C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体和C4′-氟代尿苷修饰RNA的制备方法与流程

本发明涉及寡聚核苷酸的化学合成领域，具体涉及c4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体以及c4′-氟代尿苷定点修饰rna的制备方法。

背景技术：

氟代修饰的rna在生物医学领域有广泛的应用前景[org.biomol.chem.,2017,15,9552–9565]。c2′-氟代修饰的rna成功应用于核酸适配体、小干扰rna等，可以增强稳定性，提高效力[nature,2011,478,404-408]。此外，c4′-氟修饰核苷类似物nucleocidin是天然存在的五种含氟天然产物之一，具有良好的抗代谢活性，c4′-氟代修饰的核苷也因此引起了关注。guillerm[bioorg.med.chem.lett.1995,5,1455-1460]和verdine[org.lett.,2007,9,5007-5009]分别发展了各自的方法合成了c4′-氟代核苷。然而c4′-氟代核苷不稳定，将c4′-氟代核苷转化为c4′-氟亚磷酰胺单体并制备c4′-氟代修饰的rna一直没有成功，限制了对其生化性质的进一步探讨。

技术实现要素：

本发明的目的是针对c4′-氟代核苷不稳定的实际问题，提供一种通过分阶段、选择性保护核糖核苷中羟基的策略，即c4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体及其制备方法，以及利用c4′-氟代尿苷磷酰胺单体制备c4′-氟代尿苷定点修饰的rna的方法。

本发明技术方案

1、为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种c4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体，其中，该c4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体的化学结构式为：

式(1)所示的化合物可以称为2′-o-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-[(2-氰基乙氧基)-n,n′-二异丙基亚磷酰胺]-4′-c-氟-5′-o-二甲氧基三苯甲基尿苷。

其中，在式(1)中，“dmtr-”为二甲氧基三苯甲基，“n(ⁱpr)2-”为n,n-二异丙基胺基，“-tbdms”为叔丁基二甲基硅烷基。

2、本发明第二方面提供了一种c4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将4′-c-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与硝酸银、吡啶和四氢呋喃形成第一混合溶液；之后将所述第一混合溶液与叔丁基二甲基氯硅烷进行反应，将反应后得到的溶液旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷溶解后洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-o-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-c-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷。

(2)将步骤(1)得到的2′-o-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-c-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与4-二甲氨基吡啶、吡啶进行第二混合，形成第二混合溶液；再将所述第二混合溶液与乙酸酐进行反应；旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷溶解后洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-o-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-c-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷。

(3)将三氟乙酸与四正丁基氢氧化铵溶液混合调节ph后，加入步骤(2)得到的2′-o-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-c-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷、二氯甲烷进行第三混合，形成第三混合溶液；再将所述第三混合溶液与间氯过氧苯甲酸进行反应；然后将反应得到的有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-o-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-c-氟代尿苷。

(4)将步骤(3)得到的2′-o-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-c-氟代尿苷与氨/甲醇溶液进行反应；旋蒸除去溶剂，柱层析得到产物。

(5)将步骤(4)得到的产物与4-二甲氨基吡啶、吡啶以及4,4′-二甲氧基三苯甲基氯进行反应；旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷溶解后然后将有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-o-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-c-氟-5′-o-二甲氧基三苯甲基尿苷。

(6)将步骤(5)得到的2′-o-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-c-氟-5′-o-二甲氧基三苯甲基尿苷与二氯甲烷、n,n′-二异丙基乙胺以及2-甲基咪唑进行第四混合，形成第四混合溶液；再将所述第四混合溶液与(2-氰基乙氧基)-n,n′-二异丙基亚磷酰氯进行反应；旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷溶解后然后将有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-o-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-[(2-氰基乙氧基)-n,n′-二异丙基亚磷酰胺]-4′-c-氟-5′-o-二甲氧基三苯甲基尿苷，即本发明所述的c4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体。

优选地，在步骤(1)中，所述4′-c-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与所述硝酸银、所述吡啶、所述四氢呋喃、所述叔丁基二甲基氯硅烷用量的比为1mmol:3.5mmol:4ml:4ml:3.5mmol；以及，

所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为1.5-2小时，搅拌速度为250-500转/分钟。

优选地，在步骤(2)中，所述2′-o-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-c-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与所述4-二甲氨基吡啶、所述吡啶、所述乙酸酐用量的比为1mmol:0.3mmol:10ml:5mmol；以及，

