本发明涉及分子生物学领域，特别是指酿酒酵母与don互作降低ipec-j2细胞凋亡的检测步骤及其应用。
背景技术
呕吐毒素(vomotoxin)，又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，don)，是世界范围内谷物和食物中最常见的霉菌毒素之一。人与畜摄入含don的食物后引起一系列的中毒症状。
猪肠道上皮细胞(ipec-j2)是防御外部刺激的第一道物理屏障，don是第一个公认的对肠上皮细胞有促炎反应和免疫调节作用的毒素，所以本试验旨在筛选出能降解don的菌株，构建don-ipec-j2细胞模型，研究所筛选出来的微生物对don的降解作用以及缓解毒素对细胞增殖的影响。
don是第一个公认的对肠上皮细胞有促炎反应和免疫调节作用的毒素。don对细胞的毒性作用主要是改变细胞形态，dna损伤，抑制蛋白合成，促进凋亡等。don对肠上皮细胞的作用机制主要是上调紧密连接蛋白，从而表现相关基因的rna表达量上调作为代偿机制。肠道试验证明，don通过肠道表面，被肠上皮细胞快速吸收，破坏肠上皮细胞的紧密连接，结合rna肽转移酶，抑制蛋白的合成。另外，don对细胞凋亡有促进作用。
酵母等益生菌作为饲料添加剂被广泛应用，主要是为了调节动物肠道微生物菌群、保护肠道健康、调节机体的免疫功能、对病原菌发挥直接干预作用而阻止机体感染、对致病性毒素的降解等。益生菌还能够通过促进黏液层的形成、分泌抗菌因子、增进紧密连接形成等手段增强肠道上皮屏障功能的作用。
本发明在细胞水平上，研究酿酒酵母缓解don对肠上皮细胞增殖的危害作用，为生产实际提供依据。
技术实现要素：
本发明提出酿酒酵母与don互作降低ipec-j2细胞凋亡的检测步骤及其应用，解决利用酿酒酵母对猪肠上皮细胞损伤进行修复的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
酿酒酵母与don互作降低ipec-j2细胞凋亡的检测步骤，步骤为：
(1)取对数期的ipec-j2细胞，消化计数后接种至6孔板上，2ml/孔，每孔的细胞数为5×105个，细胞培养至贴壁后弃掉原培养基，用pbs洗涤一次；
(2)检测试验设有四组，分别为空白对照组、酿酒酵母制剂组、don制剂组以及酿酒酵母制剂+don制剂组，每组三个重复；
(3)将步骤(2)中的四组制剂分别加入到步骤(1)中装有ipec-j2细胞的6孔板内；
(4)将步骤(3)中处理过的6孔板置于30-35℃，共培养8h，弃上清，用pbs清洗2次，2000rpm离心5min，收集细胞；
(5)向步骤(4)中收集的细胞内加入500μl的bindingbuffer悬浮细胞，再加入5μlannexinv-fitc混匀后，再加入5μlpropidiumiodide混匀，室温避光反应15min后进行细胞活力检测。
所述酵母菌为酿酒酵母，保藏号为cgmccno:2.3866。
所述步骤(2)中don的浓度为0.075-0.15μg/ml，酿酒酵母的细胞数与ipec-j2细胞相同。
所述步骤(2)中酿酒酵母制剂的处理为：
a.将保存的酿酒酵母于ypd液体培养基中活化24h，将活化后的菌液按2-5％的接种量接种于新鲜的ypd液体培养基中，继续培养16-24h，涂板计数，于4℃冰箱保存；
b.取步骤a中保存的酿酒酵母培养基，于8000rpm/min离心5min后，弃上清液，过0.22μm滤膜除菌，得菌体细胞，于4℃保存备用；
c.离心后的菌体细胞用dmem/f-12培养基重新悬浮菌体细胞，8000rpm/min离心5min，如此洗涤两次后用dmem/f-12培养基按等体积将菌体悬浮，即得酿酒酵母制剂，4℃冰箱保存备用。
所述的酿酒酵母与don互作降低ipec-j2细胞凋亡的应用，对don诱导的具有炎症的猪肠上皮细胞有缓解作用。
每2ml酿酒酵母和don混合物中含有5×105个酿酒酵母细胞、5×105个猪肠上皮细胞及1.2μg/mldon。
每kg饲料里面添加5-10ml酿酒酵母和don混合物。
