本发明涉及一种培养方法，尤其涉及一种可提高虾青素产量的红法夫酵母培养方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
虾青素(astaxanthin)的化学名为3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素。其分子结构中有两个β-紫罗兰酮环，11个共轭双键，是一种萜烯类不饱和化合物。虾青素作为一种高效的纯天然抗氧化剂，具有清除人体内自由基，提高人体抗衰老能力的功能。天然虾青素能够穿透血脑屏障、血胰腺屏障、血睾丸屏障这三大人类主要屏障，并且是唯一能穿透血脑屏障的类胡萝卜素，因此是可能作用于脑细胞和眼球视网膜的唯一一种类胡萝卜素。近年随着虾青素生物功能研究和药理药效试验的不断深入，虾青素因其在心血管疾病、癌症、代谢综合征、糖尿病、神经退行性疾病、眼科疾病、皮肤病等疾病的预防和治疗中具有突出的效果而受到了科学界极大的关注，表明虾青素在医药、保健品等领域中具有巨大的潜在应用价值和广阔开发前景。
微生物法生产虾青素主要是采用藻类培养和红法夫酵母发酵两种方法。雨生红球藻虾青素含量虽然较高，但是雨生红球藻的生长条件极其苛刻，对水质、环境以及光照的要求很高，并且存在自养周期长等特点，因此大规模生产比较困难。红法夫酵母是除雨生红球藻外最为适合生产虾青素的微生物，其具有作为虾青素生物来源的一些必要特征：能够利用多种糖作为碳源进行异养代谢；培养时间短，并且不需要光照；能够在发酵罐中实现高密度培养；提取后的酵母细胞还可以提供其它营养物质，如蛋白质、脂类和维生素b等，因此，采用红法夫酵母生产虾青素具有更加广阔的开发前景。目前，从红法夫酵母中提取虾青素的方法已经趋于成熟，因此，众多学者都在通过微生物培养的方法从根源上提高虾青素的产量。
技术实现要素：
为了解决上述技术所存在的不足之处，本发明提供了一种可提高虾青素产量的红法夫酵母培养方法。
为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是：一种可提高虾青素产量的红法夫酵母培养方法，其整体步骤为：
步骤一、摇瓶种子培养：取斜面菌种，将菌苔接种于摇瓶种子培养基中，于20～22℃下培养48～72h，得到摇瓶种子培养液；
步骤二、摇瓶发酵培养：按5～10％的体积比将摇瓶种子培养液接种于装有50ml发酵液的三角瓶中，于20～22℃、160～200rpm下发酵培养96～120h；发酵培养过程置于全程有光或部分有光的光照条件下进行；
步骤三、发酵罐培养：按5～10％的体积比将摇瓶发酵培养液接种于5l发酵罐中，发酵罐的装液体积为2.5～3.5l，温度控制在20～22℃，转速为80～400rpm，控制溶氧不低于40～60％，用柠檬酸和naoh溶液控制ph在4.0～6.0，发酵时间为120～210h；发酵罐培养的光照条件与步骤二相同或不同。
进一步地，摇瓶种子培养基、发酵液在接种之前，均经过121℃、25min高压灭菌处理。
进一步地，摇瓶种子培养基、摇瓶发酵培养液的配方均为：葡萄糖2～10g/l，酵母浸粉2～6g/l，麦芽浸粉2～6g/l，蛋白胨2～10g/l，ph6.0。
进一步地，发酵罐培养液的配方为：葡萄糖20～30g/l，酵母浸粉5～15g/l，蛋白胨2～10g/l，硫酸铵2～10g/l，麦芽浸粉2～8g/l。