所述乙酸酐以滴加的方式加入所述第二混合溶液中，所述乙酸酐的滴加速率为15滴/分钟；以及，

所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为0.5-1小时，搅拌速度为250-500转/分钟。

优选地，在步骤(3)中，所述三氟乙酸与所述四正丁基氢氧化铵溶液、所述2′-o-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-c-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷、所述二氯甲烷、所述间氯过氧苯甲酸的用量比为0.8ml:10ml:1mmol:10ml:5mmol；其中所述四正丁基氢氧化铵溶液的质量浓度为55％，所述间氯过氧苯甲酸的纯度为85％；

所述三氟乙酸以滴加的方式加入所述四正丁基氢氧化铵溶液中调ph为4；所述间氯过氧苯甲酸分三次加入第三混合溶液中，间隔时间为0.5小时；以及，

所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为40-46小时，搅拌速度为250-500转/分钟。

优选地，在步骤(4)中，所述2′-o-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-c-氟代尿苷与氨/甲醇溶液用量比为1mmol:8ml，其中氨/甲醇溶液的物质的量浓度为7mol/l；以及，

所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为3-4小时，搅拌速度为250-500转/分钟。

优选地，在步骤(5)中，所述产物与所述4-二甲氨基吡啶、所述吡啶以及4,4′-二甲氧基三苯甲基氯的用量比为1mmol:0.3mmol:8ml:1.3mmol；以及，

所述反应的条件包括：温度为40-50℃，时间为3-5小时，搅拌速度为250-500转/分钟。

优选地，在步骤(6)中，所述2′-o-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-c-氟-5′-o-二甲氧基三苯甲基尿苷与所述二氯甲烷、所述n,n′-二异丙基乙胺、所述2-甲基咪唑、所述(2-氰基乙氧基)-n,n′-二异丙基亚磷酰氯的用量比为1mmol:20ml:10mmol:4mmol:5mmol；以及，

所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为15分钟，搅拌速度为250-500转/分钟。

3、本发明第三方面提供了一种c4′-氟代尿苷定点修饰rna的制备方法，其中，该制备方法中的合成试剂包括以上所述的制备方法制备得到的c4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体。

优选地，该制备方法在abi394dna/rna合成仪上进行以得到寡聚核苷酸，其中：

优选地，所述合成试剂还包括叔丁基二甲基氯硅烷保护2′-oh的ac-rc、bz-ra、ac-rg和ru；

优选地，三氯乙酸/二氯甲烷用于脱保护；

优选地，capa试剂为乙酸酐、吡啶和四氢呋喃的组合物，且所述乙酸酐、所述吡啶和所述四氢呋喃的体积比为10体积％：(5-15)体积％：(75-85)体积％；

优选地，capb试剂为n-甲基咪唑和四氢呋喃的组合物，且所述n-甲基咪唑和所述四氢呋喃的体积比为10体积％：90体积％；

优选地，活化剂为乙硫基四唑和乙腈的组合物；

优选地，氧化剂为碘、水、吡啶和四氢呋喃的组合物，且所述碘、所述水、所述吡啶和所述四氢呋喃的用量比为0.02m：(1-2)体积％：(10-30)体积％：(75-85)体积％；以及所述，

优选地，所述c4’-氟代rna亚磷酰胺单体的偶合时间为0.5-1小时；

优选地，将上述固相合成得到的寡聚核苷酸用0.75ml浓度为28重量％的氨水混合0.25ml无水乙醇在55℃下处理10-12h，然后，取出上清液离心浓缩后，加入0.5ml三乙胺三氢氟酸盐处理20-24h，经c18柱脱盐处理后，离心浓缩，采用20重量％的变性聚丙烯凝胶电泳纯化。

本发明的优点和有益效果是：(1)通过分阶段、选择性保护尿苷中羟基的策略，成功制备了c4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体；(2)c4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体成功应用于制备c4′-氟代尿苷定点修饰的rna。本发明所述的c4′-氟代尿苷定点修饰的rna的制备方法，在研究c4′-氟代rna的生化性质等方面有着广泛的应用前景。

附图说明：

图1为uplc-ms分析c4′-氟代尿嘧啶核苷修饰rna分子(7)的纯度。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