本发明的有益效果在于：
(1)本申请将酿酒酵母(moi＝1)与don共培养，在一定程度上促进了细胞增殖，可缓解don对猪肠道上皮细胞的损伤，保护了肠道细胞膜的完整性；和don组相比显著降低了ldh的释放，且对don的降解有良好作用；当don浓度为1.2μg/ml时，酿酒酵母的添加可显著地提高猪肠上皮细胞的增殖率及il-10抗炎因子的表达量，显著地降低细胞的凋亡率和坏死率，同时在一定程度上降低了紧密连接蛋白(tjp)和闭合蛋白(occuldin)基因的表达量，说明酿酒酵母对don诱导的细胞病变有一定的缓解作用。
(2)本发明中don组早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞较对照组分别增加了2.67倍和4.53倍(p<0.05)；酵母组和对照组对比增加了早期和晚期凋亡细胞数，活细胞数有所降低，但是差异不显著(p>0.05)。
(3)呕吐毒素(don)对猪肠上皮细胞(ipec-j2)的增殖抑制呈现剂量—时间依赖效应，随着don浓度增加及作用时间延长对pec-j2细胞的增殖抑制率逐步增高(p<0.05)，并提高ldh(乳酸脱氢酶)的释放量(p<0.05)，说明don破坏ipec-j2的细胞膜，增加细胞渗透性，对猪肠上皮细胞有一定的损伤作用。
(4)酿酒酵母与don和猪肠上皮细胞共培养时，酿酒酵母可缓解don对肠上皮细胞增殖的抑制作用，降低了乳酸脱氢酶(ldh)的释放量(p<0.05)，提高了don的降解率，使白细胞介素il-8的表达量显著上调(p<0.05)；特别在高剂量don添加组(1.2μg/ml)，酿酒酵母的添加显著地提高了il-6、il-8、il-10基因的表达量(p<0.05)，但对紧密连接蛋白(tjp)和闭合蛋白(occuldin)基因的表达量无显著性影响。
(5)酵母和don共培养组与don组相比，早期和晚期凋亡细胞分别下降了44.78％和46.37％(p<0.05)，活细胞数增加了2.35％(p<0.05)，坏死细胞数降低了38.05％(p>0.05)。
附图说明
图1为不同浓度don作用24h对ipec-j2细胞活力和细胞增殖率的影响。
图2为酿酒酵母和不同浓度的don共培养对细胞因子il-6的mrna的表达量。
图3为酿酒酵母和不同浓度的don共培养对细胞因子il-8的mrna的表达量。
图4为酿酒酵母和不同浓度的don共培养对细胞因子il-10的mrna的表达量。
图5为酿酒酵母和不同浓度的don共培养对细胞因子tjp的mrna的表达量。
图6为酿酒酵母和不同浓度的don共培养对细胞因子occludin的mrna的表达量。
图7为酿酒酵母和don共培养对细胞凋亡的影响的荧光双染色二维点图，其中7-1为对照组，7-2为don组，7-3为酿酒酵母组，7-4为酿酒酵母+don组，其中四个象限表示细胞的面积比；横坐标为annexinv(磷脂结合蛋白)染色，fitc(异硫氰酸荧光素)荧光标记的ipec-j2细胞数目(荧光道数)；纵坐标为用pi(碘化丙啶)染色，percp(叶绿素蛋白)荧光标记的ipec-j2细胞数目(荧光道数)；其中q1代表坏死细胞，q2代表晚期凋亡细胞，q3代表活细胞，q4代表早期凋亡细胞。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1材料与方法
1.1试验材料
猪肠上皮细胞(ipec-j2)：由河南农业大学河南省动物源性食品安全重点研究实验室惠赠。酿酒酵母为本实验室保存菌种。
1.1.1试剂
dmem/f-12培养液(hyclone，美国)；胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)(杭州四季青生物工程材料有限公司)；青链霉素混合液、mtt、pbs缓冲液、0.25％胰酶蛋白酶-edta消化液、0.25％胰酶蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司)；dmso(二甲基亚砜)(sigma公司，美国)；trizol、rnase-freewater、反转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒(takara，日本)。
