本发明涉及具有抗肿瘤作用的核苷磷酸酯/酰胺衍生物及其异构体。
背景技术：
肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病。吉西他滨(gemcitabine，化学名2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷)及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)是临床最常用的两种抗肿瘤药物。吉西他滨和5-氟尿嘧啶分别在细胞内转化为2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷三磷酸(dfdctp)和5-氟脱氧尿嘧啶核苷单磷酸(5-fdump)发挥抗肿瘤作用。
文献报道吉西他滨和5-氟脱氧尿嘧啶核苷的核苷磷酸酯/酰胺衍生物nuc-1031和nuc-3073分别具有比吉西他滨和5-氟脱氧尿嘧啶核苷更强的抗肿瘤活性，但是nuc-1031和nuc-3073具有升高转氨酶的肝脏副作用。
技术实现要素：
本发明提供式i所示的核苷磷酸酯/酰胺衍生物，及其非毒性药学上可接受的盐：
式i中，nu代表如下解结构的核苷残基：
r1选自碳原子数1-5的烷基、碳原子数1-7的环烷基、或碳原子数1-8的芳香烷基；r2选自h或碳原子数1-5的烷基。
当nu为吉西他滨，即2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷残基时，本发明进一步提供式ia所示的核苷磷酸酯/酰胺衍生物，及其非毒性药学上可接受的盐：
式ia中，r1选自碳原子数1-5的烷基、碳原子数1-7的环烷基、或碳原子数1-8的芳香烷基；r2选自h或碳原子数1-5的烷基。
当nu为5-氟脱氧尿嘧啶核苷残基时，本发明进一步提供式ib所示的核苷磷酸酯/酰胺衍生物，及其非毒性药学上可接受的盐：
式ib中，r1选自碳原子数1-5的烷基、碳原子数1-7的环烷基、或碳原子数1-8的芳香烷基；r2选自h或碳原子数1-5的烷基。
本专利发明人意外发现，式i、ia及ib所示的核苷磷酸酯/酰胺衍生物的不同异构体具有不同的抗肿瘤活性。因此，本发明进一步提供式ia和ib的s-异构体sp-ia和sp-ib：
式sp-ia和sp-ib中，r1和r2的定义同上。
本发明也进一步提供式ia和ib的r-异构体rp-ia和rp-ib：
式rp-ia和rp-ib中，r1和r2的定义同上。
具体地，本发明提供的化合物选自如下结构：
本发明提供式i、ia、ib、sp-ia、sp-ib、rp-ia及rp-ib所示的核苷磷酸酯/酰胺衍生物或其药学上可接受的盐或其溶剂合物作为活性成分，以及一种或多种药用载体或赋形剂的药物组合物。
本发明提供式i、ia、ib、sp-ia、sp-ib、rp-ia及rp-ib所示的核苷磷酸酯/酰胺衍生物或其药学上可接受的盐或其溶剂合物作为活性成分，及其药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途；这些药物组合物可以是片剂，如速释片、缓释片、控释片、薄膜衣片、糖衣片、口含片、舌下片、等；胶囊剂如硬胶囊剂、软胶囊剂等；注射剂如无菌的或含抑菌剂的水性注射液、油性注射液、冷冻干燥粉针剂、注射用微球等。
发明人意外地发现，式i、ia、ib、sp-ia、sp-ib、rp-ia及rp-ib所示的核苷磷酸酯/酰胺衍生物口服给药后，能够抑制肝损伤所引起的转氨酶升高。
具体实施方式
下述实施例用于具体地解释本发明，然而本发明的范围并不限于下述实施例。
参考实施例15’-[苯氧基-((s)-(1-苯甲氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]-2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷(nuc-1031)的制备
参考实施例1.13’-o-(叔丁基氧基羰基)-2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷(i-1)的制备
在80ml二氧六环和20ml水的混合溶剂中，加入6g吉西他滨盐酸盐，11gna2co3，搅拌下加入4.4g二叔丁基二碳酸酯，室温搅拌24小时，加入200ml水，用乙酸乙酯(600mlx2)提取，合并提取液，依次用100ml水和100ml盐水洗，用无水硫酸钠干燥；过滤，将滤液减压蒸干；将残留物用硅胶柱层析分离，用二氯甲烷∶甲醇(10∶1)洗脱，收集所需组分，减压蒸干，得中间体i-15.8g。
参考实施例1.2苯氧基-((s)-(1-苯甲氧基羰基-)乙胺基)-磷酰氯(ii-1)的制备
将2.1克二氯磷酸苯酚酯和2.2克l-丙氨酸苄酯盐酸盐溶于30ml无水二氯甲烷中，冷却至-78℃。搅拌下滴加2ml三乙胺溶于20ml无水二氯甲烷的溶液，控制滴加速度以保持反应温度-78℃。加完后，待反应温度缓升至室温，继续搅拌1小时。减压蒸出溶剂，在残留物中加入30ml无水乙醚，过滤。将滤液减压蒸干，得中间体ii-1，直接用于下步反应。
