三十四碳-（20,23）-二烯酸的提取方法及其应用与流程

本发明属于医药应用技术领域，具体涉及三十四碳-(20,23)-二烯酸的提取方法及其应用。

背景技术：

文献记载，在银柴胡中能够分离得到三十四碳-(20,23)-二烯酸，然而，对三十四碳-(20,23)-二烯酸的药效以及如何从中药材银柴胡中富集提取三十四碳-(20,23)-二烯酸化合物的研究却鲜有报道，现有技术中，从银柴胡中提取分离三十四碳-(20,23)-二烯酸的过程复杂，耗时耗力，且不能保证最终目标化合物三十四碳-(20,23)-二烯酸的得到率。这极大的限制了银柴胡尤其是银柴胡中有效组分三十四碳-(20,23)-二烯酸在药用领域的发展。

银柴胡为石竹科植物stellariadichotomal.var.lanceolatabge的干燥根，味甘、微寒，主产于宁夏地区，是宁夏道地药材，目前约有15万亩的种植面积。文献记载银柴胡具有清虚热，除疳热的功能，用于阴虚发热、骨蒸痨热、小儿疳热等症。银柴胡的基础研究始于上世纪六十年代，目前，已从银柴胡中分离鉴定出发现12种甾醇类、18种生物碱类、13种环肽类、17种挥发性物质和5种酚酸类物质。有文献表明，银柴胡在缓解炎症、抗变态反应、抗动脉粥样硬化以及缓解肿瘤细胞恶化方面有着显著的作用。

由于三十四碳-(20,23)-二烯酸含量较少，往往被忽略或者和其他化合物一起被制成混合提取物来研究其医药学性质，这导致在对三十四碳-(20,23)-二烯酸药用价值研究的缺失，不能清楚的表明银三十四碳-(20,23)-二烯酸在治疗病症时的效果以及其表现出的细胞毒性。分离提纯银柴胡中的三十四碳-(20,23)-二烯酸并研究其药用价值将极大推进银柴胡在中药领域的应用。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明公开了一种从银柴胡中提取三十四碳-(20,23)-二烯酸的方法。

本发明还公开了上述方法提供的三十四碳-(20,23)-二烯酸在防治恶性肿瘤中的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种从银柴胡中提取所述三十四碳-(20,23)-二烯酸的方法，包括以下步骤：

预处理：清洗中药材银柴胡，并粉碎，筛选其中60目～100目的粉状颗粒；

提取：取中药材银柴胡，投入实验室用多功能提取罐中，按预定药液比加入75％乙醇水溶液，在预定提取温度下，提取3h；

浓缩：将提取产生的粗液过滤后，在预定浓缩温度下蒸发浓缩，至无醇味；

萃取：对浓缩产生的浓缩液用石油醚在预定萃取比和萃取温度下进行萃取，石油醚萃取相浓缩得石油醚部，石油醚萃余相用二氯甲烷在预定萃取比和萃取温度下进行萃取，二氯甲烷萃取相浓缩得二氯甲烷部，二氯甲烷萃余相用乙酸乙酯在预定萃取比和萃取温度下进行萃取，乙酸乙酯萃取相浓缩得乙酸乙酯部，对乙酸乙酯部依次通过常压层析柱、硅胶柱、ods柱、lh-20凝胶柱色谱及phplc进行分离，除杂后得到三十四碳-(20,23)-二烯酸；

其中，所述步骤“提取”中，预定药液比为1:10，预定提取温度为65℃～90℃；

所述步骤“浓缩”中，预定浓缩温度为55℃～70℃；

所述步骤“萃取”中，预定萃取温度为20℃～40℃，预定萃取比为1:3～1:5。

如上所述方法提取的三十四碳-(20,23)-二烯酸在防治恶性肿瘤中的应用。

由上述技术方案可知，通过对银柴胡清洗粉碎等预处理工作，筛选出60目～100目的银柴胡颗粒，避免由于粒度过大，导致有效组分不能完全从银柴胡中被提取出，避免由于粒度过小，导致银柴胡颗粒水合严重，保证银柴胡有效组分最大程度被提取出。采用恒温的提取环境，使提取状态更加活跃，进一步提高了银柴胡中有效组分的提取效率以及有效组分的得到率。定温的浓缩、定温的萃取以及恒定的萃取比使得保证了提取过程的顺利进行，进一步提高银柴胡中有效组分的提取效率，提高目标化合物三十四碳-(20,23)-二烯酸的得到率。本发明还提供了上述方法制备的三十四碳-(20,23)-二烯酸应用于预防或治疗恶性肿瘤，尤其是应用于预防和治疗胃癌，其有益效果是，通过抗癌特性实验可知，在一定剂量下，三十四碳-(20,23)-二烯酸具有良好的抑制肿瘤细胞生长活性，尤其是在抑制胃癌细胞肿瘤的生长中，表现出相当的抑制活性，抑制率均达到50％以上。

