一种鉴定香炉山鸡隐性白羽和有色羽纯合的引物及其应用的制作方法

本发明涉及一种鉴定香炉山鸡隐性白羽和有色羽纯合的引物及其应用，属于基因分子鉴定
技术领域：
。
背景技术：
香炉山鸡系凯里地区苗族人民从中原迁徙到西南后，在香炉山当地长期封闭的自然条件下形成的原始鸡种。母鸡主翼羽有片状黑色羽毛，尾部有黑色羽，大部分羽毛似葵花状，公鸡背部羽毛为棕红色，尾羽黑色并带绿色光泽。在香炉山鸡育种中，群体中有白羽鸡出现，育种发现它是一种隐性白羽，由于其与有色羽纯合鸡杂交不改变羽色，因此导致育种中淘汰比例大，选育进展慢。在中国，消费者对羽色有一定偏好，因而在香炉山鸡的纯种选育中建立隐性白羽纯合与有色羽纯合群尤为重要。常规鉴定隐性白羽纯合与有色羽纯合的方法是利用测交手段，将有色羽个体与隐性白羽纯合鸡进行交配观察后代个体羽色情况。一般用白羽母鸡与有色羽公鸡交配，要连续几个世代淘汰杂合子公鸡，来逐步降低群体内杂合子基因型频率，常常耗费数年也不能彻底淘汰杂合子个体，因此有必要建立纯合群。分子标记辅助育种较之常规育种方法，成本低廉、准确度高、省时省力，能有效缩短育种周期，加快纯种育种进展。隐性白羽形成的分子机制是：隐性白羽的形成是由于tyr（络氨酸酶基因）第四内含子区域插入了一段长7.7kp的内源性白血病病毒alv序列，导致tyr基因转录物中缺少第五外显子编码的跨膜结构域无法正常转录。从而使络氨酸酶失去正常功能活性，致使无法合成黑色素，导致鸡白羽的形成。许多研究报告表明tyr基因第四内含子中alv插入序列导致白羽的基因型cc（隐性白羽）能够作为隐性白羽的有效分子遗传标记。技术实现要素：本发明的目的在于，提供一种鉴定香炉山鸡隐性白羽和有色羽纯合的引物及其应用。本发明的引物具有能够快速、准确鉴定香炉山鸡有色羽纯合、隐性纯合个体的特点。本发明的技术方案：一种鉴定香炉山鸡隐性白羽和有色羽纯合的引物，所述引物为2对共3条，2条上游引物分别为f1、f2，1条下游引物r，上游引物f1与下游引物r为tyr基因alv插入序列引物,上游引物f2与下游引物r为tyr基因非插入序列引物，其中，上游引物的引物序列f1为：5'cgttaagcgagacggatgagg3'，上游引物f2的引物序列为：5'aagttgttggaggctgggtat3'；下游引物r的引物序列为:5'aggcacaaggagtgggacagc3'。一种根据权利要求1所述的鉴定香炉山鸡隐性白羽和有色羽纯合的引物的应用，是用于鉴别香炉山鸡隐性白羽纯合和有色羽纯合。前述的鉴定香炉山鸡隐性白羽和有色羽纯合的引物的应用，其应用方法包括如下步骤：1）以待检测鸡的基因组dna为模板，用f1引物和r引物扩增tyr基因白羽等位基因c,用f2引物和r引物扩增tyr基因有色羽等位基因c；2）通过引物组在同一pcr体系进行扩增反应，获得pcr扩增产物，根据pcr扩增产物在120v电压的0.5-1.5%琼脂糖凝胶中电泳20-40分钟；3）结束后,用凝胶成像系统对琼脂糖凝胶拍照,得出电泳图谱结果进行判型：如果只能够得到785bp的条带，则待测鸡的等位基因型为cc型隐性白羽纯合型；如果只能够得到1060bp的条带，则待测鸡的等位基因型为cc有色羽纯合型；如果同时得到785bp和1060bp的两条带，则待测鸡的等位基因型为cc有色羽杂合型。前述的鉴定香炉山鸡隐性白羽和有色羽纯合的引物的应用，=步骤2）中，所述pcr扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸35s，35个循环，72℃终延伸10min，4℃保存。前述的鉴定香炉山鸡隐性白羽和有色羽纯合的引物的应用，=步骤2）中，所述pcr扩增反应的体系为上游引物f12μl，上游引物f22μl；下游引物r2μl，2×pcrtaqmix12μl，ddh2o10μl，模板dna2μl，总反应为30μl体系。前述的鉴定香炉山鸡隐性白羽和有色羽纯合的引物的应用，步骤2）中，所述琼脂糖凝胶为1%的琼脂糖凝胶；所述电泳的时间为30分钟。本发明的有益效果本发明通过引物设计合成的2对3条引物进行多重pcr扩增，对tyr基因白羽等位基因与有色羽等位基因进行扩增，从实验中得到鸡tyr基因隐性白羽纯合与有色羽纯合。并通过琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物进行鉴定待测鸡tyr基因隐性白羽纯合和有色羽纯合。通过这样的方法可以快速、准确的鉴别香炉山鸡隐性白羽纯合和有色羽纯合。因此，tyr基因隐性白羽基因型cc和有色羽基因型cc能够作为香炉山鸡隐性纯合和有色羽纯合的有效分子遗传标记。