蜻蜓凤梨AfTOE1L基因的克隆及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学和生物技术领域，涉及蜻蜓凤梨中apetala2/ethylene-responsiveelementbindingprotein(ap2/erebp)转录因子家族成员编码基因aftoe1-like(aftoe1l)的克隆、重组及对开花形态决定和种子大小调控功能的分析和应用。

背景技术：

ap2/erebp转录因子是一类广泛存在于植物、原生生物、蓝藻和噬菌体中的家族蛋白，在生物体应对外源环境信号调控生长发育过程中起着重要作用。ap2/erebp转录因子家族蛋白可分为ap2亚族和erebp亚族两大类，其中ap2亚族成员均含有2个ap2结构域，erebp亚族则只含有一个ap2结构域。ap2结构域高度保守，由约68个氨基酸残基组成，其中由18个氨基酸组成的核心区域可组成亲水的α螺旋。ap2结构域对ap2亚族蛋白的功能起着至关重要的作用。除了含有两个保守的ap2结构域外，大多数ap2亚族还含有一个核定位信号。

拟南芥中有6个ap2亚族成员，分别为ap2、targetofeat1(toe1)、toe2、toe3、(smz)以及schnarchzapfen(snz)。其中ap2在种子发育、干细胞功能的维持、开花起始以及花器官决定等方面都具有重要功能。例如，ap2既可以作为转录激活因子调控开花抑制子agamous-like15(agl15)的表达，又可以作为一个转录抑制因子抑制开花激活子suppressorofoverexpressionofconstans1(soc1)的表达，从而调控开花起始。此外，在花器官决定的abce模型中，作为a类基因，ap2与apetala1(ap1)以及e类基因共同调控了第一轮花萼和第二轮花瓣的发育。此外，在开花时期转换中，拟南芥中的ap2以及其他5个ap2亚族成员功能冗余，除了toe3，过表达其他5个ap2类基因均能显著延迟开花。拟南芥toe1突变体显著早花，toe1toe2双突变体开花时间更进一步提前。虽然smz或snz突变体开花时间并没有变化，但四突toe1toe2smzsnz比双突变体toe1toe2的开花时间更早。此外，所有ap2亚族编码基因突变后的拟南芥植株相对于四突toe1toe2smzsnz的开花时间则又提前。研究发现，toe1以及smz可以直接结合到成花素ft的启动子区抑制后者表达，从而抑制开花；ap2则可以结合到ag基因的第二个内含子区的at-rich元件上，决定花的形态。

蜻蜓凤梨是一种观赏性很强的观花观叶植物，目前蜻蜓凤梨主要以自然开花为主，如何人工精细调控花期，使凤梨在市场热销时期开花，及通过基因工程手段培育凤梨新品种已成为研究人员的研究方向之一。蜻蜓凤梨中的aftoe1l与其他植物的ap2亚族成员高度同源，两个典型的ap2结构域以及核定位信号也都很保守，推测可能在花期调控中起重要作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种蜻蜓凤梨aftoe1l基因的克隆及其应用，以蜻蜓凤梨心叶为材料，利用ctab法提取总rna分别合成5’和3’race模板，经pcr扩增获得蜻蜓凤梨aftoe1l基因。将蜻蜓凤梨aftoe1l基因的cds序列构建在35s启动子下转入拟南芥，异源表达aftoe1l的拟南芥转基因株系的种子变小，千粒重下降，且在短日照条件下显著晚花。

本发明所提供的蜻蜓凤梨aftoe1l基因，其基因序列具有序列表中seqidno:1所示的核苷酸序列，该cdna序列全长2160bp，由606bp的5’非编码区、150bp的3’非编码区以及1404bp的开放阅读框组成。该基因编码一个467氨基酸残基的蛋白，分子量为51.32kda，等电点为6.65。

上述蜻蜓凤梨aftoe1l基因的克隆：

以蜻蜓凤梨心叶为材料，利用ctab法提取总rna分别合成5’和3’race模板。在已获得的转录组序列基础上，分别设计扩增5’端和3’端序列的特异内外侧引物，引物序列如下：

5’端外侧引物：5’-ggttacagcctccctcccattacatt-3’

5’端内侧引物：5’-tgcccagaaactgtcccatccg-3’

3’端外侧引物：5’-caggtgaagaagagtaggagggggc-3’

3’端内侧引物：5’-gaagctcggatgggacagtttctg-3’

扩增出来的5’端和3’端序列经测序验证后与转录组序列，最终获得aftoe1l基因全长2160bp的cdna序列。

将aftoe1l蛋白序列与多种物种中的ap2成员进行进化树分析，发现其与拟南芥中6个ap2亚族成员中的attoe1亲源关系最近，暗示二者可能具有相似的功能(图1)。

根据获得的aftoe1l基因的cds序列，发明人设计了特异引物扩增了其dna序列。扩增dna序列的引物如下：

5’端引物：5’-atgatgctcgatctgaacatggccg-3’

