本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种检测脂滴极性的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是全世界公认的绝症之一，每年都有大量的人死于癌症。尽管癌症是重要的疾病，但是如果我们及时诊断与治疗，癌症死亡率是可以控制的。目前通过肿瘤标志物来诊断癌症已经成为热点，尽管现有的一些肿瘤标记物已经大大提高了癌症诊断率，但是由于它们具有入侵性以及操作不方便等缺点而限制了它们的广泛应用。因此，发展新的肿瘤标记物对癌症的诊断与治疗具有十分重要的意义。近年来，脂滴因其独特的结构与性能广泛地引起大家的关注。脂滴除了为细胞提供能量以外，还与许多重要的生理活动有关。已经有报道称，由于脂滴的新陈代谢机理不同，所以脂滴在癌细胞中的极性会比在正常细胞中大。因此，脂滴的极性可以作为区分癌细胞与正常细胞的一个重要指标。所以，检测脂滴的极性将会为癌症的诊断提供重要的指导信息。
目前，荧光成像技术由于其高灵敏度、无创检测和高选择性，已成为检测生物微极性环境的有力工具。因此，发展一种新的极性探针检测细胞内脂滴的极性对于癌症的诊断和临床研究具有重要的意义。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种能检测脂滴内极性的荧光探针。该探针具有低毒性，良好的光学稳定性，能准确定位脂滴及对极性特异性响应。
本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单、收率高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种检测细胞内脂滴极性的荧光探针，化学名称为3-（4-（2,2-二氰基乙烯基）苯基）-9-乙基咔唑，简称为ebmc，结构式如式（i）：
式（i）。
一种上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
（1）3-溴咔唑（1）的氢氧化钠溶液于四氢呋喃中室温搅拌，然后与溴乙烷（2）加热反应，分离纯化得到白色固体，即3-溴-9-乙基咔唑（3）：
（2）3-溴-9-乙基咔唑（3）与4-甲酰基苯硼酸（4）在碳酸钾和四(三苯基膦)钯存在下于四氢呋喃与水的混合溶剂中加热回流，分离纯化得3-（4-甲醛基苯基）-9-乙基咔唑（5）：
（3）3-（4-甲醛基苯基）-9-乙基咔唑（5）和丙二腈（6）在哌啶存在下于有机溶剂中加热回流，分离纯化得到3-（4-（2,2-二氰基乙烯基）苯基）-9-乙基咔唑（7），即荧光探针ebmc：
步骤（1）中，所述3-溴咔唑：氢氧化钠：溴乙烷的摩尔比为1:2:6。
步骤（1）中，所述搅拌时间为1.5h；所述反应温度为55℃，反应时间为12h。
步骤（1）中，所述分离纯化步骤为：将反应后的体系减压蒸馏，旋干溶剂得到粗产物后，经柱色谱分离得到提纯产物；所述柱色谱分离的流动相优选为体积比为1:30的乙酸乙酯与石油醚。
步骤（2）中，所述3-溴-9-乙基咔唑：碳酸钾：4-甲酰基苯硼酸：四(三苯基膦)钯的摩尔比为1:3:1.2:0.03。
步骤（2）中，所述反应温度为60℃，反应时间为12h。
步骤（2）中，所述反应在n2保护下进行。
步骤（2）中，所述四氢呋喃：水=1:3（v:v）。
步骤（2）中，所述分离纯化步骤为：将反应后的体系用二氯甲烷萃取反应后的体系，并用无水硫酸钠除去体系中剩余的少量的水，然后进行减压蒸馏，旋干溶剂得粗产品，经柱色谱分离得到提纯产物；所述柱色谱分离的流动相优选为体积比为1:20的乙酸乙酯与石油醚。
