本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种鲍曼不动杆菌的检测方法。
背景技术
鲍曼不动杆菌(acinetobacterbaumannii,ab)是不动杆菌属中最常见的一个菌种，是一种不发酵糖类、革兰染色阴性、无动力的球杆菌，普遍存在于自然界和人体。该菌分布广泛且在潮湿环境中可以长期存活，是临床常见的条件致病菌之一，在非发酵菌感染中仅次于假单胞菌属，可引起呼吸机相关性肺炎(vap),泌尿系统感染、菌血症、复杂的皮肤软组织感染、腹膜炎和中枢神经系统感染等，感染多见于免疫力低下的患者。
目前食品安全国家标准中还有没有不动杆菌的检测方法，因此本发明提出一种可以有效地定性和定量检验饮用水中鲍曼不动杆菌的检测方法。
技术实现要素：
本发明提供一种鲍曼不动杆菌检测方法，目前食品安全国家标准中还没有不动杆菌的检测方法，本发明能够填补该领域的空白。且，本发明提供的方法可以定性和定量地检测出饮用水中的鲍曼不动杆菌。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种鲍曼不动杆菌的检测方法，包括：
取待测液体通过滤膜过滤；将过滤后的所述滤膜贴于麦康凯琼脂培养基上培养；观察经过培养的所述滤膜上是否存在至少一个菌落，若否，则判定所述待测液体中不含有鲍曼不动杆菌；
若是，将所有所述菌落分别接种至营养琼脂培养基培养，得到培养物；
取第一培养物进行革兰氏染色后镜检，得到第一结果；同时，取所述第一培养物用氧化酶试剂检验，得到第二结果；
若所述第一结果不为革兰氏阴性无芽孢球杆菌和/或所述第二结果为阳性，则判定所述待测液体中不含有鲍曼不动杆菌；
若所述第一结果为革兰氏阴性无芽孢球杆菌且所述第二结果为阴性，则取所述第一培养物进行精氨酸双水解试验和氧化发酵试验，并分别得到第三结果和第四结果；
若所述第三结果为阴性且所述第四结果为氧化型细菌，则判定所述待测液体中含有鲍曼不动杆菌。
进一步地，所述将过滤后的所述滤膜贴于麦康凯琼脂培养基上培养，具体包括：将所述麦康凯琼脂培养基置于44℃±1℃下培养。
进一步地，所述观察经过培养的所述滤膜上是否存在至少一个菌落，具体包括：将过滤后的所述滤膜贴于麦康凯琼脂培养基上培养20h～24h和40h～48h后分别观察所述滤膜上是否存在至少一个菌落。
进一步地，所述将所有所述菌落分别接种至营养琼脂培养基培养，具体包括：将所述营养琼脂培养基置于36℃±1℃培养20h～24h。
进一步地，所述菌落为粉红色不透明的菌落。
进一步地，所述取所述第一培养物用氧化酶试剂检验，得到第二结果，具体包括：取2滴-3滴所述氧化酶试剂滴于洁净滤纸上，取所述第一培养物涂于所述滤纸上，若所述滤纸呈深蓝紫色则所述第二结果为阳性，若所述滤纸不呈深蓝紫色则所述第二结果为阴性。
进一步地，所述取所述第一培养物进行精氨酸双水解试验和氧化发酵试验，并分别得到第三结果和第四结果，具体包括：
取第一试管，所述第一试管中含有精氨酸双水解酶培养基；
取所述第一培养物置于所述第一试管中，并覆盖一层灭菌液体石蜡；
取第二试管，所述第二试管中含有与所述第一试管中相同且等量的精氨酸双水解酶培养基；
将所述第一试管和所述第二试管置于36℃±1℃培养24h～48h；
若所述第一试管和所述第二试管均显黄色，则说明所述第三结果为阴性；
若所述第一试管显黄色，所述第二试管显蓝绿色，则说明所述第三结果为阳性。
进一步地，所述取所述第一培养物进行精氨酸双水解试验和氧化发酵试验，并分别得到第三结果和第四结果，具体包括：
取第一o/f试验管和第二o/f试验管，所述第一o/f试验管和所述第二o/f试验管为两只相同的试验管，均含有第一培养基；
取所述第一培养物，同时穿刺接种于所述第一o/f试验管中的所述第一培养基和所述第二o/f试验管的所述第一培养基；
在接种后的所述第一o/f试验管的所述第一培养基表面，覆盖一层灭菌液体石蜡；
将所述第一o/f试验管和所述第二o/f试验管置于36℃±1℃培养24h～48h；
若所述第一o/f试验管和所述第二o/f试验管均显黄色，则说明所述第一培养物为发酵型细菌；
若所述第一o/f试验管显紫色，所述第二o/f试验管显黄色，则说明所述第一培养物为氧化型细菌；
若所述第一o/f试验管和所述第二o/f试验管均显紫色，则说明所述第一培养物为产碱型细菌。
