小麦HsfA2亚族基因在酵母中耐热性的鉴定方法与流程

本发明属于通过转基因酵母进行基因功能鉴定相关技术领域。具体为遗传转化小麦a2亚族热激转录因子基因的酵母细胞耐热性的鉴定方法。

背景技术：

随着全球温室效应的加剧,全球气候变暖已经成为现代农业生产体系所面临的严峻挑战。小麦作为世界范围内一种重要的作物，其产量越来越受到全球变暖的不利影响，我国温带小麦在生育期间经常遭受干热风危害，导致小麦产量和品质均不同程度降低，一般年份造成小麦减产5-10%，偏重年份达30%。因此，提高小麦耐热性，创制小麦耐热新种质、培育耐热性强的品种是降低高温胁迫危害的关键。现代分子生物学和基因工程相关技术的发展，使人们在分子水平上揭示植物对高温胁迫响应和诱导相关信号传导途径成为可能，同时为通过基因工程手段提高作物耐热胁迫能力成为现实。而解析小麦高温胁迫响应的分子机制、挖掘优质的抗逆基因是关键。

由于植物的不可移动性，导致其会持续的暴露在热胁迫环境当中。为了适应这种长期的胁迫环境，植物进化出一套应对胁迫的响应网络。热激转录因子（hsf）是热胁迫传导链的末端调控元件，能够通过激活热胁迫和其它胁迫响应基因的表达从而提高植物耐热性，是优异的作物品种改良基因资源。

自酵母hsf首先被发现以来，模式植物拟南芥和番茄hsf家族得以重点研究，近年来，多种作物的hsf家族基因被生物信息学推测和报道。不同作物家族基因数量不等，拟南芥和番茄分别有21个和24个hsfs，大田作物hsf家族基因数目多，玉米有30个，小麦热激转录因子家族至少有56个小麦hsfs被识别。研究表明，hsf家族包括a、b和c家族，不同家族细分多个亚族，每个亚族又包括不同的基因成员。a2亚族基因不仅参与植株基础耐热性调控，与植物的获得耐热性密切相关，在热胁迫后期及恢复阶段起重要的调控作用。

因此，在hsfa2基因克隆和特性研究的基础上进行多方面功能鉴定，是功能基因研究的重要环节，前人对耐热基因研究相对较少，基因的耐热性鉴定缺乏成熟的技术体系。加之，热胁迫处理受多种外界因素影响，稳定性差，鉴定结果的准确性差。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种稳定性和准确性好的小麦hsfa2亚族基因在酵母中耐热性的鉴定方法。

本发明采用如下技术方案：

小麦hsfa2亚族基因在酵母中耐热性的鉴定方法，其包括如下步骤：

（1）利用重组反应系统设计扩增小麦hsfa2亚族基因特异引物对，利用高保真pcr聚合酶扩增，获得小麦hsfa2亚族基因的pcr产物；

（2）利用限制性内切酶kpni和ecori对载体pyes2进行酶切，电泳后回收得到线性化载体，将pcr产物与线性化载体按1∶2的摩尔比混合，利用clonexpressii快速克隆技术进行重组反应；

（3）利用热激法将反应产物直接转化大肠杆菌top10感受态细胞，37℃倒置培养过夜；

（4）将单个菌落挑至100µl新鲜的lb培养基中，混匀，取2µl作为模板进行pcr扩增，根据电泳条带大小选择正确的克隆进行序列测定；

（5）将测序正确的重组载体转化酵母invsc1感受态细胞，然后将细胞均匀涂抹在sc-glu-ura-筛选平板上，30℃培养2~3d；

（6）采用菌落pcr方法鉴定阳性克隆，分别以重组载体和空载体转化酵母细胞invsc1，筛选阳性酵母克隆；

（7）分别挑选2个菌株的阳性克隆，在sc-glu-ura-液体培养基震荡，250rpm，培养过夜，检测od600值，用sc-gal-ura-液体培养基将酵母菌液稀释到od600至0.2，重新震荡，200rpm，培养2-3h，在od600值达到0.4-0.8之间即酵母指数生长期，离心收集菌体，无菌水洗涤两遍，除去培养基；

（8）梯度稀释到0.1、0.05和0.01共3个od600值，分成2组，一组作为对照，另一组置于50℃水浴中热激处理45min，吸取8µl，分别点在加入半乳糖的sc-gal-ura-固体培养基上，30℃恒温培养箱生长2-3天，观察并拍照；

（9）热胁迫条件下，若转基因酵母细胞较野生型酵母具有更好的生长势和生长速率，则该小麦hsfa2亚族基因在酵母中具有耐热性。

鉴定方法中，步骤（2）中的重组反应为：于冰水浴中配制反应体系，含4µl5×clonexpressiibuffer，50~200ng线性化载体，20~200ng插入片段扩增产物，2µlexnaseii，加无菌水至总体积2µl。混匀各组分后，于37℃反应30min，之后立即置冰浴中冷却5min。