附图说明

图1是三十四碳-(20,23)-二烯酸的基于银柴胡的制备方法流程图。

图2是银柴胡乙酸乙酯部分离流程图。

图3是三十四碳-(20,23)-二烯酸抑制胃癌肿瘤细胞抑制率柱状图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。

三十四碳-(20,23)-二烯酸(n-tetratriacont-20,23-dienoicacid)存在于中药材银柴胡中，其分子式为：c34h64o2，结构式如下：

三十四碳-(20,23)-二烯酸白色粉末，溶于氯仿。

请参看图3，发明人在实验中发现，三十四碳-(20,23)-二烯酸虽在银柴胡中含量较低，但其在抑制肿瘤细胞生长的过程中发挥着积极且有效的作用，实验证明，三十四碳-(20,23)-二烯酸在浓度为5μm～10μm时，具有优秀的抗癌活性，尤其是在作为抑制胃癌肿瘤细胞生长的药物时，其抑制率达到50％，且细胞毒性较弱。

三十四碳-(20,23)-二烯酸在银柴胡中的含量较低，在提取富集过程中，需要从各个方面，不断提高三十四碳-(20,23)-二烯酸的提取效率以及最终的三十四碳-(20,23)-二烯酸的得到率。

请参看图1，在一较佳实施例中，采用恒温提取氛围，采用定温定萃取比的萃取分离氛围，有效的提高了从银柴胡中提取三十四碳-(20,23)-二烯酸的提取效率，也有效的提高了三十四碳-(20,23)-二烯酸的得到率。例如，采用如下的生产工艺流程：

预处理：清洗中药材银柴胡，并粉碎，筛选其中60目～100目的粉状颗粒；

提取：取中药材银柴胡，投入实验室用多功能提取罐中，按预定药液比加入75％乙醇水溶液，在预定提取温度下，提取3h；

浓缩：将提取产生的粗液过滤后，在预定浓缩温度下蒸发浓缩，至无醇味；

萃取：对浓缩产生的浓缩液用石油醚在预定萃取比和萃取温度下进行萃取，石油醚萃取相浓缩得石油醚部，石油醚萃余相用二氯甲烷在预定萃取比和萃取温度下进行萃取，二氯甲烷萃取相浓缩得二氯甲烷部，二氯甲烷萃余相用乙酸乙酯在预定萃取比和萃取温度下进行萃取，乙酸乙酯萃取相浓缩得乙酸乙酯部，对乙酸乙酯部依次通过常压层析柱、硅胶柱、ods柱、lh-20凝胶柱色谱及phplc进行分离，除杂后得到三十四碳-(20,23)-二烯酸；

其中，所述步骤“提取”中，预定药液比为1:10，预定提取温度为65℃～90℃；

所述步骤“浓缩”中，预定浓缩温度为55℃～70℃；

所述步骤“萃取”中，预定萃取温度为20℃～40℃，预定萃取比为1:3～1:5。

作为优选，所述步骤“分离”中，常压层析柱的填料为100目～200目，直径为10cm，以二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，硅胶柱以二氯甲烷-丙酮系统洗脱，ods柱以60～100％甲醇洗脱，phplc流动相为甲醇。

作为优选，所述步骤“提取”中，预定提取温度为75℃。

作为优选，所述步骤“浓缩”中，预定浓缩温度为55℃。

作为优选，所述步骤“萃取”中，预定萃取温度为25℃。

作为优选，所述步骤“萃取”中，预定萃取比萃取液:萃取剂依次分别为1:3、1:3、1:4。

发明人还意外的发现，一定的真空度有益于三十四碳-(20,23)-二烯酸从银柴胡的分离效率，在上述实施例中，发明人选取了65kpaa～95kpaa(表压力，下同)的压力，即6kpaa～36kpaa的真空度来从银柴胡中分离提取三十四碳-(20,23)-二烯酸，三十四碳-(20,23)-二烯酸的最终得到量显著提高，同时，提取效率也得到了有效的提升。

