一种核苷类抗菌化合物的发酵制备方法与流程

本发明属于微生物
技术领域：
，具体涉及一种具有抗菌活性的核苷类化合物的发酵制备方法。
背景技术：
：微生物的代谢产物是抗生素的主要来源，核苷类抗生素是一类通常由微生物次级代谢产生的，在结构上含有修饰的核苷和核苷酸的分子的总称；放线菌是产生核苷类抗生素最主要的微生物种类之一。自链霉素发现以来，已从放线菌中发现了大量的抗生素。近年来，人们从普通链霉菌、极端环境放线菌、海洋放线菌和稀有放线菌中寻找新抗生素。如，庆大霉素、红霉素、万古霉素、利福平等已成功应用于临床；应用于农作物病虫害防治的抗生素有灭瘟素、抗霉菌素120、武夷菌素等；由放线菌代谢产物开发的嘌呤核苷类抗生素嘌呤霉素、嘧啶核苷类抗生素尼可霉素、宁南霉素、杀稻瘟菌素、米多霉素及谷氏菌素等，具有广泛的生物活性，包括抗细菌，抗真菌，抗线虫，抗肿瘤，抗病毒，免疫刺激和免疫抑制等活性。本实验室在进行微生物产生核苷类代谢产物的研究过程中，发现一株放线菌经发酵产生一种核苷类化合物，该化合物有很好的抗菌生物活性，尤其对植物病原真菌、植物病毒的抑制活性很强，还具有植物免疫刺激作用。我们将该核苷类化合物命名为阿丝苷酸。研究人员经过长期大量的研究工作，完成了该化合物的分离纯化、理化性质研究、结构鉴定；对该放线菌进行了菌种遗传改良，获得了阿丝苷酸高产菌株，并研究获得了高产菌株发酵生产阿丝苷酸的优化发酵工艺条件，从而完成了本发明。技术实现要素：本发明的目的：本发明的目的之一，是提供一种核苷类化合物，命名为阿丝苷酸；本发明的目的之二，是提供一种用于生产阿丝苷酸的新菌株；本发明的目的之三，是提供一种“批次液体培养基流加补料发酵工艺”，发酵生产阿丝苷酸；本发明的目的之四，是提供用于生产阿丝苷酸的培养基。更具体地说，本发明提供一种核苷类化合物(阿丝苷酸)及其发酵制备方法，包含以下步骤：从一株采自四川宜宾地区土壤的放线菌“诺尔斯氏链霉菌”(streptomycesnoursei)的发酵液中，经分离、鉴定获得一种核苷类化合物(阿丝苷酸)。将能够产生阿丝苷酸的放线菌“诺尔斯氏链霉菌”(streptomycesnoursei)及其遗传改良菌株，在一级液体培养基(例如,下文所述的培养基a)中培养，作为种子液；将培养好的种子液接种到第二级液体培养基(例如，下文所述的培养基b)中培养；第二级液体培养基接种第一级种子液后培养一段合适的时间，开始进行流加补料液(例如，下文所述的补料液c)的补料发酵培养。发酵结束后，从上述发酵培养液中收集阿丝苷酸，并进行分离纯化、结构鉴定。本发明的具体实施方案是，采用“诺尔斯氏链霉菌”(streptomycesnoursei)或其遗传改良菌株“诺尔斯氏链霉菌lsp-1”(streptomycesnourseilsp-1)，在液体培养基中进行二级发酵培养，在每级发酵阶段选用不同的培养基，例如下文所述的培养基a、b。在第二级发酵中，接种第一级种子液后，在适合的温度下培养一段时间，例如，在26℃—32℃发酵培养10—30小时后，选用合适的补料液,例如下文所述的补料液c，进行流加补料发酵培养。第二级液体培养流加补料(例如补料液c)的方式可以采用连续(匀速或非匀速)流加和/或间歇式流加方式，连续流加方式是优选的。所述的连续(匀速或非匀速)流加方式，是以一定的流加速率,如0.01—6.0l/h，(匀速或非匀速)将适合的补料液(例如补料液c)连续流加入第二级发酵罐中，直至停止发酵(下罐)前大约5-30小时。所述的间歇式流加方式，是以间隔一段时间加一次料的方式，间歇式将适合的补料液(例如补料液c)流加入第二级发酵罐中。间歇时间优选为每1-24小时补料1-12次，优选为间隔1-2小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.01％—2.5％，优选为0.05％—0.5％。本领域技术人员也可以根据需要，采用其他的适合时间间隔补料。