从光合细菌中逐级提取多种高价值物质的方法与流程

本发明属于生物加工技术领域，具体涉及一种从光合细菌中逐级提取多种高价值物质的方法。

背景技术

光合细菌中含有多种丰富的营养物质，其中以辅酶q10、类胡萝卜素、菌绿素、5-ala、单细胞蛋白最为突出和典型，被称为高价值物质。这些高价值物质有的可以作为种植、医药、化妆品行业的原材料，有的具有延缓衰老、抑制肿瘤、抗氧化等功效，有的可以作为植物添加剂和动物饲料添加剂，具有很高的经济价值和社会效益。现有研究已经有对光合细菌中不同高价值物质的提取方法的介绍，其中对类胡萝卜素研究较多，主要是超声辅助提取(uae)、加压液相提取、脉冲电场(pef)提取和酶辅助萃取(unk)，而对辅酶q10、5-ala等物质的提取方法研究较少，辅酶q10的现有提取方法主要采用冻融+萃取法、超声+萃取法、酶解辅助超声萃取法、碱皂化法等，仅有少量研究表明可以从光合细菌中提取到少量的5-ala。目前为止，现有研究侧重于光合细菌中某一种高价值物质的单独提取，一次只能提取一种物质，只能发挥光合细菌的部分价值，尚未有研究者对光合细菌中多种高价值物质进行连续同时提取，使得菌体中大量其他资源被白白浪费。因此如果有一种方法可以将光合细菌中的多种高价值物质一次性提取出来，可以最大化的利用菌体资源，实现更大的经济效益和社会价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种从光合细菌中逐级提取多种高价值物质的方法。

本发明提供的从光合细菌中逐级提取辅酶q10、类胡萝卜素、菌绿素、5-ala和蛋白质的方法，包括如下步骤：

1)将光合细菌菌液离心后，弃去上清液，收集菌体沉淀，破碎细胞壁；

2)将步骤1)破碎细胞壁后的体系进行辅酶q10的提取，收集所得上清液，得到辅酶q10；

3)收集步骤2)提取所得体系的下层菌液，进行类胡萝卜素和菌绿素的提取，收集所得上清液，得到类胡萝卜素和菌绿素；

4)收集步骤3)提取所得体系的下层菌液，进行5-ala的提取；

5)收集步骤4)提取所得体系的下层菌液，进行蛋白质的提取。

上述方法的步骤1)离心步骤中，离心转速为6000-10000r/min；具体为9000r/min；时间为5-15分钟；具体为10分钟；

所述破碎细胞壁步骤中，破碎方法包括：将所述菌体沉淀与溶剂混合后置于超声波细胞粉碎机中超声；所用超声波细胞粉碎机具体可为宁波新芝超声波细胞粉碎机jy92-iidn；

具体的，所述溶剂为丙酮；

所述溶剂的用量为70～73ml/gdcw，具体为71.74ml/gdcw；

所述超声步骤中，超声功率为300～600w；具体为400w；超声温度为10～25℃；所述超声为每超声工作2s间隔1s；超声时间为5～20min。

所述步骤2)中，提取方法为在摇床中振荡；

具体的，摇床温度为20-40℃，具体为25℃；振荡时间为20～40min；转速为85～135r/min；具体为120r/min。

所述步骤3)中，提取方法为在提取溶剂中静置；

具体的，所用提取溶剂为丙酮和甲醇；所用提取溶剂中，丙酮和甲醇的体积比为6-8：2，具体为7:2；所述下层菌液与提取溶剂的体积比为1-3:1；具体为2:1；提取温度为20-40℃；静置时间为1-6小时。