下面通过具体实验过程，详细说明从银柴胡中提取三十四碳-(20,23)-二烯酸的工艺方法以及三十四碳-(20,23)-二烯酸作为抗癌药物的应用。

一、从银柴胡中提取三十四碳-(20,23)-二烯酸

1、取银柴胡共40kg，清洗后进行粉碎，筛选其中60～100目的粉状颗粒，每次3kg加入实验室用多功能提取罐中，加入75％乙醇水溶液30kg(药液比1:10)，在65℃提取温度下进行提取，提取时间为3h/次。

将所有提取完成得到的粗液在55℃浓缩温度下进行浓缩，直至无醇味，所得到的浓缩产物为银柴胡的总提取物。

取上述得到的总提取物部分，首先用石油醚(分析纯度)在25℃萃取温度下进行静置萃取，萃取比(萃取液：萃取剂，下同)为1:3，萃取完成后，萃取相在55℃萃取温度下浓缩得银柴胡的石油醚部；萃余相接着用二氯甲烷(分析纯)在相同萃取温度下进行静置萃取，萃取比为1:3，萃取完成后，萃取相在相同温度下浓缩得银柴胡的二氯甲烷部；萃余相接着用乙酸乙酯(分析纯)在相同温度下进行静置萃取，萃取比为1:4，萃取完成后，萃取相在相同温度下浓缩得银柴胡的乙酸乙酯部；萃余相接着用正丁醇(分析纯)在相同温度下进行静置萃取，萃取比为1:5，萃取完成后，萃取相在相同温度下浓缩得银柴胡的正丁醇部；萃余相在相同温度下浓缩得银柴胡的水部。

将上述过程中得到的银柴胡总提取物、石油醚部、二氯甲烷部、乙酸乙酯部、正丁醇部和水部分别在-4℃环境下冷藏备用。

本实验中，总提取物的浸膏量为2.745kg，总提物的浸膏得率为6.86％。其中，石油醚萃取率1.26％，二氯甲烷萃取率5.02％、乙酸乙酯萃取率1.72％、正丁醇萃取率18.25％。

2、实验1中，取银柴胡共40kg，清洗后进行粉碎，筛选其中60～100目的粉状颗粒，每次3kg加入实验室用多功能提取罐中，加入75％乙醇水溶液30kg(药液比1:10)，在75℃提取温度下进行提取，提取时间为3h/次。其他条件相同。

本实验中，总提取物的浸膏量为2.685kg，总提取物的浸膏得率为6.71％。其中，石油醚萃取率1.24％，二氯甲烷萃取率4.91％、乙酸乙酯萃取率1.59％、正丁醇萃取率17.74％。

3、实验2中，取银柴胡共40kg，清洗后进行粉碎，筛选其中60～100目的粉状颗粒，每次3kg加入实验室用多功能提取罐中，加入75％乙醇水溶液30kg(药液比1:10)，在90℃提取温度下进行提取，提取时间为3h/次。其他条件相同。

本实验中，总提取物的浸膏量为2.606kg，总提取物的浸膏得率为6.52％。其中，石油醚萃取率1.26％，二氯甲烷萃取率4.81％、乙酸乙酯萃取率1.62％、正丁醇萃取率17.83％。

实验1～实验3中，可以清楚的得到，提取温度对银柴胡的总浸膏量有着显著影响，恒温的提取环境，有利于提取溶剂和银柴胡药材颗粒充分反混，提取更加彻底。实验中，我们还发现，恒温的提取氛围有利于提高总浸膏量的收率，但较高温度下，容易产生泡沫，从而影响到实验效率。故而发明人选取提取温度为65℃～90℃，在此状态下，提高实验效率的同时提高了总提取物的浸膏得率，间接地提高了目标化合物三十四碳-(20,23)-二烯酸的收率。

4、实验2中，将所有提取完成得到的粗液在65℃浓缩温度下进行浓缩，直至无醇味，所得到的浓缩产物为银柴胡的总提取物。其他条件不变。

本实验中，总提取物的浸膏量为2.672kg，总提取物的浸膏得率为6.68％。其中，石油醚萃取率1.25％，二氯甲烷萃取率4.90％、乙酸乙酯萃取率1.60％、正丁醇萃取率17.78％。

5、实验4中，将所有提取完成得到的粗液在75℃浓缩温度下进行浓缩，直至无醇味，所得到的浓缩产物为银柴胡的总提取物。其他条件不变。

本实验中，总提取物的浸膏量为2.586kg，总提取物的浸膏得率为6.47％。其中，石油醚萃取率1.20％，二氯甲烷萃取率4.85％、乙酸乙酯萃取率1.55％、正丁醇萃取率17.01％。