附图说明附图1为本发明实施例4得出电泳图谱；附图2为含插入序列测序图；附图3为未含插入序列测序图。附图4为tyr基因有色羽等位基因扩增产物测序结果与目的片段序列对比；附图5为tyr基因隐性白羽等位基因扩增产物测序结果与目的片段序列对比。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。本发明的实施例实施例1：一种鉴定香炉山鸡隐性白羽和有色羽纯合的引物，所述引物为2对共3条，2条上游引物分别为f1、f2，1条下游引物r，上游引物f1与下游引物r为tyr基因alv插入序列引物,上游引物f2与下游引物r为tyr基因非插入序列引物，其中，上游引物的引物序列f1为：5'cgttaagcgagacggatgagg3'，上游引物f2的引物序列为：5'aagttgttggaggctgggtat3'；下游引物r的引物序列为:5'aggcacaaggagtgggacagc3'。上述的鉴定香炉山鸡隐性白羽和有色羽纯合的引物的应用，是用于鉴别香炉山鸡隐性白羽纯合和有色羽纯合，其应用方法包括如下步骤：1）以待检测鸡的基因组dna为模板，用f1引物和r引物扩增tyr基因白羽等位基因c,用f2引物和r引物扩增tyr基因有色羽等位基因c；2）通过引物组在同一pcr体系进行扩增反应，扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸35s，35个循环，72℃终延伸10min，4℃保存，扩增反应的体系为上游引物f12μl，上游引物f22μl；下游引物r2μl，2×pcrtaqmix12μl，ddh2o10μl，模板dna2μl，总反应为30μl体系，从而获得pcr扩增产物，根据pcr扩增产物在120v电压的1%琼脂糖凝胶中电泳30分钟；3）结束后,用凝胶成像系统对琼脂糖凝胶拍照,得出电泳图谱结果进行判型：如果只能够得到785bp的条带，则待测鸡的等位基因型为cc型隐性白羽纯合型；如果只能够得到1060bp的条带，则待测鸡的等位基因型为cc有色羽纯合型；如果同时得到785bp和1060bp的两条带，则待测鸡的等位基因型为cc有色羽杂合型。实施例2：一种鉴定香炉山鸡隐性白羽和有色羽纯合的引物，所述引物为2对共3条，2条上游引物分别为f1、f2，1条下游引物r，上游引物f1与下游引物r为tyr基因alv插入序列引物,上游引物f2与下游引物r为tyr基因非插入序列引物，其中，上游引物的引物序列f1为：5'cgttaagcgagacggatgagg3'，上游引物f2的引物序列为：5'aagttgttggaggctgggtat3'；下游引物r的引物序列为:5'aggcacaaggagtgggacagc3'。上述的鉴定香炉山鸡隐性白羽和有色羽纯合的引物的应用，是用于鉴别香炉山鸡隐性白羽纯合和有色羽纯合，其应用方法包括如下步骤：1）以待检测鸡的基因组dna为模板，用f1引物和r引物扩增tyr基因白羽等位基因c,用f2引物和r引物扩增tyr基因有色羽等位基因c；2）通过引物组在同一pcr体系进行扩增反应，扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸35s，35个循环，72℃终延伸10min，4℃保存，扩增反应的体系为上游引物f12μl，上游引物f22μl；下游引物r2μl，2×pcrtaqmix12μl，ddh2o10μl，模板dna2μl，总反应为30μl体系，从而获得pcr扩增产物，根据pcr扩增产物在120v电压的0.5%琼脂糖凝胶中电泳20分钟；3）结束后,用凝胶成像系统对琼脂糖凝胶拍照,得出电泳图谱结果进行判型：如果只能够得到785bp的条带，则待测鸡的等位基因型为cc型隐性白羽纯合型；如果只能够得到1060bp的条带，则待测鸡的等位基因型为cc有色羽纯合型；如果同时得到785bp和1060bp的两条带，则待测鸡的等位基因型为cc有色羽杂合型。实施例3：一种鉴定香炉山鸡隐性白羽和有色羽纯合的引物，所述引物为2对共3条，2条上游引物分别为f1、f2，1条下游引物r，上游引物f1与下游引物r为tyr基因alv插入序列引物,上游引物f2与下游引物r为tyr基因非插入序列引物，其中，上游引物的引物序列f1为：5'cgttaagcgagacggatgagg3'，上游引物f2的引物序列为：5'aagttgttggaggctgggtat3'；下游引物r的引物序列为:5'aggcacaaggagtgggacagc3'。