参考实施例1.35’-[苯氧基-((s)-(1-苯甲氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]-3’-o-(叔丁基氧基羰基)-2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷(iii-1)的制备
将0.36克i-1溶于10ml干燥的四氢呋喃，加入1ml1m叔特丁基氯化镁的thf溶液，搅拌0.5h，搅拌下加入0.7gii-1溶于2mlthf的溶液，搅拌12h。减压蒸干，将残留物用硅胶柱层析分离，用二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺(100∶5∶1)混合溶剂洗脱，收集所需组分，蒸干后得到中间体iii-10.24g。
参考实施例1.45’-[苯氧基-((s)-(1-苯甲氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]--2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷(nuc-1031)的制备
在3ml二氯甲烷中，加入3ml三氟乙酸，搅拌冷却至0℃；加入0.24giii-1，搅拌反应3小时。减压蒸干，加入5ml饱和nahco3溶液，用乙酸乙酯提取(10mlx2)，合并提取液，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸干，用二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺(100∶5∶1)混合溶剂洗脱，收集所需组分，蒸干后得到nuc-10310.13g。核磁共振氢谱δ(ppm，meod)：7.57(d，0.5h)，7.53(d，0.5h)，7.40-7.34(m，7h)，7.28-7.21(m，3h)，6.26(m，1h)，5.89(d，0.5h)，5.85(d，0.5h)，5.19-5.13(m，2h)，4.51-4.32(m，2h)，4.26-4.18(m，1h)，4.08-4.02(m，2h)，1.39(m，3h)。
参考实施例25’-[1-萘氧基-((s)-(1-苯甲氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]-5-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷(nuc-3073)的制备
参考实施例2.11-萘氧基-((s)-(1-苯甲氧基羰基-)乙胺基)-磷酰氯(ii-2)的制备
将2.3克二氯磷酸萘酚酯和2.2克l-丙氨酸苄酯盐酸盐溶于30ml无水二氯甲烷中，冷却至-78℃。搅拌下滴加2ml三乙胺溶于20ml无水二氯甲烷的溶液，控制滴加速度以保持反应温度-78℃。加完后，待反应温度缓升至室温，继续搅拌1小时。减压蒸出溶剂，在残留物中加入30ml无水乙醚，过滤。将滤液减压蒸干，得中间体ii-2，直接用于下步反应。
参考实施例2.25’-[1-萘氧基-((s)-(1-苯甲氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]-5-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷(nuc-3073)的制备
将0.25克5-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷(5-fdu)溶于10ml干燥的四氢呋喃，加入1ml1m叔特丁基氯化镁的thf溶液，搅拌0.5h，搅拌下加入0.8gii-2溶于2mlthf的溶液，搅拌12h。减压蒸干，将残留物用硅胶柱层析分离，用二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺(100∶5∶1)混合溶剂洗脱，收集所需组分，蒸干后得到nuc-30730.11g。核磁共振氢谱δ(ppm，meod)：8.17-8.10(m，1h)，7.88-7.85(m，1h)，7.71-7.66(m，2h)，7.54-7.45(m，3h)，7.43-7.25(m，6h)，6.12-6.05(m，1h)，5.11-5.07(m，2h)，4.35-4.23(m，3h)，4.13-4.01(m，2h)，2.16-2.07(m，1h)，1.78-1.66(m，1h)，1.37-1.33(m，3h)。
实施例15’-[(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-乙氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]--2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷(ia-1)的制备