步骤（3）中，所述3-（4-甲醛基苯基）-9-乙基咔唑与丙二腈的摩尔比为1:3。
步骤（3）中，所述反应温度为80℃，反应时间12h。
步骤（3）中，所述反应溶剂优选为乙醇与乙腈的混合液；乙醇与乙腈的体积比优选为1:1。
步骤（3）中所述分离提纯步骤为：将反应后的体系减压蒸馏，旋干溶剂得到粗产物后，经柱色谱分离得到提纯产物；所述柱色谱分离的流动相优选为体积比为1:20的乙酸乙酯与石油醚。
一种上述荧光探针用于检测溶液和细胞内脂滴极性的应用。
本发明荧光探针的识别机理如下：
由于丙二腈是一个强吸电子基团，9-乙基咔唑是一个供电子基团，所以在探针ebmc结构中，存在由“咔唑”部分向“丙二腈”部分发生的电子转移，即分子内电子转移（ict）效应。正是这种ict效应使探针具有“溶剂化效应”。在一定的极性范围内（四氢呋喃溶剂极性之前），由于“负溶剂效应”占主要作用，使得探针随着极性溶剂极性的增加荧光强度逐渐增大；随着溶剂极性进一步增大（四氢呋喃溶剂极性之后），由于“正溶剂效应”占主导作用，使得探针荧光强度随着极性的变化而减小。然而，无论在正常细胞中还是在癌细胞中，脂滴的极性都会在四氢呋喃极性之前，并且，癌细胞中脂滴的极性会小于正常细胞中脂滴的极性。所以当探针在极性较小的癌细胞脂滴环境中会发出较弱的荧光，而在极性较大的正常细胞脂滴环境中会发出较强的荧光。因此，正常细胞与癌细胞可以通过荧光强度的变化进行区分，从而实现诊断癌症的诊断。
本发明的有益效果为：
本发明所提供的区分不同脂滴极性的荧光探针，能准确的定位于脂滴，具有较高的灵敏度，良好的光学稳定性以及对极性特异性响应；并且实现了对细胞内脂滴极性的检测。同时，本发明提供了该探针的合成方法，步骤简单、纯化方便、收率高。
附图说明
图1是探针的1hnmr谱；
图2是探针的13cnmr谱；
图3是探针在不同极性溶剂中的发射光谱；
图4是探针与商业化脂滴染料的共定位；
图5是探针在不同细胞中的成像应用。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1荧光探针ebmc的合成
（1）化合物（3）的合成
将2.46g3-溴咔唑（10mmol）（1）和0.8g氢氧化钠(20mmol)加入装有20ml四氢呋喃的高压管中，室温搅拌，1.5h后加入6.56g溴乙烷（60mmol），反应约12h，反应完成后，将反应后的体系减压蒸馏，旋干溶剂得到粗产物后，以体积比为1:30的乙酸乙酯与石油醚为流动相进行柱色谱分离提纯得3-溴-9-乙基咔唑（3）；
（2）化合物（5）的合成：
称量0.274g3-溴-9-乙基咔唑（3）（1mmol）、0.18g4-甲酰基苯硼酸（4）（1.2mmol）、37mg四-（三苯基膦钯）（0.03mmol）、0.445g碳酸钾（3.23mmol）于四氢呋喃：水=1:3（v：v）的混合溶剂中混合反应，升温至60℃回流，在n2氛围环境下反应12h后，用二氯甲烷萃取后，并用无水硫酸钠除去体系中剩余少量的水，然后进行减压蒸馏，旋干溶剂得粗产品，以体积比为1:20的乙酸乙酯与石油醚为流动相进行柱色谱分离提纯得3-（4-甲醛基苯基）-9-乙基咔唑（5）。
（3）化合物（7）的合成：
称量0.299g3-（4-甲醛基苯基）-9-乙基咔唑（5）（1mmol）和0.193g丙二腈（3mmol）于乙醇：乙腈=1:1（v:v）的混合液中，滴加三滴哌啶，升温至80℃回流，反应12h后，减压蒸馏旋干溶剂得到粗产物后，用流动相体积比为1:20的乙酸乙酯与石油醚柱色谱分离得到橘色的纯产物探针ebmc。
探针1hnmr谱如图1，13cnmr谱如图2；