所述步骤4)中，提取方法包括如下步骤：

向步骤3)提取所得体系的下层菌液中加入5-ala提取溶剂后混匀，水浴加热冷却至室温后离心，收集上清液，完成所述5-ala的提取。

具体的，所述5-ala提取溶剂由乙酸钠缓冲液和乙酰丙酮组成；

所述乙酸钠缓冲液的浓度为1-2mol/l；ph值为4-5；具体为4.6；

所述乙酸钠缓冲液和乙酰丙酮的体积比为0.8-1.5：0.25-1；具体为1：0.25ml；所述菌液与乙酸钠缓冲液的体积比为9-11：1；具体为10：1；

所述水浴加热步骤中，温度为90～100℃；时间为20～40min；具体为30min；

所述离心步骤中，离心转速为6000-10000r/min；具体为9000r/min；时间为3～6分钟；具体为5分钟。

可用改良的ehrlich试剂检测5-ala吸光度。该改良的ehrlich试剂可按照如下方法配制而得：50ml量筒中，依次加入30ml冰醋酸，1g对二甲基氨基苯甲醛，8ml70％高氯酸，溶解后用冰醋酸稀释至50ml，混匀。盛于棕色瓶，保存于冰箱中，现配现用。

所述步骤5)中，提取方法为盐析法。该方法为常规的提取蛋白质的方法。

具体的，所述盐析法包括：向步骤4)提取所得体系的下层菌液中加入ph值为8.0、浓度为10mm的tris-hcl缓冲液，按每g湿菌体加入10ml缓冲液的比例悬浮细胞，重复离心2-3次；向菌体中加入1％的triton-x100和0.1mol/l的nacl，室温下暗中搅拌2小时，之后用保鲜膜封住口，置于4℃冰箱中过夜进行增溶膜蛋白；将过夜增溶膜蛋白的溶液加入离心管中配平，9000r/min离心30min，收集上清液；在收集到的上清液中加入60％的硫酸铵溶液，之后放入4℃冰箱中静置1min，静置后的溶液9000r/min离心30min，收集上清浮质，并将其溶解于10mm，ph8.0的tris-hcl缓冲液中，得到蛋白粗提物；

再将所得蛋白粗提物置于透析袋中密封，透析袋置于盛有10mm，ph8.0的tris-hcl缓冲液的大烧杯中过夜透析，经过2-3次透析后，即可得到纯化的蛋白质。用紫外分光光度计在280nm处测定蛋白质的吸光度，用经验公式计算蛋白质浓度。

另外，本发明还要求保护一种从光合细菌中逐级提取辅酶q10、类胡萝卜素和菌绿素的方法，该方法包括前述方法的步骤1)至步骤3)。

本发明针对光合细菌中高价值物质种类丰富且含量较高的特性，在整合每种物质分别的提取方法的基础上进行综合提取，利用同一批菌先后提取辅酶q10、类胡萝卜素、菌绿素、5-ala和蛋白质，使光合细菌中高价值物质最大限度的被提取利用，更好地发挥其资源化的效用。

本发明的有益效果如下：

1、本发明采用逐级提取的方法将光合细菌中的辅酶q10、类胡萝卜素、菌绿素、5-ala、蛋白质这几种高价值物质按照市场价格、提取难易、是否对菌体有破坏性等因素考察后确定了最佳的提取顺序进行逐次提取，将光合细菌中的高价值物质最大化的提取利用，并且在保证优先提取物质产量的同时可以同步提取其他物质，最后用剩余菌体提纯蛋白质，达到了菌体资源利用的最大化。所采用的技术能耗和成本较低，条件温和，能够有效的保证提取物的成分，能得到高品质的提取物以及其他功能性成分。

2、本发明需要的设备简单，操作安全简便，操作重复性强，有利于推广应用到工业生产中，产生更大的经济效益。得到的辅酶q10可以用于医药保健品的加工制作，类胡萝卜素和菌绿素可以作为食用色素的添加剂，5-ala可以作为绿色除草剂和光动力剂，蛋白质可以作为保健品和饲料添加剂的原料、泡沫灭火剂等，具有显著的经济和社会效益。