实施例1.1(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-乙氧基羰基-)乙胺基)-磷酰氯(ii-3)的制备
将15.3g三氯氧磷和13.8g5-羟基苯并二氧无环加于250ml无水乙醚溶液中，氩气保护下，冷却到-78℃，滴加13.4ml三乙胺，加完后在-78℃搅拌30分钟，然后室温搅拌过夜。过滤，将滤液减压蒸干，得(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-二氯氧磷备用。
将2.6克(0.01mol)(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-二氯氧磷和1.5克(0.01mol)l-丙氨酸乙酯溶于30ml无水二氯甲烷中，冷却至-78℃。搅拌下滴加2ml三乙胺溶于20ml无水二氯甲烷的溶液，控制滴加速度以保持反应温度-78℃。加完后，待反应温度缓升至室温，继续搅拌1小时。减压蒸出溶剂，在残留物中加入30ml无水乙醚，过滤。将滤液减压蒸干，得ii-3，直接用于下步反应。
实施例1.25’-[(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-乙氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]--2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷(ia-1)的制备
参照实施例1.3的方法，将i-1与ii-3反应，制得中间体iii-2；
参照1.4的方法，将iii-2脱保护，得到ia-1。核磁共振氢谱δ(ppm，meod)：7.58(d，0.5h)，7.54(d，0.5h)，6.76(d，1h)，6.67(s，1h)，6.48(d，1h)，6.26(m，1h)，5.99(s，2h)，5.88(d，0.5h)，5.86(d，0.5h)，4.56-4.36(m，2h)，4.27-4.20(m，1h)，4.10-4.00(m，2h)，3.62(m，2h)，1.35(m，3h)，1.15(m，3h)。
实施例25’-[(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-异丙氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]--2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷(ia-2)的制备
参照实施例1.1的方法，将(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-二氯氧磷与l-丙氨酸异丙酯反应，制得中间体(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-异丙氧基羰基-)乙胺基)-磷酰氯(ii-4)。
参照实施例1.3的方法，将i-1与ii-4反应，制得中间体iii-3。
参照1.4的方法，将iii-3脱保护，得到ia-2。核磁共振氢谱δ(ppm，meod)：7.58(d，0.5h)，7.53(d，0.5h)，6.76(m，1h)，6.67(s，1h)，6.48(m，1h)，6.26(m，1h)，5.99(s，2h)，5.88(d，0.5h)，5.86(d，0.5h)，5.02(m，1h)，4.56-4.36(m，2h)，4.27-4.20(m，1h)，4.11-4.01(m，1h)，1.35(m，3h)，1.25-1.22(m，6h)。
实施例35’-[(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-环己氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]--2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷(ia-3)的制备
参照实施例1.1的方法，将(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-二氯氧磷与l-丙氨酸环己酯反应，制得中间体(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-环己氧基羰基-)乙胺基)-磷酰氯(ii-5)。
参照实施例1.3的方法，将i-1与ii-5反应，制得中间体iii-4；