发酵条件：温度26℃—32℃，ph：6-8发酵时间：2-4天发酵结束后，将发酵液经微滤去除菌体、不溶性蛋白及其它大分子物质，微滤的操作压力为0.1-0.8mpa,操作温度为1-50℃，滤出液占进料液体积20％-90％，透析水量占进料液体积的30％-90％，合并滤出液；将微滤滤出液再经纳滤浓缩，所得浓缩液用真空旋转蒸发仪55℃蒸干，获得褐色膏状粗品。粗品经过正相硅胶柱层析，洗脱剂采用氯仿：甲醇：水＝5：5：0.4，洗脱液用管碟法进行活性跟踪检测，收集活性部分；再采用c18反相硅胶柱层析继续分离纯化,用纯水为流动相，进行样品的洗脱，对洗脱液进行活性跟踪检测和收集，得到的活性样品进行高效液相色谱纯化制备(制备条件：色谱柱为sp-120-5-ods-bio4.6mmx150mm,流动相为甲醇：水＝3：7,流速：0.8ml/min,进样量10ul，检测器：spd-10a)，获得一种具有抑菌活性的白色粉末状单一化合物(阿丝苷酸)。通过对该单一化合物的紫外-可见光波段扫描分析、质谱分析、分子量测定、一维和二维核磁共振分析等，获得该单一化合物的化学结构为：1-尿嘧啶-4-丝氨酰氨基-1，4-二脱氧-β-d-吡喃葡萄糖醛酸，其结构具有典型的核苷类化合物的特性，属于丝氨酰氨尿嘧啶核苷，其分子量为374.1，分子式为：c13h18n4o9，其化学结构为：阿丝苷酸(1-尿嘧啶-4-丝氨酰氨基-1，4-二脱氧-β-d-吡喃葡萄糖醛酸,)采用本发明工艺，在第二级发酵时，通过流加补料液发酵，可以维持较好的碳氮比，提高发酵体系中细胞的浓度，有利于提高溶解氧的利用率，从而提高阿丝苷酸的产量。在优选的具体实施方案中，本发明还采用例如新菌株等技术方案来进一步提高阿丝苷酸的产量。在优选的本发明方法中，本发明特别提供一株用于生产阿丝苷酸的诺尔斯氏链霉菌遗传改良菌株“诺尔斯氏链霉菌lsp-1”(streptomycesnourseilsp-1)；其已于2018年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmccno.15164),地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明发酵生产所采用的培养基a、b及补料液c的具体组成质量百分比如下：培养基b：成分一般范围优选范围淀粉0.1％-5.0％0.3％-3.0％糊精0.1％-5.0％0.3％-2.0％蔗糖/糖蜜0.1％-4.0％0.3％-3.0％硫酸铵0.01％-2.0％0.1％-2.0％葡萄糖0.1％-10.0％0.5％-6.0％花生粉或花生粉水解液0.1％-10.0％0.5％-5.0％黄豆粉或黄豆粉水解液0.1％-10.0％0.5％-5.0％玉米粉0.1％-10.0％0.5％-5.0％酵母粉0.01％-4.0％0.1％-2.0％磷酸氢二钾0.01％-5.0％0.05％-1.0％硫酸镁0.01％-5.0％0.05％-1.0％氯化钠0.01％-5.0％0.05％-1.0％补料液c：成分一般范围优选范围蔗糖/糖蜜0.1％-4.0％0.3％-3.0％葡萄糖0.1％-10.0％0.5％-6.0％黄豆粉或黄豆粉水解液0.1％-10.0％0.5％-5.0％花生粉或花生粉水解液0.1％-10.0％0.5％-5.0％本发明优选实施方案的发酵工艺全过程为:将活化后的诺尔斯氏链霉菌lsp-1菌种接种于培养基a中,装于三角瓶内26℃—32℃摇瓶培养20—50小时后，以5％--30％的接种量接种于已加有灭菌培养基b的发酵罐中进行发酵生产。菌种接种于第二级发酵罐后于26℃—32℃，发酵培养10—30小时后，开始补料液c流加补料。补料液c流加补料方式有两种，一种是连续(匀速或非匀速)流加，一种是间歇式流加，连续流加方式是优选的。采用连续流加方式时，以0.01—6.0l/h的速度连续(匀速或非匀速)流加补料液c，直至停止发酵(下罐)前约5-30小时。采用间歇式流加方式时，间歇时间优选为每1-24小时补料1-12次，优选为间隔1-2小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.01％—2.5％，优选为0.05％—0.5％。