进一步地，摇瓶发酵培养及发酵罐培养均置于全程有光的光照条件下进行。或者，摇瓶发酵培养及发酵罐培养均置于有光/无光＝12h/12h的交替光照条件下进行。或者，摇瓶发酵培养过程中，前36～60h置于无光条件下，后60～84h置于有光的条件下进行；所述发酵罐培养置于全程有光的光照条件下进行。或者，摇瓶发酵培养过程中，前36～60h置于无光条件下，后60～84h置于有光/无光＝12h/12h的交替光照条件下进行；所述发酵罐培养置于全程有光的光照条件下进行。或者，摇瓶发酵培养过程中，前36～60h置于有光条件下，后60～84h置于有光/无光＝12h/12h的交替光照条件下进行；所述发酵罐培养置于全程有光的光照条件下进行。
本发明通过光照条件可显著提高红法夫酵母生产虾青素的产量，对于在工业上采用红法夫酵母高效生产天然虾青素具有重要的研究价值及良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
一种可提高虾青素产量的红法夫酵母培养方法，整体步骤为：
步骤一、摇瓶种子培养：取斜面菌种，将菌苔接种于摇瓶种子培养基中，于20～22℃下培养48～72h，得到摇瓶种子培养液；
步骤二、摇瓶发酵培养：按5～10％的体积比将摇瓶种子培养液接种于装有50ml发酵液的三角瓶中，于20～22℃、160～200rpm下发酵培养96～120h；发酵培养过程置于全程有光或部分有光的光照条件下进行；
步骤三、发酵罐培养：按5～10％的体积比将摇瓶发酵培养液接种于5l发酵罐中，发酵罐的装液体积为2.5～3.5l，温度控制在20～22℃，转速为80～400rpm，控制溶氧不低于40～60％，用柠檬酸和naoh溶液控制ph在4.0～6.0，发酵时间为120～210h；发酵罐培养的光照条件与步骤二相同或不同。
摇瓶种子培养基、发酵液在接种之前，均经过121℃、25min高压灭菌处理。
摇瓶种子培养基、摇瓶发酵培养液的配方均为：葡萄糖2～10g/l，酵母浸粉2～6g/l，麦芽浸粉2～6g/l，蛋白胨2～10g/l，ph6.0。
发酵罐培养液的配方为：葡萄糖20～30g/l，酵母浸粉5～15g/l，蛋白胨2～10g/l，硫酸铵2～10g/l，麦芽浸粉2～8g/l。
下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步展示：
【实施例一】
一种可提高虾青素产量的红法夫酵母培养方法，整体步骤为：
步骤一、摇瓶种子培养：取斜面菌种，将菌苔接种于摇瓶种子培养基中，于20℃下培养72h，得到摇瓶种子培养液；
步骤二、摇瓶发酵培养：按5％的体积比将摇瓶种子培养液接种于装有50ml发酵液的三角瓶中，于20℃、160rpm下发酵培养120h；
步骤三、发酵罐培养：按5％的体积比将摇瓶发酵培养液接种于5l发酵罐中，发酵罐的装液体积为2.5l，温度控制在20℃，转速为80rpm，控制溶氧不低于40％，用柠檬酸和naoh控制ph在4.0，发酵时间为210h。
摇瓶种子培养基及摇瓶发酵培养液的配方为：葡萄糖2g/l，酵母浸粉2g/l，麦芽浸粉2g/l，蛋白胨2g/l，ph6.0。
发酵罐培养液的配方为：葡萄糖20g/l，酵母浸粉5g/l，蛋白胨2g/l，硫酸铵2g/l，麦芽浸粉2g/l。
本实施例中，摇瓶发酵培养及发酵罐培养均置于全程有光的光照条件下进行。
【实施例二】
一种可提高虾青素产量的红法夫酵母培养方法，整体步骤为：
步骤一、摇瓶种子培养：取斜面菌种，将菌苔接种于摇瓶种子培养基中，于22℃下培养48h，得到摇瓶种子培养液；
步骤二、摇瓶发酵培养：按10％的体积比将摇瓶种子培养液接种于装有50ml发酵液的三角瓶中，于22℃、200rpm下发酵培养96h；
步骤三、发酵罐培养：按10％的体积比将摇瓶发酵培养液接种于5l发酵罐中，发酵罐的装液体积为3.5l，温度控制在22℃，转速为400rpm，控制溶氧不低于60％，用柠檬酸和naoh控制ph在6.0，发酵时间为120h。