参照1.4的方法，将iii-4脱保护，得到ia-3。核磁共振氢谱δ(ppm，meod)：7.59(d，0.5h)，7.55(d，0.5h)，6.76(m，1h)，6.67(s，1h)，6.48(m，1h)，6.26(m，1h)，5.99(s，2h)，5.87(d，0.5h)，5.85(d，0.5h)，4.75-4.68(m，1h)，4.56-4.36(m，2h)，4.27-4.20(m，1h)，4.13-4.08(m，1h)，3.94(m，1h)，1.90-1.68(m，4h)，1.55-1.50(m，1h)，1.35(m，3h)，1.40-1.22(m，8h)。
实施例45’-[(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-苯甲氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]--2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷(ia-4)的制备
参照实施例1.1的方法，将(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-二氯氧磷与l-丙氨酸苯甲酯反应，制得中间体(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-苯甲氧基羰基-)乙胺基)-磷酰氯(ii-6)。
参照实施例1.3的方法，将i-1与ii-6反应，制得中间体iii-5；
参照1.4的方法，将iii-5脱保护，得到ia-4。核磁共振氢谱δ(ppm，meod)：7.57(d，0.5h)，7.53(d，0.5h)，7.38-7.35(m，3h)，7.25-7.20(m，2h)；6.76(d，1h)，6.67(s，1h)，6.48(d，1h)，6.26(m，1h)，5.99(s，2h)，5.88(d，0.5h)，5.86(d，0.5h)，5.18-5.12(m，2h)，4.56-4.36(m，2h)，4.27-4.20(m，1h)，4.13-4.08(m，1h)，3.94(m，1h)，1.35(m，3h)。
实施例55’-[(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-乙氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]-5-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷(ib-1)的制备
参照参考实施例2.2的方法，将-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷(5-fdu)与ii-3反应，制得ib-1。核磁共振氢谱δ(ppm，meod)：7.72-7.68(m，1h)，6.76(d，1h)，6.67(s，1h)，6.48(d，1h)，6.12(m，1h)，5.99(s，2h)，4.36-4.24(m，3h)，4.15-4.06(m，2h)，3.62(m，2h)，2.17-2.10(m，1h)，1.79-1.66(m，1h)，1.38-1.35(m，3h)，1.15(m，3h)。
实施例65’-[(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-异丙氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]-5-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷(ib-2)的制备
参照参考实施例2.2的方法，将-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷(5-fdu)与ii-4反应，制得ib-2。核磁共振氢谱δ(ppm，meod)：7.72-7.68(m，1h)，6.76(d，1h)，6.67(s，1h)，6.48(d，1h)，6.12(m，1h)，5.99(s，2h)，5.02(m，1h)，4.36-4.24(m，3h)，4.15-4.06(m，2h)，2.17-2.10(m，1h)，1.79-1.66(m，1h)，1.38-1.35(m，3h)，1.25-1.22(m，6h)。
实施例75’-[(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-环己氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]-5-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷(ib-3)的制备
参照参考实施例2.2的方法，将-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷(5-fdu)与ii-5反应，制得ib-3。核磁共振氢谱δ(ppm，meod)：7.72-7.68(m，1h)，6.76(d，1h)，6.67(s，1h)，6.48(d，1h)，6.12(m，1h)，5.99(s，2h)，4.75-4.68(m，1h)，4.36-4.24(m，3h)，4.15-4.06(m，2h)，2.17-2.10(m，1h)，1.90-1.65(m，5h)，1.55-1.50(m，1h)，141-1.23(m，11h)。