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.69(d,j=2.0hz,1h),8.52(s,1h),8.27(d,j=7.6hz,1h),8.08(6.8hz,4h),7.92(dd,j1=8.6,j2=1.8hz,1h),7.71(d,j=8.4hz,1h),7.64(d,j=8.4hz,1h),7.49(m,1h),7.25(t,j=7.4hz,1h),4.47(q,j=7.2hz,2h),1.33(t,j=7.0hz,3h)；
13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ160.91,147.04,140.30,140.19,131.65,129.45,128.99,127.28,126.41,125.10,123.18,122.55,120.91,119.49,119.42,114.79,109.99,109.64,79.62,37.33,13.93。
实施例2荧光探针在不同溶剂中的发射光谱
配制浓度为1mm实施例1所得荧光探针ebmc的二甲基亚砜(dmso)的测试母液待用。
测试液中，分别取3ml不同极性的溶剂：甲苯（toluene），二氧六环(dioxane)，四氢呋喃（thf），二氯甲烷（dcm），丙酮(acetone)，二甲基亚砜（dmso），然后加入浓度为1mm的探针母液，使得测试液中探针的最终浓度为10μm，然后进行荧光扫描（激发波长455nm，检测波段450-800nm），得各体系中荧光强度，如图3所示。由图3可知，随着溶剂极性的增加，光谱红移，在四氢呋喃溶液之前，荧光强度随着极性的增加而增加；在四氢呋喃之后，荧光强度随着极性的增加而减弱。
实施例3荧光探针与商业化脂滴染料的共定位
配制浓度为1mm实施例1所得荧光探针ebmc的二甲基亚砜(dmso)的测试母液待用；配制浓度为1mm的市售的尼罗红（脂滴的专用定位剂）的二甲基亚砜(dmso)的测试母液待用。
将适当密度的小鼠乳腺肿瘤细胞4t1接种到灭菌的35mm成像培养皿中，在co2培养箱（温度为37℃，5%co2）中培养，待细胞贴壁后，同时向细胞中荧光探针ebmc以及脂滴商业化染料尼罗红，使荧光探针最终浓度为10μm，尼罗红最终浓度为5μm。半小时后，弃掉培养基，用pbs缓冲液冲洗细胞3次，随后进行荧光成像（激发波长：488nm，绿色通道500-550nm；激发波长：561nm，红色通道570nm-620nm），成像结果如图4所示。其中，（a）为ebmc在绿色通道的成像图；（b）为尼罗红在红色通道的成像图；（c）是（a）和（b）的叠加图；（d）为（a）和（b）的光谱强度叠加图；（e）两个通道的强度散点图；（f）是细胞明场成像图。由图4可知，该探针与尼罗红的成像位置高度吻合，说明探针ebmc主要定位在细胞中的脂滴内，因而本发明的探针可以用来检测细胞中脂滴的极性。
实施例4荧光探针的细胞成像
配制浓度为1mm实施例1所得荧光探针ebmc的二甲基亚砜(dmso)的测试母液待用。
将适当密度的正常细胞3t3以及癌细胞4t1分别接种到两个灭菌的35mm成像培养皿中，在co2培养箱（温度为37℃，5%co2）中培养，待细胞贴壁后，加入荧光探针ebmc，使探针的最终浓度为10μm，弃掉培养基，用pbs缓冲液冲洗细胞3次，随后进行荧光成像（激发波长：488nm；发射波段：500-550nm），荧光成像结果如图5所示。由图5可知，正常细胞中的荧光明显比肿瘤细胞中的光强，所以，肿瘤细胞与正常细胞可以通过探针荧光强度的变化进行区分。因此，本发明的荧光探针ebmc可以通过检测脂滴的极性对癌症进行诊断。