本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种dna荧光探针，尤其涉及一种能够同时检测线粒体和dna的荧光探针及其合成方法和应用。
背景技术
生物细胞内存在着各种各样的细胞器，它们有着特殊的生理功能，对生命过程起着至关重要的作用。线粒体是众多的细胞器中一个非常重要的动态细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被誉为细胞的“动力工厂”，在细胞生命活动中起着重要的作用。线粒体在细胞生理和稳态中起着至关重要的作用。线粒体功能障碍会导致固有的凋亡途径，导致各种神经退行性疾病。因此，要进一步了解线粒体功能，就需要在体内成像线粒体。
核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸（简称rna）和脱氧核糖核酸（简称dna），在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。dna是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。
dna是生命遗传的重要物质，生物体中的核酸链包括单链、双链、三螺旋和四链体等多种结构，这些结构之间相互联系、转化，在机体的生长、发育和繁殖等生命过程中起着重要作用，因此dna分子的定量分析、特异识别，对基因组学、病毒学、分子生物学等相关学科的发展具有十分重要的意义。由于生物分子自身的荧光较弱，目前多采用荧光探针法检测。荧光探针法较传统的同位素检测快速，重复性好，用样量少，无辐射，在dna自动测序，抗体免疫分析，疾病诊断，抗癌药物分析等方面己得到广泛应用。同时，dna分子荧光探针在新型抗癌药剂的开发和抗癌机理的研究也早有报道。因此，发展新型结构和功能的dna探针是非常有必要的。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种同时检测线粒体和dna的荧光探针，该探针选择性好、可识别dna和线粒体。
本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种同时检测线粒体和dna的荧光探针，简称bisei，其化学结构式如式（i）所示：
式（i）。
其中，吡啶盐作为线粒体定位基团，通过探针与dna沟槽的嵌合以识别dna分子。
一种上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
（1）4-甲基吡啶和碘乙烷在甲醇中加热回流，反应结束后冷却至室温，蒸干溶剂，所得固体用乙醚洗涤，得化合物1：
（2）对苯二甲醛和化合物1在保护气氛下在无水乙醇中加热回流，反应结束后，乙酸乙酯萃取，萃取液以二氯甲烷:甲醇为淋洗液过硅胶柱，得化合物2：
（3）邻苯二胺和化合物2在n,n-二甲基甲酰胺中，以对甲基苯磺酸为催化剂，加热回流，反应结束后冷却至室温，用水和二氯甲烷进行萃取，二氯甲烷的萃取液以二氯甲烷:甲醇为淋洗液过硅胶柱，得荧光探针：
步骤（1）中，所述4-甲基吡啶与碘甲烷的摩尔比为1:1-1.2。反应时间为12-20h。
步骤（2）中，所述对苯二甲醛与化合物1的摩尔比为1:1-1.2。反应时间为12-20h。
步骤（3）中，所述邻苯二胺与化合物2的摩尔比为1.8-2:1。反应时间为4-6h。
步骤（2）和（3）中，所述淋洗液中二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1。
一种上述荧光探针在检测溶液或细胞中dna的应用。
一种上述荧光探针在检测细胞线粒体中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明的可检测线粒体和dna的荧光探针是一种新型的识别dna并能够定位线粒体的荧光探针分子，该探针合成路径简便，易于应用。可以识别dna，实现检测dna的作用，并可以定位在线粒体。
附图说明
图1是化合物1的1hnmr图谱；
图2是化合物2的1hnmr图谱；
图3是荧光探针bisei的1hnmr图谱；
图4是荧光探针bisei对活细胞成像图像；
图5是荧光探针bisei对cccp处理后活细胞成像图像；
图6是荧光探针bisei对固定细胞成像图像；
图7是荧光探针bisei与商业探针mtdr对线粒体的共定位荧光成像。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1rna荧光探针bisei的合成
（1）将1.0g(10.7mmol)的4-甲基吡啶，溶于20ml甲醇中，将碘乙烷2.5ml(10.7mmol)滴加至混合液中，加热回流15h，反应体系由淡黄色变为黄色。反应结束后冷却至室温，将溶剂蒸干，所得固体用乙醚洗涤过滤得到黄色固体即化合物1，其1hnmr图谱见图1：
（2）将0.65g(5mmol)对苯二甲醛，0.63g化合物1溶于20ml无水乙醇中。在氮气保护下加热回流15h，反应体系变为黄色。反应结束后，乙酸乙酯萃取，用二氯甲烷：甲醇（10:1）淋洗液过柱提纯得黄色固体即化合物2，其1hnmr图谱见图2：
（3）将1.2g(11.0mmol)的邻苯二胺和2.0g（5.5mmol）的化合物2以及0.9g的对甲基苯磺酸用5ml的n,n-二甲基甲酰胺溶解，加热回流4h。反应结束后冷却至室温，用水和二氯甲烷进行萃取，用二氯甲烷：甲醇（10:1）淋洗液过柱提纯得黄色固体即荧光探针，其1hnmr图谱见图3：
实施例2荧光探针bisei对活细胞的荧光成像
配制实施例1中制备的荧光探针bisei的dmf母液，浓度为1mm。再取2μl母液用培养基稀释至1ml，得终浓度为2μm的探针稀释液。
将接种好的细胞在探针稀释液中37℃孵育30min，用pbs洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像（激发波长404nm，发射波段570-620nm），结果如图4所示：荧光探针bisei能够染色活细胞的细胞质，发出红色荧光。
实施例3荧光探针bisei对cccp处理后活细胞的荧光成像
配制实施例1中制备的荧光探针bisei的dmf母液，浓度为1mm。再取2μl母液用培养基稀释至1ml，得终浓度为2μm的探针稀释液。
将接种好的细胞在探针稀释液中37℃孵育30min，用pbs洗3次；再加入细胞凋亡诱导剂cccp（羰基氰化物间氯苯腙）使终浓度为20μm，处理20min后，用pbs洗3次；贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像（激发波长404nm，发射波段570-620nm），结果如图5所示：与图4相比，用cccp处理活细胞后，细胞内的红色荧光明显变弱。
实施例4荧光探针bisei对固定细胞的荧光成像
配制实施例1中制备的荧光探针bisei的dmf母液，浓度为1mm。再取2μl母液用培养基稀释至1ml，得终浓度为2μm的探针稀释液。
将接种好的细胞用1ml多聚甲醛处理30min后用pbs洗3次，然后用0.5ml5%的tritontmx-100处理3min，最后在探针稀释液中室温孵育30min，用pbs洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像（激发波长404nm，发射波段570-620nm），结果如图6所示：荧光探针bisei能够染色固定细胞的细胞核，发出红色荧光。
实施例5荧光探针bisei与商业探针mtdr定位于线粒体的荧光成像
配制实施例1中制备的荧光探针bisei的dmf母液，浓度为1mm。再取2μl母液用培养基稀释至1ml，得终浓度为2μm的探针稀释液。
商业探针mtdr配制为1mm的dmf母液。再取1μl母液用培养基稀释成终浓度为1μm的探针稀释液。
分别将接种好的细胞在两种探针稀释液中37℃孵育30min，用pbs洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像（bisei激发波长404nm，发射波段500-550nm；mtdr激发波长647nm，发射波段663-735nm），结果如图7所示，其中第一行分别为探针bisei、探针mtdr、两探针叠加的成像图，第二行为bisei与mtdr的强度对比图和箭头处的强度分布图。根据图7可知：商业探针mtdr能够定位线粒体中，发出红色荧光；荧光探针bisei能够在线粒体中发出绿色荧光；两者的共定位系数达0.9，说明探针bisei能够成功定位于线粒体中。