实施例85’-[(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-苯甲氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]-5-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷(ib-4)的制备
参照参考实施例2.2的方法，将-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷(5-fdu)与ii-6反应，制得ib-4。核磁共振氢谱δ(ppm，meod)：7.72-7.68(m，1h)，7.38-7.35(m，3h)，7.25-7.20(m，2h)；6.76(d，1h)，6.67(s，1h)，6.48(d，1h)，6.12(m，1h)，5.99(s，2h)，5.18-5.12(m，2h)，4.36-4.24(m，3h)，4.15-4.06(m，2h)，2.17-2.10(m，1h)，1.79-1.66(m，1h)，1.38-1.35(m，3h)。
实施例95’-[(s)-(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-异丙氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]-2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷(sp-ia-2)的制备
实施例9.1(s)-2-[-(s)-(2，3，4，5，6-五氟苯氧基)-(苯并[1，3]二氧五环-5-基-氧基)-磷酰胺]丙酸异丙酯(sp-iv-1)和(r)-2-[-(s)-(2，3，4，5，6-五氟苯氧基)-(苯并[1，3]二氧五环-5-基-氧基)-磷酰胺]丙酸异丙酯(rp-iv-1)的制备
参考文献(rossbs，etal.synthesisofdiastereomericallypurenucleotidephosphoramidatesjorgchem2011，76，8311-8319)方法，制备关键手性中间体sp-iv-1和rp-iv-1。
将15g三氯氧磷和14g芝麻酚加于200ml无水乙醚溶液中，氩气保护下，冷却到-78℃，滴加13ml三乙胺，加完后在-78℃搅拌30分钟，然后室温搅拌过夜。过滤，将滤液减压蒸干，得苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-二氯氧磷备用(现制现用)。
将2.6克苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-二氯氧磷和1.6克l-丙氨酸异丙酯溶于30ml无水二氯甲烷中，冷却至-78℃。搅拌下滴加2.8ml三乙胺溶于15ml无水二氯甲烷的溶液，控制滴加速度以保持反应温度-78℃。加完后，待反应温度缓升至室温，继续搅拌1小时。然后将反应混合物冷却至0℃，搅拌下滴加1.84克五氟苯酚和1.4ml三乙胺溶于5ml无水二氯甲烷的溶液；保持0℃，继续搅拌4小时。过滤，以20ml二氯甲烷洗涤，合并洗滤液，减压蒸干，得无色油状物。加入特丁基甲醚40ml，研磨，滤去固体，滤饼用少许特丁基甲醚洗涤，合并洗滤液，减压蒸干。加入石油醚∶乙酸乙酯混合溶剂(10∶1)50ml加热溶解，冷却至室温析出固体；滤出固体，再用石油醚∶乙酸乙酯混合溶剂(10∶1)50ml重结晶，得2.5克中间体sp-iv-1；异构体纯度de98.6％；熔点，116-120℃；比旋光度[α]25d(c1.00，chcl3)+8.2；31pnmrδ(ppm，cdcl3)：-0.439；3hnmrδ(ppm，dmso-d6)：6.90-6.92(d，1h)，6.84(m，1h)，6.70(m，1h)，6.00(s，2h)，4.86-4.89(m，1h)，3.89-3.92(m，1h)，1.26-1.28(d，3h)，1.16-1.18(d，6h)。
将富集rp异构体的母液蒸干，用甲醇溶解(约20mg/ml)，用手性柱(2x15cm)超临界流体色谱分离，35％异丙醇二氧化碳流动相洗脱，压力100bar，每次上样4ml。收集第一个组分，合并后减压蒸干，放置固化，得到1.9g中间体rp--iv-1；de99.2％；熔点，87-92℃；31pnmrδ(ppm，cdcl3)：-0.542；3hnmrδ(ppm，dmso-d6，400mhz)：6.91-6.93(d，1h)，6.85(m，1h)，6.71(m，1h)，5.98(s，2h)，4.87-4.90(m，1h)，3.90-3.93(m，1h)，1.27-1.29(d，3h)，1.17-1.20(d，6h)。
