一种植物肽在制备提高皮肤弹性的保健品中的应用的制作方法

本发明涉及一种提高皮肤弹性的保健品，该保健品可以提高皮肤弹性。
背景技术：
皮肤老化所造成的以皱纹为典型代表的各种损美性表现是当今皮肤科学的研究热点，皮肤老化与抗衰老是当今皮肤科学的研究热点。弹性下降是皮肤老化的重要指标，弹性评估是护肤品抗皱功效评价的重要方面。目前，国内外化妆品市场上抗皱产品种类繁多，在使用方法上主要以局部外用为主，功效成分经皮吸收后发挥抗皱作用。鉴于皮肤组织致密的“砖墙结构”，只有分子量小于3000da以下的分子才能透皮吸收，外用的化妆品见效缓慢且效果不佳。保健品可以内服通过血液循环到达皮肤组织，疗效要优于外用的化妆品。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种植物肽在制备提高皮肤弹性的保健品中的应用。本发明上述目的通过如下技术方案实现：一种多肽，由如下步骤制备得到：步骤s1，酶解：将桂竹糖芥种子粉碎，过50目筛，按照1kg细粉加5l蒸馏水的比例分散于蒸馏水中，再按照细粉重量百分含量0.46％的比例加入酶活为50ku/g的胰蛋白酶，酶解条件为：ph值，8.0；酶解温度，37℃；酶解时间，6小时；酶解结束后，沸水浴使胰蛋白酶灭活，冷却至常温，12000rpm离心15分钟，收集上清液，冷冻干燥得胰蛋白酶酶解冻干粉。步骤s2，分离纯化：将胰蛋白酶酶解冻干粉用蒸馏水溶解，用截留分子量为8000～10000d的透析袋透析24h，透析液浓缩后上样于deae-32纤维素离子交换层析柱纯化，方法为：将deae-32悬浮于50mmol/l、ph值8.0tris-hcl缓冲液中，自然沉降法装柱，平衡后备用；透析液浓缩液上样，依次用含0.2mol/l、0.4mol/lnacl的平衡缓冲液各洗脱10个柱体积，收集0.4mol/lnacl洗脱液，脱盐，浓缩、冷冻干燥得多肽y-pp4。优选地，步骤s2中deae-32纤维素离子交换层析柱的柱床体积为3×45cm。优选地，步骤s2中deae-32纤维素离子交换层析柱的上样体积为2ml。优选地，步骤s2中洗脱流速为0.8ml/min。优选地，步骤s2中脱盐方法为：用截留分子量为8000～10000d的透析袋透析12h。上述多肽在制备提高皮肤弹性的保健品方面的应用。i型胶原蛋白占全部胶原的80-90％，具有活化上皮细胞，维持皮肤张力和弹性的功能。前胶原是胶原的前体，其表达量能反映成熟胶原的合成的水平。mmps是机体内唯一能降解纤维类胶原的酶类，mmp-2是此家族的重要成员，几乎能降解细胞外基质中的各类蛋白质，mmp-2活性增加会加快细胞外基质降解，破坏组织结构。有研究表明，抑制mmps活性能增加胶原蛋白合成。timps是mmps的组织抑制剂，能结合有活性或无活性的mmps，使其失去活性，减少细胞外基质的降解。timp-2是mmp-2的特异性抑制因子，参与mmp-2活性的调节。研究结果表明，本发明方法制备得到的多肽m-pp2、m-pp6、y-pp2、y-pp4可以提高i型胶原蛋白的表达，降低mmp-2的表达，并提高mmp-2抑制剂timp-2的表达水平。因此多肽m-pp2、m-pp6、y-pp2、y-pp4可以用于提高皮肤弹性。附图说明图1为m-pp2、m-pp4、m-pp6、y-pp2、y-pp4、y-pp6对i型前胶原蛋白基因表达影响；图2为m-pp2、m-pp4、m-pp6、y-pp2、y-pp4、y-pp6对mmp-2基因表达的影响；图3为m-pp2、m-pp4、m-pp6、y-pp2、y-pp4、y-pp6对timp-2基因表达的影响。具体实施方式下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。一、实验材料桂竹糖芥种子采集自黑龙江省绥化市，经鉴定为十字花科二年生草本植物桂竹糖芥(erysimumcheiranthoides)的种子。晒干后备用。木瓜蛋白酶(80ku/g)购自南宁庞博生物工程；胰蛋白酶(50ku/g)购自sigma。透析袋(8000～10000d)购自美国sigma公司。