1.1.2主要仪器设备(见表1)
表1主要仪器设备
1.1.3试剂的配制
(1)细胞培养基：10％胎牛血清、1％青莲霉素混合液和90％dmem/f-12培养液充分混合均匀(胎牛血清在-20℃保存，使用时先在4℃冰箱融化后在56℃水浴灭活30min)，4℃保存备用。
(2)细胞冻存液：40％胎牛血清、10％dmso和50％的dmem/f-12培养液混匀即可，现配现用。
(3)ypd培养基配制同上一章。
(4)don储存液的配制：将don纯品用乙醇完全溶解，配置成5mg/ml母液，在-20℃避光保存。使用时用dmem/f-12培养液稀释至100μg/ml，4℃保存备用。
(5)don工作液的配制：将100μg/ml的don储存液用dmem/f-12培养基分别配制成0、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2μg/ml的工作液，4℃避光保存备用。
1.2细胞的培养
1.2.1细胞复苏
将从液氮中保存的ipec-j2细胞株拿出，迅速放在37℃水浴锅中溶解，转入含有5倍体积的细胞培养基中，1000r/min离心5min，弃去上清，用1ml含10％血清和1％双抗的完全培养基吹打均匀后移入25cm2的培养瓶中，加入新鲜培养基5ml，37℃、5％co2的条件下培养，换液时间根据细胞的成长情况而定，若培养基变黄或死细胞过多时立即更换新鲜培养基。待细胞长至瓶壁的80％-90％时，用0.25％胰酶蛋白酶-edta消化液消化传代。
1.2.2细胞培养与传代
弃去培养瓶中的旧培养液，分别用1mlpbs缓冲液洗涤2-3次，加入1ml0.25％胰酶蛋白酶-edta消化液在细胞培养箱中消化3-5min后，在倒置显微镜下观察细胞的形态，细胞变圆、间隙变大或者对着有光线的地方看到细胞从瓶壁上像细沙般落下时立即加入1ml培养基终止消化；用移液器反复吹打瓶壁上的细胞，形成细胞悬浮液，将悬浮液在1000r/min条件下离心5min，弃去上清液，加入培养基悬浮细胞，按照1:2或者1:3进行传代，培养基补足至5ml,37℃、5％co2的条件下培养，隔天换液，观察细胞的形态。
1.2.3细胞冻存
弃去培养瓶中的旧培养液，分别用1mlpbs缓冲液洗涤2-3次，加入1ml0.25％胰酶蛋白酶-edta消化液在细胞培养箱中消化3-5min后，加入1ml完全培养基终止消化，移液器反复吹打瓶壁上的细胞，形成细胞悬浮液，将悬浮液在1000r/min条件下离心5min，弃去上清液，加入冻存液，血球计数板计数后将细胞浓度调至1-3×106个/ml，移到冻存管中，标记后，在4℃预冷20min后，放入-20℃1h，之后转入-80℃冷冻过夜，第二天转入液氮中长期保存。
1.3菌株的活化和培养
将保存的酿酒酵母分别在ypd液体培养基中活化24h，将活化后的菌液分别按5％、2％的接种量重新接入新鲜培养基继续分别培养16h、24h，涂板计数，4℃冰箱保存备用。
1.4ipec-j2-don细胞增殖模型的建立
1.4.1don对ipec-j2细胞增殖的影响
取对数生长期细胞，常规消化计数后接种至96孔板，100μl/孔，每孔细胞数为1×104个，细胞培养24h贴壁后弃掉原培养基，用pbs洗涤一次，分别加入不同浓度don(0、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2μg/ml)的无血清，无双抗的dmem/f-12培养基，每个浓度做6个孔，重复3次，对照组含有与don组相同体积的乙醇，用只含培养基、无细胞的为调零组，分别培养至12h、24h、48h时在显微镜下观察细胞的形态，之后每孔加入10μl的mtt(浓度为5mg/ml)37℃、5％co2培养箱中共同孵化4h后，小心吸走培养液，加入150μl的dmso在振荡器上震荡10min以使甲瓒充分溶解，用酶标仪在450nm波长下测其吸光度值(od值)，以od值表示细胞活力，根据od值计算细胞存活率，公式如下：
