包括以下步骤：
步骤1)罗汉果80g，破碎，按照原料重量(kg)比溶剂体积(l)为1:12向原料中加入50％乙醇，在100℃回流提取2次，每次提取3h，将提取液滤过，合并，浓缩，减压干燥，得干浸膏。
步骤2)向步骤1)中的干浸膏按照质量比1:12的比例加入水，充分搅拌，2500r/min离心，取上清液。加入体积比为1:3浓度为0.5m的硫酸水溶液，在85℃水浴中孵育3h，将水解液离心，取上清。
步骤3)将步骤2)中的水解液上清用正丁醇以体积比为1:1萃取3次，合并萃取液，将萃取液调节至中性，浓缩，减压干燥，得皂苷粗提物。
步骤4)将步骤3)得到的皂苷粗提物，以质量比为1:5的水溶解，取上清溶液，上样于预处理好的ab-8大孔吸附树脂柱，吸附2.5h后，分别用水、30％乙醇和60％乙醇进行20个柱体积洗脱，将60％乙醇洗脱液浓缩，低温减压干燥，得干燥粉末。
步骤5)将步骤4)中60％乙醇洗脱部位干燥粉末，干法上样于预处理好的聚酰胺柱，分别用水和15％乙醇进行5个柱体积洗脱，将15％乙醇洗脱液浓缩，低温干燥成粉末即得到低极性罗汉果皂苷群4.5g。
本实施例基于上述过程制备得到的低极性罗汉果皂苷群经uplc检测含量，其中罗汉果苷ⅲ、罗汉果苷ⅲa1、罗汉果苷ⅱe、罗汉果苷ⅱa1和罗汉果苷ⅰa1的质量百分比分别为4％、5％、14％、14％、22.5％，其总含量为59.5％。
将本实施例得到的低极性罗汉果皂苷群采用与实施例1相同方法评测，可使ii型糖尿病大鼠空腹血糖值降低37％，其抗糖尿病作用显著优于罗汉果提取物(血糖值降低21％)及罗汉果总苷(血糖值降低25％)。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。