进一步地，本方法还包括计算所述待测液体中鲍曼不动杆菌的数量n，单位：cfu：
n＝a*c/b
其中，所述将所有所述菌落分别接种至营养琼脂培养基培养前，对所述菌落的菌落数进行计数，为a；
所述将所述菌落分别接种至营养琼脂培养基培养，得到培养物，对所述培养物的菌落数进行计数，为b；
所述若所述第三结果为阴性且所述第四结果为氧化型细菌，则所述第一培养物为符合鲍曼不动杆菌特征的菌落，对所有所述培养物进行检测，计算所述培养物中符合鲍曼不动杆菌特征的菌落数，为c。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种鲍曼不动杆菌的检测方法，取待测的液体，过滤后将滤膜放在麦康凯琼脂培养基上培养，得到疑似菌落，将其接种至营养琼脂培养基培养，并对得到的培养物进行检测。先通过革兰氏染色后镜检以及氧化酶试剂检验，初步判定培养物是否为鲍曼不动杆菌，若是，则进一步进行精氨酸双水解试验和氧化发酵试验，并根据结果最终判定是否存在鲍曼不动杆菌。本发明通过多种检测方式检测，最终确认是否存在鲍曼不动杆菌，使得测试结果更加可靠。
除此之外，本发明还提供了一种定量检测待测液体中鲍曼不动杆菌含量的方法，可以通过此量化指标来判断饮用水的优劣程度，市场应用前景广阔。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是根据本发明实施例提供的一种鲍曼不动杆菌的检测方法的流程图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参照图1，图1是根据本发明实施例提供的一种鲍曼不动杆菌的检测方法的流程图。
本实施例提供的一种鲍曼不动杆菌的检测方法包括如下步骤：
步骤s101：取待测液体通过滤膜过滤。
在本发明实施例中，选择在100级的洁净工作台进行过滤操作，但本发明并不以此文为限。
首先对所述滤膜进行灭菌处理，取无菌镊子夹取灭菌后的所述滤膜的边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上。固定好滤器,取所述待测液体通过所述滤膜过滤，在本实施例中，我们取250ml所述待测液体。所述滤膜为孔径0.45μm的滤膜，需要说明的是，自然界中的大部分细菌尤其是致病细菌,其尺寸都大于0.45μm,所以绝大部分细菌都能被0.45μm的滤膜截留；且所述滤膜为微孔滤膜，其孔并非筛孔，而是一个复杂的通道,标称的孔径(此处为0.45μm)是指最大的孔的等效孔径,所以即使是小于0.45μm的细菌也绝大部分都能被截留。在常见滤膜中，比0.45μm孔径更小的有0.22μm孔径的滤膜，相比之下0.45μm孔径滤膜在接留住细菌的基础上，有较强的细菌回复能力，容易培养出细菌。因为0.22μm的孔径太细，较难培养出细菌，从而影响实验结果。
步骤s102：将过滤后的所述滤膜贴于麦康凯琼脂培养基上培养。
在本实施例中，所述滤膜平铺贴于所述麦康凯琼脂培养基(mac培养基)上，并避免在所述滤膜和所述mac培养基之间夹留着气泡。所述麦康凯琼脂培养基置于44℃±1℃下培养。
步骤s103：观察经过培养的所述滤膜上是否存在至少一个菌落。
在本实施例中，所述菌落为粉红色不透明的菌落。若观察不存在所述菌落，则判定所述待测液体中不含有鲍曼不动杆菌。
需要说明的是，将过滤后的所述滤膜贴于麦康凯琼脂培养基上培养20h-24h和40h-48h后分别观察所述滤膜上是否存在至少一个菌落。观察两次是为了减少漏检的可能性，细菌受损时生长缓慢，培养20h-24h可能会无法形成肉眼可见的菌落或者无明显特征菌落，需延长培养再观察；如直接培养至40h-48h观察，则可能会因为细菌生长过快导致菌落融合，而无法判定。
步骤s104：若是，将所有所述菌落分别接种至营养琼脂培养基培养，得到培养物。
在本实施例中，将所述营养琼脂培养基置于36℃±1℃培养20h～24h。36℃是大部分细菌的最适生长温度，将培养温度设置为36℃，可以减少高温对所述琼脂培养培养基水分的蒸发效果，使疑似鲍曼不动杆菌的所述菌落的验证试验结果更准确。
需要说明的是，所述将所有所述菌落分别接种至营养琼脂培养基培养前，对所述菌落的菌落数进行计数，为a。所述将所述菌落分别接种至营养琼脂培养基培养，得到培养物，对所述培养物的菌落数进行计数，为b。