细胞存活率＝(试验组od值-调零组od值)/(对照组od值-调零组od值)×100％
1.4.2不同时间不同don浓度对ipec-j2细胞增殖的影响
取对数生长期细胞，常规消化计数后接种至96孔板，100μl/孔，每孔细胞数为1×104个，细胞培养24h贴壁后弃掉原培养基，用pbs洗涤一次，分别加入不同浓度don(0、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2μg/ml)的无血清、无双抗的dmem/f-12培养基，每个浓度做6个复孔，重复3次，对照组含有与don组相同体积的乙醇，用只含培养基、无细胞的为调零孔，分别培养至4h、8h、16h、32h时在显微镜下观察细胞的形态结构，然后每孔加入10μlmtt(5mg/ml)检测细胞活力。
1.5酿酒酵母对ipec-j2细胞增殖的影响
1.5.1酿酒酵母的处理
取培养后的酵母菌，8000rpm/min离心5min后，吸取上清液，过0.22μm滤膜除菌，4℃保存备用；离心后的菌体细胞用dmem/f-12培养基重新悬浮菌体细胞，8000rpm/min离心5min，如此洗涤两次后用dmem/f-12培养基按等体积将菌体悬浮，4℃冰箱保存备用。
1.5.2酿酒酵母对ipec-j2细胞活力的影响
取对数生长期细胞，常规消化计数后接种至96孔板，100μl/孔，每孔细胞数为1×104个，细胞培养24h贴壁后弃掉原培养基，用pbs洗涤一次，试验分组如下：
(1)对照组：dmem/f-12培养基组；
(2)酵母发酵液(s-fl组)：每孔分别加入5μl酵母发酵液，使酵母和细胞的moi比值分别为0.1、1、10，即每孔的酵母分别为1×103、1×104、1×105个，其余95μl用dmem/f-12培养基补足；
(3)酵母菌上清液(s-cfs)组：每孔分别对应加入5μl具有与上一步相同活菌数酵母菌培养液的上清液，其余95μl用dmem/f-12培养基补足；
(4)酵母菌体细胞(s-c)组：每孔分别加入100μl用dmem/f-12稀释成不同活菌数的酵母菌，使每孔的酵母细胞分别为1×103、1×104、1×105个，即moi比值分别为0.1、1、10。
按以上分组，每组分别做6个复孔，重复3次，分别培养至1h、2h、4h、8h后，用pbs缓冲液洗涤2-3次洗掉添加的菌体，然后每孔加入100μl终浓度为0.5mg/mlmtt的dmem/f-12培养基，37℃、5％co2培养箱共同孵育4h，4h后小心吸走培养液，加入150μl的dmso在振荡器上震荡10min以使甲瓒充分溶解，用酶标仪在450nm波长下测其od值。
1.5.3酿酒酵母上清液对ipec-j2细胞活力的影响
将培养24h的酿酒酵母的发酵液8000rpm/min离心5min，收集上清液，用dmem/f-12培养基梯度稀释，分别稀释至原液的2、4、8、16、32、64、128倍。取对数生长期细胞，常规消化计数后接种至96孔板，100μl/孔，每孔细胞数为1×104个，细胞培养24h贴壁后弃掉原培养基，用pbs洗涤一次，每孔分别加入100μl上述上清稀释液，每个处理做6个复孔，重复3次，分别培养至1h、2h、4h、8h用mtt测细胞活力。
1.6酿酒酵母与don共同培养对ipec-j2细胞增殖的影响
1.6.1酿酒酵母与don共同培养对ipec-j2细胞活力的影响
取对数生长期细胞，常规消化计数后接种至96孔板，100μl/孔，每孔细胞数为1×104个，细胞培养24h贴壁后弃掉原培养基，用pbs洗涤一次，试验分组同1.7。每组6个复孔，重复3次，分别培养至4h、8h，用pbs缓冲液洗涤2-3次直至洗掉添加的菌体，然后每孔加入100μl终浓度为0.5mg/mlmtt的dmem/f-12培养基，37℃、5％co2培养箱共同孵育4h，4h后小心吸走培养液，加入150μl的dmso在振荡器上震荡10min以使甲瓒充分溶解，用酶标仪在450nm波长下测其od值。