上述的鉴定香炉山鸡隐性白羽和有色羽纯合的引物的应用，是用于鉴别香炉山鸡隐性白羽纯合和有色羽纯合，其应用方法包括如下步骤：1）以待检测鸡的基因组dna为模板，用f1引物和r引物扩增tyr基因白羽等位基因c,用f2引物和r引物扩增tyr基因有色羽等位基因c；2）通过引物组在同一pcr体系进行扩增反应，扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸35s，35个循环，72℃终延伸10min，4℃保存，扩增反应的体系为上游引物f12μl，上游引物f22μl；下游引物r2μl，2×pcrtaqmix12μl，ddh2o10μl，模板dna2μl，总反应为30μl体系，从而获得pcr扩增产物，根据pcr扩增产物在120v电压的1.5%琼脂糖凝胶中电泳40分钟；3）结束后,用凝胶成像系统对琼脂糖凝胶拍照,得出电泳图谱结果进行判型：如果只能够得到785bp的条带，则待测鸡的等位基因型为cc型隐性白羽纯合型；如果只能够得到1060bp的条带，则待测鸡的等位基因型为cc有色羽纯合型；如果同时得到785bp和1060bp的两条带，则待测鸡的等位基因型为cc有色羽杂合型。实施例4：以包含tyr基因的待测鸡全基因组dna为模板，设计特异性的引物对鸡tyr基因第四内含子中是否存在插入alv序列进行pcr扩增，将pcr扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶进行（电压为120v，电泳25分钟）电泳,电泳结束后,用凝胶成像系统对琼脂糖凝胶进行照相,得出电泳图谱进行判型，结果如图1。具体方法如下：（1）特异性引物的设计：以ncbi公布的（genbank:dq118701.1）tyr基因第四内含子序列含alv插入序列结合（genbank:dq118702.1）tyr第四内含子未含插入序列作为参考，利用引物设计软件primer5.0和oligo6.0进行多重pcr引物设计。tyr基因第四内含子中含插入alv片段扩增序列引物为：上游引物f1：5'cgttaagcgagacggatgagg3'（序列表中的序列1）下游引物r：5'aggcacaaggagtgggacagc3'（序列表中的序列3）其扩增片段长度为785bp；tyr基因第四内含子中未插入片段扩增序列引物为：上游引物f2：5'aagttgttggaggctgggtat3'（序列表中的序列2）下游引物r:5'aggcacaaggagtgggacagc3'（序列表中的序列3）其扩增片段长度为1060bp。（2）鸡样本的采集：以100只香炉山鸡有色羽70只、白羽30只作为检测对象。表1实验材料品种有色羽只数白羽只数样品名称样品来源采样方式香炉山鸡7030血样贵州省黔东南畜牧局联合养殖场翅下静脉釆血0.8-1.2μl（3）鸡血样基因组dna的提取①将放于-20℃冰箱中的血样置于室温融化，取其沉淀部位8μl移至1.5ml离心管中，加入200μlga缓冲液。②加入20μlproteinasek溶液，混匀。③加入300μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，放置在70℃的水浴锅中水浴10min，离心管中溶液应变清亮，如果未变清亮可以适当延长时间使之溶解，之后短暂离心以去除管盖内壁的水珠。④加入200μl无水乙醇，充分震荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管壁的水珠。⑤将上一步所得液体和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中，吸附柱放在收集管中，置于12000r/min4℃冷冻离心30sec，倒掉收集管中的废弃液，将吸附柱cb3放回收集管中。⑥向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，置于12000r/min4℃冷冻离心30sec倒掉收集管中的废弃液，将吸附柱cb3放回收集管中。⑦向吸附柱cb3中加入600μl洗漂液pw，置于12000r/min4℃冷冻离心30sec倒掉收集管中的废弃液，将吸附柱cb3放回收集管中。⑧重复操作步骤7。⑨将吸附柱cb3放回收集管中，置于12000r/min4℃冷冻离心2min，倒掉收集管中的废弃液，将吸附柱cb3放置在室温下数分钟，以彻底晾干吸附柱中残留的洗漂液。⑩将吸附柱cb3转入到一个干净的离心管中，向吸附柱的正中央悬空滴入50-200μl洗脱缓冲液te，放于室温2-5min,之后置于12000r/min4℃冷冻离心2min，将dna溶液收集到离心管中。