4′-c-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷(自制)；二氯甲烷(天津市河东区广达服务部，货号1220)；na2co3·10h2o晶体(天津市河东区广达服务部，货号2093)；氯化钠(天津市化学试剂供销公司，货号017)；乙酸酐(天津市化学试剂供销公司，货号282)；吡啶[阿拉丁试剂(上海)有限公司，货号p111511]；四氢呋喃(北京华威锐科化工有限公司,货号hwmt818767)；甲醇(北京百灵威科技有限公司，货号980290-500ml)、55％(w/w)四正丁基氢氧化铵水溶液(北京百灵威科技有限公司，货号16198-50g)；氨水/甲醇(2n)溶液(alfa，货号h27080)；氨水/甲醇(7n)溶液(alfa公司，货号h30382)；2-甲基咪唑[梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，货号m0508]、n,n-二异丙基乙胺[梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，货号d1599]；叔丁基二甲基氯硅烷[梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，货号b0995]；硝酸银(安耐吉，货号a01w5100190250)、间氯过氧苯甲酸(安耐吉，货号a01w520002-100g)、2-氰乙基n,n-二异丙基氯亚磷酰胺(安耐吉，货号a07m901005-01)；4-二甲氨基吡啶(adamas，货号14766b)、4,4”-双甲氧基三苯甲基氯(adamas，货号55311c)；三氟乙酸(acros，货号293810250)等原料为市售品。

实施例1

c4′-氟代尿嘧啶亚磷酰胺单体的合成。

其合成步骤如下：

步骤一、化合物(3)的制备：在氩气保护下，将式(2)对应单体(371.9mg,1mmol,1.0eq.)溶于4ml干燥的四氢呋喃，加入4ml干燥的吡啶和527.5mg(3.5mmol,3.5eq.)叔丁基二甲基氯硅烷，594.5mg(3.5mmol,3.5eq.)硝酸银。室温下搅拌1.5小时。旋干溶剂，加入20ml二氯甲烷稀释，依次用20ml饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液清洗，有机层用无水硫酸镁干燥，用乙酸乙酯/石油醚(梯度，v/v，1:4～1:2～1:1)柱层析，得白色固体式(3)对应单体338.5mg(0.7mmol,两步产率70重量％)。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm)11.52(s,1h,nh),7.69(d,j＝7.87hz,1h,h-6,＝ch),5.95(s,1h,h-1’),5.71(d,j＝7.55hz,1h,h-5),5.34(d,j＝8.52hz,1h,3’-oh),4.42(m,h-3’),4.34(m,h-2’),3.56(m,2h,h-5’,h-5”),0.84(s,9h,^tbu),0.05(s,3h,-ch3),0.04(s,3h,-ch3)；¹³cnmr(100.6mhz,cdcl3)δ(ppm)163.23,149.52,142.57,114.18(d,jh-f＝229.69hz,1c,c-4’),103.31,97.49,73.22,71.22(d,jc-f＝23.24hz,1c,c-3’),25.56,17.99,2.29(d,jc-f＝33.48hz,1c,c-5’),-4.87,-5.22；¹⁹fnmr(376mhz,dmso-d6)δ(ppm)-110.27.m/z:calcdforc15h24fin2o5si[m+h]⁺,487.0561；found,487.0572.

步骤二、化合物(4)的制备：称取48.5mg(0.1mmol,1.0eq.)式(3)所示的单体溶于1ml干燥的吡啶。在氩气保护下，加入4mg(0.03mmol,0.3eq.)4-二甲氨基吡啶。在冰浴条件(0℃)及搅拌下，将0.05ml(0.5mmol，5.0eq.)乙酸酐缓慢滴加至反应体系，升至室温搅拌1小时。旋干溶剂，加入5ml二氯甲烷稀释，依次用5ml饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液清洗，有机层用无水硫酸镁干燥，旋干溶剂，用乙酸乙酯/石油醚(梯度，v/v，1:8～1:4～1:2)柱层析，得白色固体式(4)对应单体52.1mg(0.098mmol,产率98重量％)。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm)9.87(s,1h,nh),7.30(d,j＝7.96hz,1h,h-6,＝ch),5.82(m,2h,h-1’andh-5),5.39(d,j＝6.70hz,jh-f＝14.48hz,1h,h-3’),4.67(m,h-2’),3.58(dd,1h,j＝7.95hz),jh-f＝11.16hz,h-5”),2.17(s,3h,-ch3),0.86(s,9h,^tbu),0.01(s,3h,-ch3),0.003(s,3h,-ch3)；¹³cnmr(100.6mhz,dmso-d6)δ(ppm)169.8,163.1,149.8,141.3,113.6(d,1c,jc-f＝237.38hz,c-4’),103.5,94.67,72.3,71.6(d,jc-f＝19.59hz,1c,c-3’),25.36,20.53,17.78,3.26(d,jc-f＝35.30hz,1c,c-5’),-4.99,-5.31.m/z:calcdforc17h26fin2o6si[m+na]⁺,529.0667；found,529.0639.