6、实验2中，首先用石油醚(分析纯度)在30℃萃取温度下进行静置萃取，萃取比为1:3，萃取完成后，萃取相在55℃浓缩温度下浓缩得银柴胡的石油醚部；萃余相接着用二氯甲烷(分析纯)在相同萃取温度下进行静置萃取，萃取比为1:3，萃取完成后，萃取相在相同温度下浓缩得银柴胡的二氯甲烷部；萃余相接着用乙酸乙酯(分析纯)在相同温度下进行静置萃取，萃取比为1:4，萃取完成后，萃取相在相同温度下浓缩得银柴胡的乙酸乙酯部；萃余相接着用正丁醇(分析纯)在相同温度下进行静置萃取，萃取比为1:5，萃取完成后，萃取相在相同温度下浓缩得银柴胡的正丁醇部；萃余相在相同温度下浓缩得银柴胡的水部。其他条件不变。

本实验中，总提取物的浸膏量为2.674kg，总提取物的浸膏得率为6.69％。其中，石油醚萃取率1.15％，二氯甲烷萃取率4.60％、乙酸乙酯萃取率1.50％、正丁醇萃取率17.63％。

7、实验6中，首先用石油醚(分析纯度)在40℃萃取温度下进行静置萃取，萃取比为1:3，萃取完成后，萃取相在55℃浓缩温度下浓缩得银柴胡的石油醚部；萃余相接着用二氯甲烷(分析纯)在相同萃取温度下进行静置萃取，萃取比为1:3，萃取完成后，萃取相在相同温度下浓缩得银柴胡的二氯甲烷部；萃余相接着用乙酸乙酯(分析纯)在相同温度下进行静置萃取，萃取比为1:4，萃取完成后，萃取相在相同温度下浓缩得银柴胡的乙酸乙酯部；萃余相接着用正丁醇(分析纯)在相同温度下进行静置萃取，萃取比为1:5，萃取完成后，萃取相在相同温度下浓缩得银柴胡的正丁醇部；萃余相在相同温度下浓缩得银柴胡的水部。其他条件不变。

本实验中，总提取物的浸膏量为2.679kg，总提取物的浸膏得率为6.70％。其中，石油醚萃取率1.12％，二氯甲烷萃取率4.41％、乙酸乙酯萃取率1.23％、正丁醇萃取率16.12％。

实验2～实验7中，可以清楚的得到，浓缩温度、萃取温度以及萃取比对总提物的浸膏得率以及目标化合物三十四碳-(20,23)-二烯酸的收率都有着一定的影响。浓缩温度过低，浓缩过慢，导致实验效率降低，而浓缩温度过高，则会导致银柴胡中的有效组分变质或者随着提取溶剂挥发，从而使目标化合物的收率降低。萃取温度以及萃取比是影响萃取效果的重要因素，过高的萃取温度和萃取比使得目标产物在萃余相中的溶解度增加，过低的萃取温度和萃取比导致萃取效率缓慢，且不能完全实现对目标产物的萃取分离，最终的结果都是降低了目标产物的收率。

8、实验2中，采用微负压的提取氛围，设定系统压力65kpaa,其他条件相同。

本实验中，总提取物的浸膏量为3.124kg，总提取物的浸膏得率为7.81％。其中，石油醚萃取率1.15％，二氯甲烷萃取率4.52％、乙酸乙酯萃取率1.38％、正丁醇萃取率16.57％。

9、实验2中，采用微负压的提取氛围，设定系统压力80kpaa,其他条件相同。

本实验中，总提取物的浸膏量为2.987kg，总提取物的浸膏得率为7.47％。其中，石油醚萃取率1.14％，二氯甲烷萃取率4.38％、乙酸乙酯萃取率1.29％、正丁醇萃取率17.01％。

10、实验2中，采用微负压的提取氛围，设定系统压力95kpaa,其他条件相同。

本实验中，总提取物的浸膏量为2.741kg，总提取物的浸膏得率为6.85％。其中，石油醚萃取率1.12％，二氯甲烷萃取率4.38％、乙酸乙酯萃取率1.42％、正丁醇萃取率16.35％。

实验8到实验10可以看出，随着压力的降低，真空度提高，提取反应的物质交换速率不断加强，尤其是随着压力降低，提取溶剂的沸点降低，反应扰动明显，增加了目标化合物从银柴胡中被提取出来的效率，目标化合物的收率也有了显著的提高。随着压力进一步降低，反应罐中出现大量的泡沫，这极大的影响了反应的提取效率。