步骤s105：取第一培养物进行革兰氏染色后镜检，得到第一结果；同时，取所述第一培养物用氧化酶试剂检验，得到第二结果；
在本实施例中，取第一培养物进行革兰氏染色后镜检，确认第一结果是否为革兰氏阴性无芽孢球杆菌。革兰氏染色和镜检为本领域的常用手段，在此不做赘述。
在本实施例中，取所述第一培养物用氧化酶试剂检验，得到第二结果，具体为：取滤纸平放于平皿里，取2滴-3滴新鲜配制的所述氧化酶试剂滴于洁净滤纸上，取所述第一培养物涂于所述滤纸上，若所述滤纸呈深蓝紫色则所述第二结果为阳性，若所述滤纸不呈深蓝紫色则所述第二结果为阴性。所述第一培养物，是从所述培养物中选取的任一菌落。
若所述第一结果不为革兰氏阴性无芽孢球杆菌和/或所述第二结果为阳性，则判定所述待测液体中不含有鲍曼不动杆菌。
步骤s106：若所述第一结果为革兰氏阴性无芽孢球杆菌且所述第二结果为阴性，则取所述第一培养物进行精氨酸双水解试验和氧化发酵试验，并分别得到第三结果和第四结果。
在本实施例中，所述取所述第一培养物进行精氨酸双水解试验，得到第三结果，具体包括：
取第一试管，所述第一试管中含有精氨酸双水解酶培养基，取所述第一培养物置于所述第一试管中，并覆盖一层灭菌液体石蜡；取第二试管，所述第二试管中含有与所述第一试管中相同且等量的精氨酸双水解酶培养基。需要说明的是，所述第一试管为试验管，所述第二试管为空白对照管。将所述第一试管和所述第二试管置于36℃±1℃培养24h～48h，此处将温度设置为36℃±1℃，有益效果同步骤s104。
若所述第一试管和所述第二试管均显黄色，则说明所述第三结果为阴性；若所述第一试管显黄色，所述第二试管显蓝绿色，则说明所述第三结果为阳性。
在本实施例中，所述取所述第一培养物进行氧化发酵试验，得到第四结果，具体包括：
取第一o/f试验管和第二o/f试验管，所述第一o/f试验管和所述第二o/f试验管为两只相同的试验管，均含有第一培养基。取所述第一培养物，同时穿刺接种于所述第一o/f试验管中的所述第一培养基和所述第二o/f试验管的所述第一培养基。在接种后的所述第一o/f试验管的所述第一培养基表面，覆盖一层灭菌液体石蜡，液体石蜡的厚度为2cm-3cm。将所述第一o/f试验管和所述第二o/f试验管置于36℃±1℃培养24h-48h。若所述第一o/f试验管和所述第二o/f试验管均显黄色，则说明所述第一培养物为发酵型细菌；若所述第一o/f试验管显紫色，所述第二o/f试验管显黄色，则说明所述第一培养物为氧化型细菌；若所述第一o/f试验管和所述第二o/f试验管均显紫色，则说明所述第一培养物为产碱型细菌。
步骤s107：若所述第三结果为阴性且所述第四结果为氧化型细菌，则判定所述待测液体中含有鲍曼不动杆菌。
通过上述步骤，均符合结果才能确认为鲍曼不动杆菌。本发明实施例中，设置多个确证试验步骤是为了尽可能减少假阳性和假阴性结果的产生，减少试验过程中的偶然因素。在实际检验中发现，即使是标准菌株的生化反应也会有反应结果延后等不及预期的情况出现，这时如果确证试验过于单一就会导致假阴性或者假阳性的结果出现。而本发明的检测方法主要用于饮用水中鲍曼不动杆菌的检验，所述待测液体为饮用水，来源于自然界，比起临床检验样品，细菌种类和数量都要复杂得多，确认试验过少很容易产生假阳性和/或假阳性结果，造成检验方法的准确性不足。
在本发明实施例中，还提供了一种定量测定所述待测液体中鲍曼不动杆菌的数量n，n＝a*c/b。
a、b的含义请参照前述实施例，在此不再赘述。
所述若所述第三结果为阴性且所述第四结果为氧化型细菌，则所述第一培养物为符合鲍曼不动杆菌特征的菌落，对所有所述培养物进行检测，计算所述培养物中符合鲍曼不动杆菌特征的菌落数，为c。例如，所述培养物包括10个菌落，则依次对10个菌落按照步骤s101-步骤s107进行检测，确认所述10个菌落中符合鲍曼不动杆菌特征的菌落数量，该数量即为c。
当所述待测液体为250ml时，所述待测液体中鲍曼不动杆菌的数量n以cfu/250ml计。同理，当所述待测液体为100ml时，所述待测液体中鲍曼不动杆菌的数量n以cfu/100ml计。本发明对此不做限定。
显然，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。