步骤三、化合物(5)的制备：在反应容器中，滴加三氟乙酸到496μl(1.86mmol,20eq.)四正丁基氢氧化铵(体积浓度55％)中调ph至4，将49.3mg(0.093mmol,1.0eq.)式(4)对应的单体溶于2ml二氯甲烷，加入至反应体系，分三次加入80mg(0.46mmol,5.0eq.)间氯过氧苯甲酸(间隔30min)，常温搅拌46h。加入2ml饱和硫代硫酸钠水溶液淬灭反应，依次用5ml饱和碳酸氢钠水溶液溶液、5ml饱和氯化钠水溶液清洗，用丙酮/乙酸乙酯/石油醚(v/v/v，1:1:5)柱层析，得白色固体式(5)所对应的单体29.5mg(0.070mmol,产率75.8重量％)。

¹hnmr(400mhz,dmso)δ(ppm)11.54(s,1h,-nh),7.80(d,j＝8.12hz,1h,h-6,＝ch),6.01(d,j＝4.33hz1h,h-1’),5.75(m,1h,h-5),5.33(dd,j＝5.33hz,jh-f＝13.37hz1h,h-3’),4.58(d,j＝4.41hz,j＝6.23hz,1h,h-2’),3.61(m,2h,h-5’,h-5”),2.11(s,3h,ome),0.81(s,9h,^tbu),-0.02(s,3h,-ch3),-0.01(s,3h,-ch3)；¹³cnmr(100.6mhz,dmso-d6)δ(ppm)169.72,163.33,150.78,141.15,116.40(d,1c,jh-f＝235.53hz,c-4’),103.18,91.33,71.79,70.27(d,jc-f＝17.37hz,1c,c-3’),61.33(d,jc-f＝39.38hz,1c,c-5’),25.77,20.88,17.99,-4.85,-5.05.m/z:calcdforc17h27fin2o7si[m+h]⁺,419.1650；found,419.1641.

步骤四、化合物(6)的制备：在氩气保护下，将144.3mg(0.34mmol,1.0eq.)式(5)所对应的单体加入到3ml(7n)的氨/甲醇中，常温搅拌3h。旋干除去溶剂，用乙酸乙酯/石油醚(梯度，v/v，1:4～1:2～1:1)柱层析，将得到rf＝0.34(丙酮/乙酸乙酯/石油醚＝1:1:4)的组分溶于3ml无水吡啶中，加入11mg(0.09mmol,0.3eq.)4-二甲氨基吡啶、132.1mg(0.4mmol，1.3eq.)二甲氧基三苯甲基，40℃搅拌4小时，1ml甲醇淬灭反应，旋干溶剂，二氯甲烷溶解后饱和碳酸氢钠水溶液清洗，用乙酸乙酯/石油醚(梯度，v/v，1:8～1:4～1:2～1:1，加入0.5体积％的三乙胺)柱层析，得式(6)对应的单体140.5mg(0.204mmol，产率68重量％)。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm)11.56(s,1h,-nh),7.82(d,j＝8.06hz,1h,h-6,＝ch),7.41-7.26(m,9h,dmtr-arh),6.92(s,2h,dmtr-arh),6.90(s,2h,dmtr-arh),6.00(s,1h,h-1’),5.46(d,j＝8.01hz,1h,h-5),5.14(d,j＝9.07hz,1h,-oh),4.61(m,1h,h-3’),4.56(d,j＝6.08hz,1h,h-2’),3.74(s,6h,-ome),3.30(m,1h,h-5’),3.22(m,1h,h-5”),0.88(s,9h,^tbu),0.11(s,3h,-ch3),0.10(s,3h,-ch3)；¹³cnmr(100.6mhz,dmso-d6)δ(ppm)162.94,158.21,150.06,144.23,141.29,134.80,134.68,129.75,127.89,127.63,126.84,116.67(d,jh-f＝229.69hz,1c,c-4’),113.24,102.05,92.79,86.10,72.92,69.40(d,jc-f＝20.57hz,1c,c-3’),63.42,54.97,29.98,25.55,-4.87,-5.22。m/z:calcdforc36h43fn2nao8si[m+na]⁺,701.2670；found,701.2670.