1.6.2酿酒酵母与don共同培养对ipec-j2细胞乳酸脱氢酶释放、don残留量的影响
取对数生长期细胞，常规消化计数后接种至6孔板，2ml/孔，每孔细胞数为2×105个，细胞培养至贴壁后弃掉原培养基，用pbs洗涤一次，分组同1.8.1，每组3个重复，共培养8h后，吸取每孔培养液于2ml离心管中，3000rpm/min离心5min，重新吸取120μl上清液置于新的离心管中，根据乳酸脱氢酶(ldh)试剂盒步骤测ldh释放量，取500μl测don的含量，计算don降解率。
1.7酿酒酵母与don共同培养对ipec-j2细胞因子基因表达量的影响
取对数生长期细胞，常规消化计数后接种至6孔板，2ml/孔，每孔细胞数为2×105个，细胞培养至贴壁后弃掉原培养基，用pbs洗涤一次，分组同1.8.1，每组3个重复，共培养8h后，吸去上清，用pbs清洗2-3次后，收集细胞。
1.7.1细胞rna提取
(1)每孔加入1mltrizol，移液枪吹打3-5次，让细胞充分裂解，室温放置5min；
(2)加入200μl氯仿至裂解液中，用手剧烈振荡15s，室温放置3min，4℃、12000×g离心15min；
(3)小心转移上清液(～300μl)至新的1.5ml离心管中，加入600μl异丙醇，涡旋混匀，室温静置10min，4℃、12000×g离心10min以沉淀rna；
(4)弃去上清液，加入1ml75％乙醇，涡旋混匀，4℃，7500×g离心5min；
(5)弃去上清液，把离心管反扣于干净的吸水纸上吸取残留的液体，空气干燥10-15min。
(6)加入20μlrnase-free水至rna沉淀中，涡旋重悬rna沉淀，冰上放置10-30min让rna充分溶解，-80℃保存备用；
(7)取1μlrna储存液检测其浓度。
1.7.2cdna的合成
将提取的rna反转录成cdna，反转录操作按照宝生物工程(大连)有限公司
1.7.3实时荧光定量pcr检测
(1)引物设计
根据genbank上已有的猪基因mrna序列，用primierpremier5.0软件设计定量引物(表2)，引物由上海生物工程科技有限公司合成。
(2)反应体系
按照宝生物primescripttmrtreagentkitperfectrealtime试剂盒说明书进行，反应体系为如表3。
(3)反应程序：反应体系在bio-radiq5荧光定量pcr仪上进行，反应程序如表4。
表2荧光定量引物
表3rt-pcr反应体系(μl)
表4rt-pcr反应程序
1.8酿酒酵母和don共培养对ipec-j2细胞凋亡的影响
取对数生长期细胞，常规消化计数后接种至6孔板，2ml/孔，每孔细胞数为5×105个，细胞培养至贴壁后弃掉原培养基，用pbs洗涤一次。试验分为对照组，酿酒酵母组(和细胞比例为1:1)，don添加组(1.2μg/ml)，酿酒酵母+don组，每组3个重复。共培养8h后，吸去上清液，用pbs清洗2-3次后，用无edta的胰酶消化3min后1000rpm离心5min，之后用pbs清洗2次，2000rpm离心5min，收集细胞。加入500μl的bindingbuffer悬浮细胞，加入5μlannexinv-fitc混匀后，加入5μlpropidiumiodide混匀，室温避光反应15min后上机检测。
1.9数据分析
试验结果用平均值±标准误表示，用spss20.0进行方差分析和多重性检验，用turkey法进行显著性比较，以p<0.05表示差异显著。qpcr试验结果数据用bio-radcfx96软件的比较ct(2-△△ct法)法进行分析计算。
2结果分析
2.1不同don浓度对ipec-j2细胞活力的影响