实施例9.25’-[(s)-(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-异丙氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]-2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷(sp-ia-2)的制备
将0.66gi-1溶于10ml干燥的thf中，冷却至-5℃，缓慢滴加1.7m的特丁基氯化镁的thf溶液2.4ml；保持-5℃，搅拌30分钟，然后室温再搅拌30分钟。将反应混合物冷却至5℃，缓慢滴加1.2克sp-iv-1溶于10mlthf的溶液。冰浴下，继续搅拌12小时；减压蒸去thf，将残留物用硅胶柱层析分离，用二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺(100∶5∶1)混合溶剂洗脱，收集所需组分，蒸干后得到中间体0.47gsp-iii-3。
参照参考实施例1.4的方法，将sp-iii-3脱保护，得到0.35gsp-ia-2；de99.2％。核磁共振氢谱δ(ppm，dmso-d6，400mhz)：7.60(d，1h)，6.90-6.92(d，1h)，6.84(s，1h)，6.70(d，1h)，6.26(m，1h)，6.00(s，2h)，5.90(d，1h)，4.86-4.89(m，1h)，4.75-4.70(m，1h)，4.38-4.35(m，1h)；4.28-4.21(m，1h)，3.96-4.01(m，1h)3.89-3.92(m，1h)，1.26-1.28(d，3h)，1.16-1.18(d，6h)。
实施例105’-[(s)-(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-苯甲氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]--2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷(sp-ia-4)的制备
实施例10.1(s)-2-[-(s)-(2，3，4，5，6-五氟苯氧基)-(苯并[1，3]二氧五环-5-基-氧基)-磷酰胺]丙酸苄酯(sp-iv-2)和(r)-2-[-(s)-(2，3，4，5，6-五氟苯氧基)-(苯并[1，3]二氧五环-5-基-氧基)-磷酰胺]丙酸苄酯(rp-iv-2)的制备
将2.6克苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-二氯氧磷和1.8克l-丙氨酸苄酯溶于30ml无水二氯甲烷中，冷却至-78℃。搅拌下滴加2.8ml三乙胺溶于15ml无水二氯甲烷的溶液，控制滴加速度以保持反应温度-78℃。加完后，待反应温度缓升至室温，继续搅拌1小时。然后将反应混合物冷却至0℃，搅拌下滴加1.84克五氟苯酚和1.4ml三乙胺溶于5ml无水二氯甲烷的溶液；保持0℃，继续搅拌4小时。过滤，以20ml二氯甲烷洗涤，合并洗滤液，减压蒸干，得无色油状物。加入特丁基甲醚40ml，研磨，滤去固体，滤饼用少许特丁基甲醚洗涤，合并洗滤液，减压蒸干。加入石油醚∶乙酸乙酯混合溶剂(10∶1)40ml加热溶解，冷却至室温析出固体；滤出固体，再用石油醚∶乙酸乙酯混合溶剂(10∶1)30ml重结晶，得2.1克中间体sp-iv-2；异构体纯度de98.8％；熔点，102-123℃；31pnmrδ(ppm，cdcl3)：-0.442；3hnmrδ(ppm，dmso-d6，400mhz)：7.41-7.36(m，3h)7.25-7.22(m，2h)6.90-6.92(d，1h)，6.84(m，1h)，6.70(m，1h)，6.00(s，2h)，5.15(s，2h)；3.89-3.92(m，1h)，1.26-1.28(d，3h)。
将富集rp异构体的母液蒸干，用甲醇溶解(约20mg/ml)，用手性柱(2x15cm)超临界流体色谱分离，35％异丙醇二氧化碳流动相洗脱，压力100bar，每次上样4ml。收集第一个组分，合并后减压蒸干，放置固化，得到1.5克rp-iv-2；de99.3％；熔点，73-90℃；31pnmrδ(ppm，cdcl3)：-0.550；3hnmrδ(ppm，dmso-d6，400mhz)：7.42-7.38(m，3h)，7.27-7.23(m，2h)，6.91-6.93(d，1h)，6.85(m，1h)，6.72(m，1h)，6.01(s，2h)，5.17(s，2h)，3.88-3.90(m，1h)，1.25-1.27(d，3h)。
实施例10.25’-[(s)-(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-苯甲氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]-2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷(sp-ia-4)的制备