发酵条件：温度26℃—32℃，ph：6-8发酵时间：2-4天发酵结束后，将发酵液经微滤去除菌体、不溶性蛋白及其它大分子物质，微滤的操作压力为0.1-0.8mpa,操作温度为1-50℃，滤出液占进料液体积20％-90％，透析水量占进料液体积的30％-90％，合并滤出液；将微滤滤出液再经纳滤浓缩，所得浓缩液用真空旋转蒸发仪55℃蒸干，获得褐色膏状粗品。粗品经过正相硅胶柱层析，洗脱剂采用氯仿：甲醇：水＝5：5：0.4，洗脱液用管碟法进行活性跟踪检测，收集活性部分；再采用c18反相硅胶柱层析继续分离纯化,用纯水为流动相，进行样品的洗脱，对洗脱液进行活性跟踪检测和收集，得到的活性样品进行高效液相色谱纯化制备(制备条件：色谱柱为sp-120-5-ods-bio4.6mmx150mm,流动相为甲醇：水＝3：7,流速：0.8ml/min,进样量10ul，检测器：spd-10a)，获得一种具有抑菌活性的白色粉末状单一化合物(阿丝苷酸)。本发明的全工艺流程见附图1。采用本发明工艺，菌株以较高的底物转化率和产物合成速率生产阿丝苷酸(丝氨酰氨尿嘧啶核苷)，采用高效液相色谱法检测阿丝苷酸(丝氨酰氨尿嘧啶核苷)含量(检测条件：色谱柱为sp-120-5-ods-bio4.6mmx150mm,流动相为甲醇：水＝3：7,流速：0.8ml/min,进样量10ul，检测器：spd-10a)，其产量可达1.0g/l以上。本发明具有以下优点：一.本发明提供一种广谱抗菌化合物阿丝苷酸(1-尿嘧啶-4-丝氨酰氨基-1，4-二脱氧-β-d-吡喃葡萄糖醛酸，即，丝氨酰氨尿嘧啶核苷)，可以开发为一种新的抗生素。二.采用遗传改良菌株“诺尔斯氏链霉菌lsp-1”(streptomycesnourseilsp-1)，其底物转化率和产物合成速率较高，阿丝苷酸的产量可达1.0g/l以上。三.采用本发明发酵培养基及液体培养基流加补料发酵工艺，可以维持菌株细胞生长和合成产物需求的较好的碳氮比，可以获得较好的阿丝苷酸(丝氨酰氨尿嘧啶核苷)的产量。四.提取工艺流程简单，回收率高，操作方便。附图说明附图1为本发明抗菌化合物阿丝苷酸(丝氨酰氨尿嘧啶核苷)的发酵生产工艺流程图。具体实施方式实施例1用1000ml三角瓶10个，每瓶装300ml培养基a(葡萄糖3.0％,蛋白胨1.5％,大豆饼粉3.5％,酵母粉0.5％,硫酸镁0.05％,氯化钠0.1％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的诺尔斯氏链霉菌lsp-1孢子液，置于28℃温度下，摇瓶培养36小时。将培养好的菌种液按15％的接种量接种于内装50l灭菌培养基b的100l发酵罐中，(培养基b:淀粉3.0％,糊精1.0％,蔗糖3.0％,硫酸铵0.5％,葡萄糖6.0％,黄豆粉或黄豆粉水解液5.0％,花生粉或花生粉水解4.0％,玉米粉3.0％,酵母粉1.0％,磷酸氢二钾1.0％,硫酸镁0.5％,氯化钠0.5％)。在28℃—30℃温度下，通气搅拌发酵14小时后，以0.7l/h的速度连续流加培养基c(培养基c:蔗糖1.0％,葡萄糖2.0％,黄豆粉或黄豆粉水解液3.0％,花生粉或花生粉水解液4.0％)，直至停止发酵(下罐)前约15小时。发酵ph6-8,发酵周期4天。发酵结束后，准确计量阿丝苷酸发酵液42升，将发酵液经过微滤处理，操作压力为0.2mpa,操作温度为15℃，进行微滤操作，并计量体积，当滤出液占进料液体积70％时，开始透析，当加入透析水量占进料液体积的40％时停机，合并滤液得清液。将微滤滤出液再经纳滤浓缩，操作压力为0.5mpa,操作温度为15℃，进行纳滤操作，所得浓缩液，减压蒸干，获得褐色膏状粗品。粗品经过正相硅胶柱层析，洗脱剂采用氯仿：甲醇：水＝5：5：0.4，再采用c18反相硅胶柱层析继续分离纯化,用纯水为流动相，进行样品的洗脱；高效液相色谱纯化制备(制备条件：色谱柱为sp-120-5-ods-bio4.6mmx150mm,流动相甲醇：水＝3：7,流速：0.8ml/min,进样量10ul，检测器：spd-10a)，浓缩结晶得到白色粉末状的阿丝苷酸(丝氨酰氨尿嘧啶核苷)。