实验1～实验7中，制备了银柴胡的总提物、石油醚部、二氯甲烷部、乙酸乙酯部、正丁醇部以及水部。通过恒温提取，提高提取效率，使提取溶剂与银柴胡充分接触，反混，使提取得率有一定程度提高。而通过定温浓缩、定温萃取，进一步提高银柴胡中有效组分的提取效率，提高目标化合物三十四碳-(20,23)-二烯酸的得到率。通过各个参数的合理选择，相互配合，实现提高银柴胡总提取物浸膏得率，提高目标化合物三十四碳-(20,23)-二烯酸的最终收率，为在研究其药理作用和推广生产中提供有效借鉴。

二、从银柴胡的乙酸乙酯部分离三十四碳-(20,23)-二烯酸

请参看图2，对银柴胡的乙酸乙酯部进行分离，得到9种化合物。其分离过程如下：

取乙酸乙酯部位浸膏适量，甲醇溶解，用60g硅胶(100-200目)拌样，并用旋转蒸发仪挥干溶剂使成粉末状。用常压层析柱(填料：100目-200目硅胶；直径：10cm)干法装柱上样，以二氯甲烷-甲醇系统(15:1)梯度洗脱。按瓶(150ml)收集洗脱液，用tlc检测并合并相似流分，得到2个组分c1～c2，c1组分经硅胶柱(乙酸乙酯：丙酮＝15:1-1:1)，ods柱(60-100％甲醇)，lh-20凝胶柱色谱，phplc(70％甲醇)(流动相：甲醇)除杂后得到化合物5、化合物6、化合物9和化合物8。c2组分经硅胶柱(二氯甲烷：丙酮＝40:1-1:1)，lh-20凝胶柱色谱，ods柱(60-100％甲醇)，phplc(70％甲醇)(流动相：甲醇)除杂后得到化合物1、化合物3、化合物4、化合物2和化合物7。

经现代核磁光谱鉴定，化合物1为：三十四碳-(20,23)-二烯酸(n-tetratriacont-20,23-dienoicacid)。

上述实验中，三十四碳-(20,23)-二烯酸的相对银柴胡乙酸乙酯部的收率为0.035％，即每100g乙酸乙酯部的提取物可分离获取35mg三十四碳-(20,23)-二烯酸。

上述实验中，从银柴胡的乙酸乙酯部中分离提纯了目标化合物三十四碳-(20,23)-二烯酸，为在研究其药理药效作用的实验中提供可靠保障。

三、三十四碳-(20,23)-二烯酸抑制胃癌肿瘤细胞生长实验

取小鼠胃癌细胞，吸去培养瓶中残余培养基，用pbs(phosphatebuffersaline，磷酸缓冲盐溶液)缓冲液清洗两次，加入胰蛋白酶-edta消化液放在培养箱10分钟，将贴壁的细胞消化下来，再加入适量的完全培养基，将细胞离心后，吸去废液，加入适量完全培养基，混匀细胞。计数后将细胞浓度调制1×105个/ml，然后接种于96孔板上，每孔100μl细胞。在37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h，24h后吸去96孔板中的残余培养基加入所要测试的三十四碳-(20,23)-二烯酸，分为1μm、5μm、10μm、20μm、40μm、对照组六组，每组设四个复孔，于37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h后，每孔加入10μl的cck-8检测试剂，在细胞培养箱中培养2.5h后，用酶标仪，在波长450nm下检测每孔的吸光度od值，计算细胞的抑制率。计算公式如下：

细胞抑制率(％)＝(对照细胞od-加药细胞od)/(对照细胞od-空白od)×100％；

其中：对照细胞od为不加待测药物的细胞的od值；加药细胞od为添加待测药物的细胞的od值；空白od为培养基和cck-8试剂的od值。

上述实验中，可以清楚的得到，三十四碳-(20,23)-二烯酸在抑制胃癌肿瘤细胞生长过程中，有着显著的作用，尤其是在5μm～10μm的剂量下，对胃癌肿瘤细胞的抑制率超过50％，而在20μm～40μm的剂量下，则呈现出一定的细胞毒性。

在实验中，发明人还发现，三十四碳-(20,23)-二烯酸在抑制其他肿瘤细胞生长过程中，也有着显著的作用，尤其是在5μm～10μm的剂量下，对结肠癌肿瘤细胞的抑制率超过70％，对肝癌、子宫癌、皮肤癌、乳腺癌等也有着显著的抑制作用。在应用中，要严格控制三十四碳-(20,23)-二烯酸的浓度，浓度太大，三十四碳-(20,23)-二烯酸表现出较强的细胞毒性作用。

以上所揭露的仅为发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。