将0.66gi-1溶于10ml干燥的thf中，冷却至-5℃，缓慢滴加1.7m的特丁基氯化镁的thf溶液2.4ml；保持-5℃，搅拌30分钟，然后室温再搅拌30分钟。将反应混合物冷却至5℃，缓慢滴加1.3克sp-iv-2溶于10mlthf的溶液。冰浴下，继续搅拌12小时；减压蒸去thf，将残留物用硅胶柱层析分离，用二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺(100∶5∶1)混合溶剂洗脱，收集所需组分，蒸干后得到中间体0.41gsp-iii-5。
参照参考实施例1.4的方法，将sp-iii-5脱保护，得到0.28gsp-ia-4；de98.5％。核磁共振氢谱δ(ppm，dmso-d6，400mhz)：7.60(d，1h)，7.41-7.36(m，3h)，7.25-7.22(m，2h)，6.90-6.92(d，1h)，6.84(d，1h)，6.70(s，1h)，6.26(m，1h)，6.00(s，2h)，5.90(d，1h)，5.15(s，2h)，4.75-4.70(m，1h)，4.38-4.35(m，1h)，4.28-4.21(m，1h)，3.96-4.01(m，1h)3.89-3.92(m，1h)，1.26-1.28(d，3h)。
实施例115’-[(r)-(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-异丙氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]--2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷(rp-ia-2)的制备
参照实施例9.2的方法，将i-1与rp-iv-1反应，制得中间体rp-iii-3.
参照参考实施例1.4的方法，将rp-iii-3脱保护，得到rp-ia-20.19g；de99.3％。核磁共振氢谱δ(ppm，dmso-d6，400mhz)：7.60(d，1h)，6.90-6.92(d，1h)，6.83(s，1h)，6.68(d，1h)，6.25(m，1h)，5.99(s，2h)，5.89(d，1h)，4.85-4.88(m，1h)，4.73-4.68(m，1h)，4.36-4.32(m，1h)；4.26-4.20(m，1h)，3.94-4.01(m，1h)，3.87-3.90(m，1h)，1.24-1.27(d，3h)，1.16-1.18(d，6h)。
实施例125’-[(r)-(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-苯甲氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]--2’，2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷(rp-ia-4)的制备
参照实施例9.2的方法，将i-1与rp-iv-2反应，制得中间体rp-iii-5。
参照参考实施例1.4的方法，将rp-iii-5脱保护，得到rp-ia-40.25g；de99.4％。核磁共振氢谱δ(ppm，dmso-d6，400mhz)：7.61(d，1h)，7.41-7.36(m，3h)，7.25-7.22(m，2h)，6.90-6.92(d，1h)，6.84(d，1h)，6.70(s，1h)，6.26(m，1h)，5.98(s，2h)，5.87(d，1h)，5.15(s，2h)，4.75-4.70(m，1h)，4.38-4.35(m，1h)，4.28-4.21(m，1h)，3.96-4.01(m，1h)3.89-3.92(m，1h)，1.25-1.27(d，3h)。
实施例135’-[(s)-(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-异丙氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]-5-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷(sp-ib-2)的制备
参照实施例9.2的方法，将5-fdu代替i-1，与sp-iv-1反应，制得sp-ib-2；de98.6％。核磁共振氢谱δ(ppm，dmso-d6，400mhz)：7.72-7.68(m，1h)，6.90-6.92(d，1h)，6.84(m，1h)，6.70(m，1h)，6.12(m，1h)，6.00(s，2h)，4.86-4.89(m，1h)，4.36-4.24(m，3h)，4.12(m，1h)，3.89-3.92(m，1h)，2.14(m，1h)，1.70(m，1h)，1.26-1.28(d，3h)，1.16-1.18(d，6h)。