采用高效液相色谱法检测阿丝苷酸(丝氨酰氨尿嘧啶核苷)含量，检测条件：色谱柱为sp-120-5-ods-bio4.6mmx150mm,流动相甲醇：水＝3：7,流速：0.8ml/min,进样量10ul，检测器：spd-10a)，经检测，经过4天发酵，阿丝苷酸产量可达到1.2g/l发酵液，产品回收率达80％以上。实施例2用1000ml三角瓶12个，每瓶装300ml培养基a(葡萄糖3.0％,蛋白胨2.0％,大豆饼粉3.0％,酵母粉0.5％,硫酸镁0.5％,氯化钠0.2％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的诺尔斯氏链霉菌lsp-1孢子液，置于28℃温度下，摇瓶培养40小时。将培养好的菌种液按10％的接种量接种于内装50l灭菌培养基b的100l发酵罐中，(培养基b:淀粉2.0％,糊精1.0％,蔗糖/糖蜜2.0％,硫酸铵0.5％,葡萄糖5.0％,黄豆粉或黄豆粉水解液4.0％,花生粉或花生粉水解液5.0％,玉米粉3.0％,酵母粉1.0％,磷酸氢二钾1.5％,硫酸镁1.0％,氯化钠0.5％)。在28℃—30℃温度下，通气搅拌发酵20小时后，以1.0l/h的速度连续流加培养基c(培养基c:蔗糖1.5％,葡萄糖3.0％,黄豆粉或黄豆粉水解液4.0％,花生粉或花生粉水解液4.0％)，直至停止发酵(下罐)前约20小时。发酵ph6-8,发酵周期4天。发酵结束后，准确计量阿丝苷酸发酵液40升，将发酵液经过微滤处理，操作压力为0.2mpa,操作温度为15℃，进行微滤操作，并计量体积，当滤出液占进料液体积70％时，开始透析，当加入透析水量占进料液体积的40％时停机，合并滤液得清液。将微滤滤出液再经纳滤浓缩，操作压力为0.5mpa,操作温度为15℃，进行纳滤操作，所得浓缩液，减压蒸干，获得褐色膏状粗提取物。粗品经过正相硅胶柱层析，洗脱剂采用氯仿：甲醇：水＝5：5：0.4，再采用c18反相硅胶柱层析继续分离纯化,用纯水为流动相，进行样品的洗脱；高效液相色谱纯化制备(制备条件：色谱柱为sp-120-5-ods-bio4.6mmx150mm,流动相甲醇：水＝3：7,流速：0.8ml/min,进样量10ul，检测器：spd-10a)，浓缩结晶得到白色粉末状的阿丝苷酸(丝氨酰氨尿嘧啶核苷)。采用高效液相色谱法检测阿丝苷酸(丝氨酰氨尿嘧啶核苷)含量，检测条件：色谱柱为sp-120-5-ods-bio4.6mmx150mm,流动相甲醇：水＝3：7,流速：0.8ml/min,进样量10ul，检测器：spd-10a)，经检测，经过4天发酵，阿丝苷酸产量可达到1.1g/l发酵液，产品回收率达80％以上。实施例3用1000ml三角瓶10个，每瓶装300ml培养基a(葡萄糖3.0％,蛋白胨1.5％,大豆饼粉3.0％,酵母粉0.5％,硫酸镁0.5％,氯化钠0.3％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的诺尔斯氏链霉菌lsp-1孢子液，置于28℃温度下，摇瓶培养36小时。将培养好的菌种液按20％的接种量接种于内装50l灭菌培养基b的100l发酵罐中，(培养基b:淀粉3.0％,糊精1.5％,蔗糖/糖蜜3.0％,硫酸铵1.0％,葡萄糖6.0％,黄豆粉或黄豆粉水解液5.0％,花生粉或花生粉水解液5.0％,玉米粉3.0％,酵母粉2.0％,磷酸氢二钾1.0％,硫酸镁1.0％,氯化钠1.0％)。在28℃—30℃温度下，通气搅拌发酵25小时后，以间歇式流加培养基c(培养基c:蔗糖1.5％,葡萄糖5.0％,黄豆粉或黄豆粉水解液5.0％,花生粉或花生粉水解液5.0％)，间歇时间为大约间隔2小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.1％，直至停止发酵(下罐)前约10小时。发酵ph6-8,发酵周期4天。