（4）pcr扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸35s，35个循环，72℃终延伸10min，4℃保存。反应体系为：上游引物f1加入2μl，上游引物f2加入2μl；下游引物r加入2μl，2×pcrtaqmix加入12μl，ddh2o加10μl，模板dna加2μl，总反应为30μl体系。（5）pcr扩增产物的检测及结果判定取5ul扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶进行（电压为120v，电泳25分钟）电泳,电泳结束后,用凝胶成像系统对琼脂糖凝胶进行照相,得出电泳图谱进行判型：如果只能够得到785bp的条带，则待测鸡等位基因型为cc型隐性白羽纯合型；如果只能够得到1060bp的条带，则待测鸡的等位基因型为cc有色羽纯合型；如果同时得到785bp和1060bp的两条带，则待测鸡的等位基因型为cc有色杂合型，凝胶电泳检测结果见附图中的图1。（6）扩增产物测序结果与目的片段序列对比tyr基因有色羽等位基因扩增产物测序结果与目的片段序列对比，如附图4所示：说明：测序结果与目的片段序列相似度为96%。tyr基因隐性白羽等位基因扩增产物测序结果与目的片段序列对比，如附图5所示：说明：测序结果与目的片段序列相似度为95%。（7）待测鸡检测结果统计如表2表2有色羽采样白羽采样有色羽纯合白羽纯合有色羽杂合70只30只22只30只48只70%30%22%30%48%将pcr扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行pcr产物直接测序，得到761bp的tyr基因第四内含子有插入alv产物序列与1031bp的tyr基因第四内含子未含插入产物序列测序结果；并将测序结果放在ncbi上，与其目的序列进行对比，从中得出tyr第四内含子有alv插入序列测序结果与其目的序列的相似度为95%，tyr基因第四内含子无alv插入序列测序结果与其目的序列的相似度为96%，并通过（5）所述可以初步断定所得pcr产物序列为目的片段。上述对本发明的具体实施方式进行详细阐述，旨在说明本发明可以给本领域专业技术人员提供参考和使用，但需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。同时，任何符合本权利要求书或说明书描述的内容，符合本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。sequencelisting序列表<110>贵州大学<120>一种鉴定香炉山鸡隐性白羽与有色羽纯合的引物及其应用<130>nm:<160>3<170>patentinversion3.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>以ncbi公布的（genbank:dq118701.1）tyr基因第四内含子序列含alv插入序列结合（genbank:dq118702.1）tyr第四内含子未含插入序列作为参考，利用引物设计软件primer5.0和oligo6.0进行多重pcr引物设计。<400>1cgttaagcgagacggatgagg21<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>以ncbi公布的（genbank:dq118701.1）tyr基因第四内含子序列含alv插入序列结合（genbank:dq118702.1）tyr第四内含子未含插入序列作为参考，利用引物设计软件primer5.0和oligo6.0进行多重pcr引物设计。<400>2aagttgttggaggctgggtat21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>以ncbi公布的（genbank:dq118701.1）tyr基因第四内含子序列含alv插入序列结合（genbank:dq118702.1）tyr第四内含子未含插入序列作为参考，利用引物设计软件primer5.0和oligo6.0进行多重pcr引物设计。<400>3aggcacaaggagtgggacagc21序列表<110>贵州大学<120>一种鉴定香炉山鸡隐性白羽与有色羽纯合的引物及其应用<130>nm:<160>3<170>patentinversion3.0<120>一种鉴定香炉山鸡隐性白羽与有色羽纯合的引物及其应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列()<220>当前第1页12