不同don浓度作用ipec-j2细胞24h后对细胞活力的影响如图1。由图1可知，don对ipec-j2细胞的影响呈剂量依赖效应，细胞活力随着don浓度的增加显著下降(p<0.05)。当don浓度大于0.075μg/ml时，细胞增值率显著下降(p<0.05)。don浓度为0.075μg/ml-19.2μg/ml时，对细胞增殖抑制率分别为9.49％(p>0.05)及16.19％、22.74％、36.18％、38.96％、40.46％、43.00％、46.70％、50.94％(p<0.05)。
2.2不同don浓度不同时间对ipec-j2细胞活力的影响
由表5可知，在2h时，所有don浓度与对照组细胞活力相比差异不显著(p>0.05)。4h时，don浓度为0.075μg/ml和0.15μg/ml时与对照组差异不显著(p>0.05)；don浓度为0.3μg/ml、0.6μg/ml、1.2μg/ml时与对照组差异显著(p<0.05)，各don浓度之间差异不显著(p>0.05)。8h时，don浓度为0.075μg/ml与对照组差异不显著(p>0.05)，其余四个浓度均与对照组差异显著(p<0.05)。16h和32h时，5个don浓度均显著地降低细胞活力(p<0.05)，don浓度为0.15μg/ml、0.3μg/ml、0.6μg/ml和1.2μg/ml在32h时差异显著(p<0.05)。细胞生长呈剂量-时间依赖性，同一毒素浓度，细胞增殖率随着时间的增加呈现下降趋势；同一时间，细胞增值率随着时间延长而减小。与对照组相比，不同浓度don作用4h时细胞增殖率分别为89.31％(p>0.05)、87.83％(p>0.05)及86.53％、85.00％、85.78％(p<0.05)；8h时细胞增殖率分别为95.25％(p>0.05)及82.27％、89.01％、82.12％、78.11％(p<0.05)；16h细胞增殖率分别为88.42％(p<0.05)、91.14％(p>0.05)及77.74％、69.62％、69.64％(p<0.05)；32h细胞增殖率分别为94.45％、88.83％、80.42％、72.10％、64.56％(p<0.05)。
表5不同don浓度不同时间对ipec-j2细胞活力(od值)的影响(n＝6)
注：大写英文字母表示不同don浓度作用相同时间对ipec-j2细胞活力的差异性；小写字母表示同一don浓度作用不同时间对ipec-j2细胞活力的差异性。下同。
2.3酿酒酵母对ipec-j2细胞增殖的影响
2.3.1酿酒酵母不同成分对ipec-j2细胞增殖的影响
由表6可知，moi为0.1和1时，酵母上清液和发酵液在各个时间段均对细胞的增殖无显著影响(p>0.05)；8h时，moi分别为1和10的酵母菌体细胞添加组间差异不显著(p>0.05)，但较对照组细胞活力分别增加了25.71％(p>0.05)和37.14％(p<0.05)。
2.3.2酿酒酵母菌培养的上清液对ipec-j2细胞增殖的影响
由表7可知，酿酒酵母上清稀释液在1h、2h、4h时和对照组差异不显著(p>0.05)，在8h时，上清液稀释2倍时显著抑制细胞的增殖(p<0.05)，细胞增殖抑制率为30.77％(p<0.05)。
表6酿酒酵母不同成分对ipec-j2细胞活力(od值)的影响(n＝6)
表7酿酒酵母菌培养的上清液对ipec-j2细胞活力(od值)的影响(n＝6)
2.3.3酿酒酵母干扰don对ipec-j2细胞增殖的影响
由表8可知，4h时，酿酒酵母添加组和对照组相比，细胞活力增加了7.69％(p>0.05)，当don浓度为1.2μg/ml时，添加酵母组细胞活力比未添加酵母组提高了21.05％(p<0.05)；8h时，酵母添加组比对照组细胞活力增加了44.83％(p<0.05)，当don浓度为0.075μg/ml、0.15μg/ml、0.3μg/ml、0.6μg/ml、1.2μg/ml时，添加酵母组与未添加酵母组相比，细胞活力分别增加29.63％、11.11％、20.83％、4％、4.17％，但均差异不显著(p>0.05)。