发酵结束后，准确计量阿丝苷酸发酵液41升，将发酵液经过微滤处理，操作压力为0.2mpa,操作温度为15℃，进行微滤操作，并计量体积，当滤出液占进料液体积70％时，开始透析，当加入透析水量占进料液体积的40％时停机，合并滤液得清液。将微滤滤出液再经纳滤浓缩，操作压力为0.5mpa,操作温度为15℃，进行纳滤操作，所得浓缩液，减压蒸干，获得褐色膏状粗提取物。粗品经过正相硅胶柱层析，洗脱剂采用氯仿：甲醇：水＝5：5：0.4，再采用c18反相硅胶柱层析继续分离纯化,用纯水为流动相，进行样品的洗脱；高效液相色谱纯化制备(制备条件：色谱柱为sp-120-5-ods-bio4.6mmx150mm,流动相甲醇：水＝3：7,流速：0.8ml/min,进样量10ul，检测器：spd-10a)，浓缩结晶得到白色粉末状的阿丝苷酸(丝氨酰氨尿嘧啶核苷)。采用高效液相色谱法检测阿丝苷酸(丝氨酰氨尿嘧啶核苷)含量，检测条件：色谱柱为sp-120-5-ods-bio4.6mmx150mm,流动相甲醇：水＝3：7,流速：0.8ml/min,进样量10ul，检测器：spd-10a)，经检测，经过4天发酵，阿丝苷酸产量可达到1.0g/l发酵液，产品回收率达80％以上。实施例4用1000ml三角瓶10个，每瓶装300ml培养基a(葡萄糖3.0％,蛋白胨2.0％,大豆饼粉2.0％,酵母粉0.5％,硫酸镁0.5％,氯化钠0.2％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的诺尔斯氏链霉菌(streptomycesnoursei)孢子液，置于28℃温度下，摇瓶培养36小时。将培养好的菌种液按20％的接种量接种于内装50l灭菌培养基b的100l发酵罐中，(培养基b:淀粉3.0％,糊精1.0％,蔗糖/糖蜜3.0％,硫酸铵1.0％,葡萄糖4.0％,黄豆粉或黄豆粉水解液3.0％,花生粉或花生粉水解液3.0％,玉米粉2.0％,酵母粉1.0％,磷酸氢二钾1.0％,硫酸镁1.0％,氯化钠1.0％)。在28℃—30℃温度下，通气搅拌发酵20小时后，以间歇式流加培养基c(培养基c:蔗糖1.0％,葡萄糖5.0％,黄豆粉或黄豆粉水解液3.0％,花生粉或花生粉水解液3.0％)，间歇时间为大约间隔2小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.1％，直至停止发酵(下罐)前约10小时。发酵ph6-8,发酵周期4天。发酵结束后，准确计量阿丝苷酸发酵液40升，将发酵液经过微滤处理，操作压力为0.2mpa,操作温度为15℃，进行微滤操作，并计量体积，当滤出液占进料液体积70％时，开始透析，当加入透析水量占进料液体积的40％时停机，合并滤液得清液。将微滤滤出液再经纳滤浓缩，操作压力为0.5mpa,操作温度为15℃，进行纳滤操作，所得浓缩液，减压蒸干，获得褐色膏状粗提取物。粗品经过正相硅胶柱层析，洗脱剂采用氯仿：甲醇：水＝5：5：0.4，再采用c18反相硅胶柱层析继续分离纯化,用纯水为流动相，进行样品的洗脱；高效液相色谱纯化制备(制备条件：色谱柱为sp-120-5-ods-bio4.6mmx150mm,流动相甲醇：水＝3：7,流速：0.8ml/min,进样量10ul，检测器：spd-10a)，浓缩结晶得到白色粉末状的阿丝苷酸(丝氨酰氨尿嘧啶核苷)。采用高效液相色谱法检测阿丝苷酸(丝氨酰氨尿嘧啶核苷)含量，检测条件：色谱柱为sp-120-5-ods-bio4.6mmx150mm,流动相甲醇：水＝3：7,流速：0.8ml/min,进样量10ul，检测器：spd-10a)，经检测，经过4天发酵，阿丝苷酸产量可达到0.1g/l发酵液，产品回收率达80％以上。应用实例1阿丝苷酸(丝氨酰氨尿嘧啶核苷)防治蔬菜、水稻病害：用1％的丝氨酰氨尿嘧啶核苷水溶液，作田间喷施，防治植物细菌病和病毒病,发病率比对照药剂分别降低36％，41％，32％，30％，如下表。应用实例2：用1％的丝氨酰氨尿嘧啶核苷水溶液，与一定浓度的脱落酸(aba)一起作田间喷施，可以提高防治效果与防治的持效性，如下表。当前第1页12