附图说明

图1为本工艺技术路线图。

图2为本方法得到的每种高价值物质含量以及与每种物质单独提取效果对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。下述实施例中所用改良的ehrlich试剂按照如下方法配制而得：50ml量筒中，依次加入30ml冰醋酸，1g对二甲基氨基苯甲醛，8ml70％高氯酸，溶解后用冰醋酸稀释至50ml，混匀。盛于棕色瓶，保存于冰箱中，现配现用。

实施例1、从光合细菌中逐级提取辅酶q10、类胡萝卜素、菌绿素、5-ala和蛋白质

1)将光合细菌菌液在9000r/min下离心10分钟，弃去上清液，并用去离子水清洗2～3次，收集菌体沉淀，加入丙酮(71.74ml/gdcw)，用超声波细胞破碎仪破碎细胞，破碎条件为：超声功率400w，超声温度10℃，工作2s间隔1s，超声时间5min；

2)辅酶q10的提取：

在摇床内25℃下振荡40min，转速120r/min；

取上清液用比色法检测辅酶q10含量；

用紫外分光光度计在473nm波长下检测类胡萝卜素吸光度，771nm波长下检测菌绿素吸光度；用改良的ehrlich试剂检测5-ala含量，得到辅酶q10含量为84.4mg/g，类胡萝卜素浓度为1.132mg/l，菌绿素浓度为0.997mg/l、5-ala含量为2.145mg/g；

3)类胡萝卜素和菌绿素的提取：

收集步骤2)提取所得体系的下层菌液，补充丙酮和甲醇，使丙酮：甲醇＝7:2(v:v)，并在40℃下静置1小时；下层菌液与提取溶剂的体积比为2:1；

取上清液用紫外分光光度计在473nm波长下检测类胡萝卜素吸光度，在771nm波长下检测菌绿素吸光度,得到类胡萝卜素浓度为3.704mg/l，菌绿素浓度为1.176mg/l、5-ala含量为2.224mg/g；

4)5-ala的提取：用去离子水清洗步骤3)提取所得体系的下层菌液，加入乙酸钠缓冲液(1mol/l，ph4.6)，菌液：乙酸钠缓冲液＝10:1(v:v)和乙酰丙酮，菌液：乙酰丙酮＝40:1(v:v)，混匀，100℃水浴加热30min，冷却至室温后，9000r/min离心5分钟，取上清液用改良的ehrlich试剂检测5-ala吸光度；得到5-ala含量为4.409mg/g；

5)蛋白质的提取：

加入ph为8.0，浓度为10mm的tris-hcl缓冲液，按每g湿菌体加入10ml缓冲液的比例悬浮细胞，重复离心2-3次；向菌体中加入1％的triton-x100和0.1mol/l的nacl，室温下暗中搅拌2小时，之后用保鲜膜封住口，置于4℃冰箱中过夜进行增溶膜蛋白；将过夜增溶膜蛋白的溶液加入离心管中配平，9000r/min离心30min，收集上清液。在收集到的上清液中加入60％的硫酸铵溶液，之后放入4℃冰箱中静置1min，静置后的溶液9000r/min离心30min，收集上清浮质，并将其溶解于10mm，ph8.0的tris-hcl缓冲液中，得到蛋白粗提物；

再将所得蛋白粗提物置于透析袋中密封，透析袋置于盛有10mm，ph8.0的tris-hcl缓冲液的大烧杯中过夜透析，经过2-3次透析后，即可得到纯化的蛋白质；

用紫外分光光度计在280nm处测定蛋白质的吸光度，用经验公式计算蛋白质浓度，得到蛋白质含量为335.868mg/g。

图2为本方法得到的每种高价值物质含量以及与每种物质单独提取效果对比图。由图可知，本实验方法可以实现对光合细菌中辅酶q10的97.4％的有效提取，并且类胡萝卜素和叶绿素提取效果均比单独提取效果提高了100％以上，5-ala提取效果仅占单独提取效果的34.4％，蛋白质提取效果占单独提取效果的75.0％。