二、实验方法1、桂竹糖芥种子的制备步骤s1，酶解：将桂竹糖芥种子粉碎，过50目筛，按照1kg细粉加5l蒸馏水的比例分散于蒸馏水中，再按照细粉重量百分含量0.52％的比例加入酶活为80ku/g的木瓜蛋白酶，酶解条件为：ph值，6.2；酶解温度，52℃；酶解时间，5小时；酶解结束后，沸水浴使木瓜蛋白酶灭活，冷却至常温，12000rpm离心15分钟，收集上清液，冷冻干燥得木瓜蛋白酶酶解冻干粉；将桂竹糖芥种子粉碎，过50目筛，按照1kg细粉加5l蒸馏水的比例分散于蒸馏水中，再按照细粉重量百分含量0.46％的比例加入酶活为50ku/g的胰蛋白酶，酶解条件为：ph值，8.0；酶解温度，37℃；酶解时间，6小时；酶解结束后，沸水浴使胰蛋白酶灭活，冷却至常温，12000rpm离心15分钟，收集上清液，冷冻干燥得胰蛋白酶酶解冻干粉；步骤s2，分离纯化：将木瓜蛋白酶酶解冻干粉用蒸馏水溶解，用截留分子量为8000～10000d的透析袋透析24h，透析液浓缩后上样于deae-32纤维素离子交换层析柱纯化，方法为：将deae-32悬浮于50mmol/l、ph值8.0tris-hcl缓冲液中，自然沉降法装柱，柱床体积为3×45cm，平衡后备用；透析液浓缩液上样2ml，依次用含0.2mol/l、0.4mol/l、0.6mol/lnacl的平衡缓冲液各洗脱10个柱体积，流速0.8ml/min，分别收集不同浓度洗脱液，用截留分子量为8000～10000d的透析袋透析12h脱盐，浓缩、冷冻干燥得多肽m-pp2、m-pp4、m-pp6；将胰蛋白酶酶解冻干粉用蒸馏水溶解，用截留分子量为8000～10000d的透析袋透析24h，透析液浓缩后上样于deae-32纤维素离子交换层析柱纯化，方法为：将deae-32悬浮于50mmol/l、ph值8.0tris-hcl缓冲液中，自然沉降法装柱，柱床体积为3×45cm，平衡后备用；透析液浓缩液上样2ml，依次用含0.2mol/l、0.4mol/l、0.6mol/lnacl的平衡缓冲液各洗脱10个柱体积，流速0.8ml/min，分别收集不同浓度洗脱液，用截留分子量为8000～10000d的透析袋透析12h脱盐，浓缩、冷冻干燥得多肽y-pp2、y-pp4、y-pp6。2、皮肤弹性提高实验将70只体重为30-35g的6周龄昆明种小白鼠单笼饲养，自由饮食。每天7:00-19:00给予光照，其余时间给予黑暗。动物房温度为23-25℃。小鼠随机分成10只/组(对照组和m-pp2、m-pp4、m-pp6、y-pp2、y-pp4、y-pp6给药组)，对照组每日灌胃pbs，m-pp2、m-pp4、m-pp6、y-pp2、y-pp4、y-pp6给药组每日灌胃m-pp2、m-pp4、m-pp6、y-pp2、y-pp4、y-pp6的pbs溶液0.50g/kgbw，持续灌胃6周。最后一次灌胃6小时后，处死小鼠取其皮肤并立即用trizol试剂(美国invitrogen公司)将小鼠皮肤总rna提取出来后，再反转录成cdna。各样品设3复孔，采用表1所示的引物并按如下反应程序进行qpcr：(1)预变性：95℃，3min；(2)变性：95℃，5s；(3)退火延伸：56.3℃(i型前胶原蛋白：54.9℃；mmp-2：53.2℃；timp-2：57.5℃)，30s；总共40个循环。采用2-δδct法计算皮肤弹性相关基因的mrna相对表达量。表1皮肤弹性相关基因的引物3、统计学方法数据统计及分析采用spss19.0，组间分析比较采用one-wayanova，以均数±标准差表示；实时荧光定量pcr数据分析及绘图采用graphpadprism6。p<0.05差异显著。三、实验结果m-pp2、m-pp4、m-pp6、y-pp2、y-pp4、y-pp6对i型前胶原蛋白、mmp-2、timp-2基因表达的影响如表2和图1～3所示。表2对i型前胶原蛋白、mmp-2、timp-2基因表达的影响相对表达量i型前胶原蛋白mmp-2timp-2对照组1.001.001.00m-pp22.77±0.070.54±0.061.95±0.08m-pp41.03±0.081.07±0.071.02±0.08m-pp62.63±0.060.59±0.061.91±0.07y-pp22.85±0.090.52±0.081.83±0.09y-pp42.59±0.080.55±0.072.03±0.07y-pp61.01±0.070.98±0.071.05±0.09i型胶原蛋白占全部胶原的80-90％，具有活化上皮细胞，维持皮肤张力和弹性的功能。前胶原是胶原的前体，其表达量能反映成熟胶原的合成的水平。mmps是机体内唯一能降解纤维类胶原的酶类，mmp-2是此家族的重要成员，几乎能降解细胞外基质中的各类蛋白质，mmp-2活性增加会加快细胞外基质降解，破坏组织结构。有研究表明，抑制mmps活性能增加胶原蛋白合成。timps是mmps的组织抑制剂，能结合有活性或无活性的mmps，使其失去活性，减少细胞外基质的降解。timp-2是mmp-2的特异性抑制因子，参与mmp-2活性的调节。研究结果表明，本发明方法制备得到的多肽m-pp2、m-pp6、y-pp2、y-pp4可以提高i型胶原蛋白的表达，降低mmp-2的表达，并提高mmp-2抑制剂timp-2的表达水平。因此多肽m-pp2、m-pp6、y-pp2、y-pp4可以用于提高皮肤弹性。上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。当前第1页12