实施例145’-[(s)-(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-苯甲氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]-5-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷(sp-ib-4)的制备
参照实施例9.2的方法，将5-fdu代替i-1，与sp-iv-2反应，制得sp-ib-4；de98.4％。核磁共振氢谱δ(ppm，dmso-d6，400mhz)：7.72-7.68(m，1h)，7.41-7.36(m，3h)，7.25-7.22(m，2h)，6.90-6.92(d，1h)，6.84(s，1h)，6.70(d，1h)，6.11(m，1h)，6.00(s，2h)，5.15(s，2h)，4.32(m，3h)，4.10(m，1h)，3.89-3.92(m，1h)，2.12(m，1h)，1.72(m，1h)，1.26-1.28(d，3h)。
实施例155’-[(r)-(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-异丙氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]-5-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷(rp-ib-2)的制备
参照实施例9.2的方法，将5-fdu代替i-1，与rp-iv-1反应，制得rp-ib-2；de99.1％。核磁共振氢谱δ(ppm，dmso-d6，400mhz)：7.70-7.67(m，1h)，6.89-6.91(d，1h)，6.82(m，1h)，6.70(m，1h)，6.12(m，1h)，5.99(s，2h)，4.86-4.89(m，1h)，4.36-4.24(m，3h)，4.12(m，1h)，3.89-3.92(m，1h)，2.14(m，1h)，1.70(m，1h)，1.26-1.28(d，3h)，1.16-1.18(d，6h)。
实施例165’-[(r)-(苯并[1，3]二氧五环-5-基)-氧基-((s)-(1-苯甲氧基羰基-)乙胺基)-磷酰基]-5-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷(rp-ib-4)的制备
参照实施例9.2的方法，将5-fdu代替i-1，与rp-iv-2反应，制得rp-ib-4；de99.3％。核磁共振氢谱δ(ppm，dmso-d6，400mhz)：7.70-7.66(m，1h)，7.39-7.35(m，3h)，7.23-7.20(m，2h)，6.89-6.92(d，1h)，6.82(s，1h)，6.69(d，1h)，6.10(m，1h)，5.98(s，2h)，5.13(s，2h)，4.31(m，3h)，4.09(m，1h)，3.87-3.90(m，1h)，2.11(m，1h)，1.70(m，1h)，1.26-1.28(d，3h)。
实施例17体外抗肿瘤活性的评价
分别将鼠白血病细胞l1210和人淋巴细胞cem细胞接种于96孔板中，细胞数5x104/孔，置co2培养箱中孵育至细胞密度达到80％，弃去培养液，加入含不同浓度待测药物的新培养液，设置3个平行孔；每隔2天更换培养液。在给药后第3天，加入5mg/ml的噻唑蓝(mtt)溶液10μl/孔，37℃继续孵育4h，弃液，每孔加入100μldmso，室温震荡10min，使mtt结晶完全溶解。酶联免疫检测仪550nm波长测定每孔吸光度，按公式计算抑制率：
抑制率(％)＝(1-受试孔od值/溶剂对照孔平均od值)×100％
结果以均值±sd表示，n＝3。
由spss软件计算各受试物对各种肿瘤细胞生长的半数抑制浓度(ic50)。
表1体外体外抗肿瘤活性评价结果
实施例18抗ccl4所致小鼠肝损伤作用的评价
昆明种小鼠(20g)，随机分组(每组8只)。通过口服给予0.2mmol的待测化合物；给药1h后，皮下注射0.1％ccl4的花生油溶液(10ml/kg)，制备肝损伤模型；注射生理盐水作为正常对照组。造模后12小时后，再次口服给予0.2mmol的待测化合物。第二次给药后24小时，采血取血清标本，测定alt，ast。结果见表2。
表2抗ccl4中毒所致小鼠肝损伤的作用
实施例19抗d-氨基半乳糖所致小鼠肝损伤作用的评价
昆明种小鼠(20g)，随机分组(每组8只)。通过口服给予0.2mmol的待测化合物；给药2h后，按750mg/kg的剂量腹腔注射给予d-氨基半乳糖制备肝损伤模型，皮下注射生理盐水作为正常对照组。造模12h后，再次口服给予0.2mmol的待测化合物。第二次给药后24小时，采血取血清标本，测定alt，ast。结果见表3。
表3抗d-氨基半乳糖所致小鼠肝损伤的作用