表8酿酒酵母和don共培养对ipec-j2细胞活力(od值)的影响(n＝6)
2.3.4酿酒酵母和don共培养对细胞ldh释放及don残留量的影响
由表9可知，当don浓度大于0.075μg/ml时，均显著增加ldh的释放量(p<0.05)，和对照组相比，ldh释放分别增加7.14％(p>0.05)及146.43％、160.71％、182.14％、167.86％(p<0.05)。酿酒酵母和对照组相比能降低ldh释放，但是差异不显著(p>0.05)；酵母和don组与don组相比，ldh释放分别降低了26.67％(p>0.05)及66.67％、69.86％、72.15％、68.00％(p<0.05)。酵母和don添加组与相应的don添加组中don的浓度差异不显著(p>0.05)，但是都在一定程度上降低了don的浓度，其降解率分别为57.14％、46.15％、42.31％、26.67％、13.51％(p>0.05)。
表9酿酒酵母和不同浓度的don共培养对细胞ldh释放及don残留量的影响(n＝3)
2.3.5酿酒酵母和don共培养对ipec-j2细胞相关基因表达量的影响
酿酒酵母和不同浓度的don共培养对细胞因子的mrna的表达量见图2。由图2可知，don浓度为1.2μg/ml时和对照组相比il-6的基因表达量上调了67％(p<0.05)，其他浓度的don对il-6的表达量均无显著影响(p>0.05)；酵母分别和0.3、0.6、1.2μg/mldon共同添加组较对应的don添加组对il-6的表达量分别上调了50.89％、123.88％、110.78％(p<0.05)。由图3可知，don浓度为0.075μg/ml和0.3μg/ml时，il-8表达量分别下调了46％(p<0.05)和36％(p<0.05)；加入酵母和don后较只加don组相比，都显著上调了il-8的表达量，上调率分别为83.33％、73.44％、59.22％、153.33％、221.55％(p<0.05)。由图4可知，不同浓度的don与对照组比对il-10的表达均无显著影响(p>0.05)；酵母加don(1.2μg/ml)组与don(1.2μg/ml)组相比对il-10的表达量上调了36.81(p<0.05)。由图5可知，随着don浓度的增加，tjp的表达量呈现增加趋势，与对照组相比，对tjp的表达上调率分别为18％(p>0.05)及55％、91％、80％、116％(p<0.05)；酵母和don共培养组较don组下调了tjp的表达量，当don浓度为0.3μg/ml时，tjp下调率为36.13％(p<0.05)。由图6可知，don添加组都上调了occludin的表达量，与对照组相比，occludin上调率分别为48％(p>0.05)、44％(p>0.05)、175％(p<0.05)、100％(p<0.05)、150％(p<0.05)；酵母和don共培养组较don组来说都下调了occludin的表达量，下调率分别为35.81％(p<0.05)、27.78％(p>0.05)、50.18％(p<0.05)、19％、18.4％(p>0.05)。
2.3.6酿酒酵母和don共培养对ipec-j2细胞凋亡的影响
由图7和表10可以看出，don添加组和对照组相比显著增加了晚期凋亡细胞的比例(p<0.05)，是对照组的4.53倍，早期凋亡细胞是对照组的2.23倍(p<0.05)，死细胞数是对照组的2.83倍(p<0.05)；酵母和don共培养组与don组相比，早期和晚期凋亡细胞分别下降了44.78％和46.37％(p<0.05)，活细胞数增加了2.35％(p<0.05)，坏死细胞数降低了38.05％(p>0.05)；酵母组和对照组对比，各参数皆差异不显著(p>0.05)。
表10酿酒酵母和don共培养对ipec-j2增殖和凋亡的影响(％)
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。