鉴定方法中，所述小麦hsfa2基因为tahsfa2e时，所述步骤（1）中的特异引物对包括前引物和后引物，所述前引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述后引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；

seqidno.1：

5′-gggaatattaagcttggtaccatggaccgggtgctgctg-3′

seqidno.2：

5′-tgatggatatctgcagaattcctacgcgtcgaaacat-3′。

鉴定方法中，所述重组反应系统为clonexpressii重组反应系统。

本发明的有益效果在于：通过对过表达小麦热激转录因子基因的酵母细胞的耐热性鉴定，可初步明确基因的耐热性调控功能，为小麦热激转录因子家族基因的功能研究提供理论证据。

酵母只有一个hsf，相对简单，利用过表达酵母细胞鉴定热响应基因耐热性功能技术还不成熟，对酵母进行不同的热激处理方式显著影响鉴定结果的准确性。本发明通过反复对遗传转化小麦热激转录因子基因的酵母细胞耐热性进行鉴定，形成了一套成熟的转a2亚族热激转录因子基因的酵母耐热性鉴定技术，适合于所有作物hsfa2亚族基因转入酵母的耐热性鉴定，为其他作物hsfa2以及其他热响应基因的耐热性鉴定提供重要的技术支撑。

附图说明

图1为选取的一个小麦tahsfa2e的cdna及其编码氨基酸序列。

图2为遗传转化tahsfa2e的酵母细胞在正常和热激条件下耐热性表型图。

图3为遗传转化tahsfa2e的酵母细胞在正常和热激条件下的生长曲线图。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述，该实施例是示例性的，仅用于解释本发明，并不对保护范围构成限定。

选取小麦a2亚族热激转录因子中的一个代表性基因tahsfa2e，所述核苷酸的序列如图1所示。

酵母表达载体pyes2（invitrogen,美国）用于酿酒酵母中目的蛋白的表达，其特点在于gal1启动子能够在酿酒酵母中被半乳糖高水平诱导从而驱动目的蛋白表达，同时能够被葡萄糖抑制表达，可利用ura3基因筛选带有ura3基因型的酵母宿主菌株转化子。

结合clonexpressii重组反应系统（诺唯赞生物科技有限公司）设计扩增tahsfa2e特异引物，前引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，后引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；

seqidno.1：

5′-gggaatattaagcttggtaccatggaccgggtgctgctg-3′

seqidno.2：

5′-tgatggatatctgcagaattcctacgcgtcgaaacat-3′。

利用高保真pcr聚合酶扩增，获得tahsfa2e的pcr产物。利用限制性内切酶kpni和ecori（neb）对载体pyes2进行酶切，电泳后回收得到线性化载体。将pcr产物与线性化载体按1∶2的摩尔比混合，利用clonexpressii快速克隆技术进行重组反应。于冰水浴中配制反应体系，含4µl5×clonexpressiibuffer，50~200ng线性化载体，20~200ng插入片段扩增产物，2µlexnaseii，加无菌水至总体积2µl。混匀各组分后，于37℃反应30min，之后立即置冰浴中冷却5min，然后利用热激法将反应产物直接转化大肠杆菌top10感受态细胞，37℃倒置培养过夜。用无菌的牙签将单个菌落挑至100µl新鲜的lb培养基中，混匀，取2µl作为模板进行pcr扩增，根据电泳条带大小选择正确的克隆进行序列测定。

将测序正确的重组载体转化酵母invsc1感受态细胞，然后将细胞均匀涂抹在sc-glu-ura^-筛选平板上，30℃培养2~3d。采用菌落pcr方法鉴定阳性克隆，分别以重组载体pyes2-tahsfa2e和空载体pyes2转化酵母细胞invsc1，筛选阳性酵母克隆。

分别挑选2个菌株的阳性克隆，在sc-glu-ura^-液体培养基震荡（250rpm）培养过夜，检测od600值，用sc-gal-ura^-液体培养基将酵母菌液稀释到od600至0.2，重新震荡（200rpm）培养2-3h，在od600值达到0.4-0.8之间即酵母指数生长期，离心收集菌体，无菌水洗涤两遍，除去培养基。

梯度稀释到0.1、0.05和0.01共3个od600值，分成2组，一组作为对照，另一组置于50℃水浴中热激处理45min，吸取8µl，分别点在加入半乳糖的sc-gal-ura^-固体培养基上。30℃恒温培养箱生长2-3天，观察并拍照。

图2和图3所示，通过构建酵母表达载体并将tahsfa2e在酵母中进行遗传转化，对阳性菌株进行耐热性鉴定发现，正常生长条件下，转tahsfa2e酵母与转空载体对照酵母菌斑的长势没有明显差异。50℃水浴热处理后，转tahsfa2e酵母与对照长势均降低，但转基因酵母的生长势明显好于对照，菌液浓度稀释为0.05时，转空载体酵母菌斑明显减少（图2）。从酵母细胞生长曲线也可看出（图3），正常培养条件下转pyes2和pyes2-tahsfa2e酵母细胞生长较快，生长速度没有明显差异；50℃热激处理后细胞生长速度均降低，但处理18h后转pyes2-tahsfa2e酵母细胞生长速率明显高于转空载体对照细胞，表明tahsfa2e能在酵母细胞中被诱导表达，且能显著提高酵母细胞的耐热性。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，但并不限于此，本领域的技术人员很容易根据上述实施例领会本发明的精神，并作出不同的引申和变化，但只要不脱离本发明的精神，都在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>河北省农林科学院遗传生理研究所（河北省农林科学院农产品质量安全研究中心）

<120>小麦hsfa2亚族基因在酵母中耐热性的鉴定方法

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