步骤五、化合物(1)的制备：称取2.16g(3.16mmol,1.0eq.)式(6)所对应的单体，在氩气保护下溶于60ml二氯甲烷中。依次加入4.5ml(31.6mmol,10eq.)n,n’-二异丙基乙胺，1ml(12.64mmol,4eq.)2-甲基咪唑，2.4ml(15.8mmol,5eq.)(2-氰基乙氧基)-n,n’-二异丙基亚磷酰氯，常温下搅拌15分钟。反应结束后，在氩气保护下将体系减压蒸干，然后用少量二氯甲烷溶解，快速柱层析丙酮/乙酸乙酯/石油醚(v/v/v，1:1:5，+0.5体积％三乙胺)纯化得到浅黄色固体式(1)所对应的单体2.686g(3mmol，产率95重量％)。产物有2个异构体，比例为：2.25：1。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)7.81(d,j＝8.07hz,0.64h,h-6,＝ch),7.66(d,j＝8.12hz,0.26h,h-6,＝ch)7.26-7.10(m,9h,dmtr-arh),6.72(s,2h,dmtr-arh),6.70(s,2h,dmtr-arh),6.09(s,0.26h,h-1’),5.96(s,0.61h,h-1’)5.07(d,j＝8.01hz,1h,h-5),4.40(m,1h,h-3’),4.28(m,0.28h,h-2’),4.19(d,j＝4.80hz0.63h,h-2’),3.66(s,6h,-ome),3.46(m,4h),2.52(m,0.68h),2.37(m,1.3h),1.02(m,12h,4ch3),0.89(d,j＝6.60hz,2h)0.93(s,9h,^tbu),0.05-0.00(m,6h,-ch3)；³¹pnmr(162mhz,cd3cl)δ:152.2(s,0.27p),149.6(s,0.64p)。m/z:calcdforc45h61fn4o9psi[m+h]⁺,879.3929；found,879.3942.

实施例2

本实施例在于说明由实施1制备的c4′-氟代尿嘧啶核苷亚磷酰胺单体(1)进行rna固相合成rna序列(7)：5′-ccauxauagc。在序列(7)中，x为c4′-氟代尿嘧啶核苷。

在abi394dna/rna合成仪上通过常规程序和试剂进行1μmol寡聚核苷酸合成。合成试剂包括ac-rc,bz-ra,ac-rg,ru和实施例1制备的c4’-氟代尿嘧啶亚磷酰胺单体(1)；3重量％三氯乙酸/二氯甲烷用于脱保护；capa试剂：10体积％乙酸酐/10体积％吡啶/80体积％四氢呋喃(v/v/v)，capb试剂：10体积％n-甲基咪唑/90体积％四氢呋喃(v/v)；活化剂：0.25m乙硫基四唑/乙腈；氧化剂：0.02m碘/2体积％水/20体积％吡啶/78体积％四氢呋喃(v/v/v)。c4’-氟代尿嘧啶核苷亚磷酰胺单体的偶合时间是1小时。

将上述固相合成得到的rna分子用0.75ml(28重量％)氨水混合0.25ml无水乙醇在55℃下处理12h，然后，取出上清液离心浓缩后，加入0.5ml三乙胺三氢氟酸盐处理24h，经c18柱脱盐处理后，离心浓缩，采用20重量％的变性聚丙烯凝胶电泳纯化。得到纯的rna(7)经过了uplc-ms分析鉴定(图1)。

可见，实施例1制备的c4’-氟代尿嘧啶亚磷酰胺单体(1)可以用于常规的rna固相合成与纯化。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。