摇瓶种子培养基及摇瓶发酵培养液的配方为：葡萄糖10g/l，酵母浸粉6g/l，麦芽浸粉6g/l，蛋白胨10g/l，ph6.0。
发酵罐培养液的配方为：葡萄糖30g/l，酵母浸粉15g/l，蛋白胨10g/l，硫酸铵10g/l，麦芽浸粉8g/l。
本实施例中，摇瓶发酵培养及发酵罐培养均置于有光/无光＝12h/12h的交替光照条件下进行。
【实施例三】
一种可提高虾青素产量的红法夫酵母培养方法，整体步骤为：
步骤一、摇瓶种子培养：取斜面菌种，将菌苔接种于摇瓶种子培养基中，于21℃下培养60h，得到摇瓶种子培养液；
步骤二、摇瓶发酵培养：按8％的体积比将摇瓶种子培养液接种于装有50ml发酵液的三角瓶中，于21℃、180rpm下发酵培养105h；
步骤三、发酵罐培养：按8％的体积比将摇瓶发酵培养液接种于5l发酵罐中，发酵罐的装液体积为3l，温度控制在21℃，转速为200rpm，控制溶氧不低于50％，用柠檬酸和naoh控制ph在5.0，发酵时间为160h。
摇瓶种子培养基及摇瓶发酵培养液的配方为：葡萄糖5g/l，酵母浸粉4g/l，麦芽浸粉4g/l，蛋白胨8g/l，ph6.0。
发酵罐培养液的配方为：葡萄糖25g/l，酵母浸粉10g/l，蛋白胨8g/l，硫酸铵5g/l，麦芽浸粉5g/l。
本实施例中，摇瓶发酵培养过程的前40h置于无光条件下，后65h置于有光的条件下进行；发酵罐培养置于全程有光的光照条件下进行。
【实施例四】
一种可提高虾青素产量的红法夫酵母培养方法，整体步骤为：
步骤一、摇瓶种子培养：取斜面菌种，将菌苔接种于摇瓶种子培养基中，于21℃下培养60h，得到摇瓶种子培养液；
步骤二、摇瓶发酵培养：按8％的体积比将摇瓶种子培养液接种于装有50ml发酵液的三角瓶中，于21℃、180rpm下发酵培养105h；
步骤三、发酵罐培养：按8％的体积比将摇瓶发酵培养液接种于5l发酵罐中，发酵罐的装液体积为3l，温度控制在21℃，转速为200rpm，控制溶氧不低于50％，用柠檬酸和naoh控制ph在5.0，发酵时间为160h。
摇瓶种子培养基及摇瓶发酵培养液的配方为：葡萄糖8g/l，酵母浸粉5g/l，麦芽浸粉3g/l，蛋白胨5g/l，ph6.0。
发酵罐培养液的配方为：葡萄糖23g/l，酵母浸粉12g/l，蛋白胨6g/l，硫酸铵6g/l，麦芽浸粉4g/l。
本实施例中，摇瓶发酵培养过程的前36h置于无光条件下，后69h置于有光/无光＝12h/12h的交替光照条件下进行；发酵罐培养置于全程有光的光照条件下进行。
【实施例五】
一种可提高虾青素产量的红法夫酵母培养方法，整体步骤为：
步骤一、摇瓶种子培养：取斜面菌种，将菌苔接种于摇瓶种子培养基中，于20℃下培养72h，得到摇瓶种子培养液；
步骤二、摇瓶发酵培养：按6％的体积比将摇瓶种子培养液接种于装有50ml发酵液的三角瓶中，于20℃、160rpm下发酵培养120h；
步骤三、发酵罐培养：按6％的体积比将摇瓶发酵培养液接种于5l发酵罐中，发酵罐的装液体积为3l，温度控制在20℃，转速为300rpm，控制溶氧不低于50％，用柠檬酸和naoh控制ph在5.0，发酵时间为150h。
摇瓶种子培养基及摇瓶发酵培养液的配方为：葡萄糖4g/l，酵母浸粉5g/l，麦芽浸粉4g/l，蛋白胨4g/l，ph6.0。
发酵罐培养液的配方为：葡萄糖28g/l，酵母浸粉8g/l，蛋白胨4g/l，硫酸铵8g/l，麦芽浸粉7g/l。
本实施例中，摇瓶发酵培养过程的前60h置于有光条件下，后60h置于有光/无光＝12h/12h的交替光照条件下进行；发酵罐培养置于全程有光的光照条件下进行。
为了对上述实施例的具体使用效果做进一步验证，以无光培养的对照试验作对比，对各实施例中虾青素的产量进行比较，结果表1所示：
表1
以上对比试验中，所用的测试方法如下：
一、生物量的测定(细胞干重法)：取10ml发酵液，于10000rpm离心5min，细胞用去离子水洗两次，离心后转入称量瓶中(已称重m0)，在烘箱中于105℃烘干至衡重，然后称重m1。
生物量计算公式：
式中：
x——试样中的生物量，g/l；
m1——烘干样品及称量瓶的质量，g；
m0——空称量瓶的质量，g；
v——样品注入体积，ml；
1000——单位换算系数。
每个试样取3个平行样进行测定，以其算术平均值为结果，结果保留小数点后2位。
二、虾青素含量的测定
1)虾青素提取方法
准确称取0.1g(精确至0.0001g)的产品粉末加入50ml离心管中，用5ml移液枪向离心管中加入10ml二甲基亚砜，使用漩涡混合器充分混合。将离心管放置在超声波清洗器中。进行第一次浸提，浸提时间20min，浸提温度40℃，超声强度无要求。浸提结束漩涡混匀后，在10000rpm条件下离心5min，收集上清。向经过浸提、离心后的残渣中加入10ml二甲基亚砜，漩涡混匀后放置在超声波清洗器中。进行第二次浸提，浸提时间20min，浸提温度40℃，超声强度无要求。浸提结束漩涡混匀后在10000rpm条件下离心5min，收集上清。向上一步离心后的残渣中加入10ml二甲基亚砜，漩涡混匀后放置在超声波清洗器中。进行第三次浸提，浸提时间20min，浸提温度40℃，超声强度无要求，浸提结束漩涡混匀后在10000rpm条件下离心5min，收集上清。将前三次上清混合，在10000rpm条件下离心5min，除去残留固体杂质备用。
2)标准品处理及标准曲线绘制
准确称取虾青素标准品0.002g(2mg)精确到0.00001g(0.01mg)，用二甲基亚砜完全溶解并定容至100ml容量瓶中，得到20μg/ml标准液母液，对该母液按照1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml进行梯度稀释，各梯度标准液在490nm处进行分光光度计测定，使用上述各浓度及所对应吸光值绘制标准曲线，要求线性回归方程(y＝ax+b)中的相关系数的平方(r2)>0.995。
3)样品处理方法
使用二甲基亚砜对提取液进行适当稀释，稀释倍数记为k，漩涡震荡后在490nm处使用分光光度计测吸光值，记录所得吸光值a，要求吸光值在0.2-0.9之间。
计算公式：
式中：
c——样品中的虾青素含量，单位mg/g；
a——样品中虾青素的吸光值；
b——线性回归方程标准曲线中的截距；
v——提取所用的溶剂体积，单位为毫升(ml)；
a——线性回归方程标准曲线中的斜率(ml/μg)；
k——样品稀释倍数；
m——称取样品质量，单位为克(g)；
1000——单位换算系数。
每个试样取3个平行样进行测定，以其算术平均值为结果，结果保留小数点后2位。
三、虾青素产量的测定
虾青素产量的计算公式：a＝c×x
式中：
a——试样中虾青素的产量，mg/l；
c——试样中虾青素的含量，mg/g；
x——试样中的红法夫酵母生物量，g/l。
本发明利用红法夫酵母液体深层发酵生产虾青素，在培养过程中给予不同时间段的光照条件，研究光照对红法夫酵母生长及虾青素合成的影响。结果表明，光照对于红法夫酵母细胞生长无明显影响，但可以显著促进虾青素的合成，对于在工业上采用红法夫酵母高效生产天然虾青素具有重要的研究价值及良好的应用前景。
上述实施方式并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的技术方案范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也均属于本发明的保护范围。