3’端引物：5’-tcagctcttgaagaaattcaaagaa-3’

该基因的dna序列全长3498bp，由8个外显子和7个内含子构成，与拟南芥的attoe1的外显子和内含子数目相同(图2)。

将aftoe1l蛋白序列与拟南芥的6个ap2家族成员进行同源性比对，发现aftoe1l具有2个保守的ap2结构域以及1个高度保守的核定位信号序列，表明aftoe1l蛋白是蜻蜓凤梨中的ap2亚族成员(图3)。

根据获得的aftoe1l的cds序列，设计在5’端和3’端分别加上kpni和xbai酶切位点的引物，序列如下：

过表达引物f：

5’-ggggtaccatgatgctcgatctgaacat-3’

过表达引物r：

5’-gctctagatcagctcttgaagaaattc-3’

通过pcr扩增，获得带酶切位点的cds序列。序列经过kpni和xbai双酶切与同样双酶切后的表达载体cam35s-gfp连接，最终获得过表达载体。

将构建好的带有aftoe1lcds序列的表达载体cam35s-gfp转入农杆菌eha105后，浸染拟南芥花序。将获得的t0代种子播种在ms+2％蔗糖+50mg/ml潮霉素的固体平板上进行抗性筛选，获得t1代转基因阳性植株。t1代的种子继续播种到抗性板上，获得t2代转基因阳性植株。t2代继续播种，通过观察t3代表型是否分离及分子水平鉴定是否为纯合体植株。观察发现t3代的转基因阳性株系的种子变小(图4a,b,c,d,e)，千粒重下降(图4f)，且在短日照条件下显著晚花(图4g)。

本发明以蜻蜓凤梨心叶为材料，克隆获得蜻蜓凤梨aftoe1l基因，进化树分析结果表明aftoe1l与拟南芥中6个ap2成员中的attoe1亲源关系最近。基因序列结构分析也发现aftoe1l与attoe1类似，均具有8个外显子和7个内含子。进一步的实验结果证实，aftoe1l为定位于细胞核的转录激活子。将aftoe1l的cds序列构建在35s启动子下转入拟南芥，异源表达aftoe1l的拟南芥转基因株系种子变小，千粒重下降，且在短日照下晚花，表明aftoe1l是调控蜻蜓凤梨种子发育和开花时间的一个重要转录因子，为人工精细调控凤梨科植物开花及通过基因工程手段培育凤梨新品种奠定了基础，具有重要的理论及实践意义。

附图说明

图1是蜻蜓凤梨aftoe1l与其他ap2亚族蛋白的进化树分析。

图2是蜻蜓凤梨aftoe1l及拟南芥ap2亚族编码基因结构图

图3是蜻蜓凤梨aftoe1l、afap2-1以及拟南芥6个ap2亚族成员的同源性比对。

图4是35s::aftoe1l拟南芥转基因株系表型(a)、(b)、(c)(d)分别为拟南芥col-0野生型、转空载体cam35s-gfp的col-0型拟南芥、77号株系的35s::aftoe1l拟南芥转基因株系和157号株系的35s::aftoe1l拟南芥转基因株系种子图；(e)为种子大小统计结果；(f)为种子千粒重的统计结果；(g)为短日照条件下(8h光/16h暗)35s::aftoe1l拟南芥转基因株系的晚花表型图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一：蜻蜓凤梨aftoe1l基因的克隆

1、总rna的提取

(1)取850μlctab提取液分装到2ml离心管中，65℃预热；

(2)称取0.2g材料，在液氮中研磨成粉末后立即转入加了2％巯基乙醇的预热的ctab提取液的离心管中，涡旋混合，65℃温浴6min；

(3)加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋混合，室温，10000rpm离心15min；

(4)小心吸取上清到一新的2ml离心管中，重复步骤3；

(5)小心吸取上清到一新的1.5ml离心管中，加入1/3体积的8mol/llicl，4℃沉淀过夜；

(6)4℃，10000rpm离心30min；

(7)弃上清，沉淀分别用70％乙醇和无水乙醇洗涤，干燥后用20μlrnase-free水溶解，溶液即为高纯度的rna。

2、aftoe1l全长cdna的克隆

(1)首先依据clontech的smarter^tmracecdnaamplifiationkit分别合成5’端模板和3’端模板，再分别利用5’端外侧引物和内侧引物扩增5’端序列；利用3’端外侧和内侧引物扩增3’端序列。将获得的pcr扩增产物连接到peasy-t1克隆载体，转化大肠杆菌，经pcr鉴定后进行序列测定。测定正确的序列与原始转录组序列进行拼接，获得aftoe1l全长cdna序列。

(2)根据以上拼接序列设计全长cdna扩增引物：

5’端引物：5’-gggacactctcctcctctctctata-3’

3’端引物：5’-accaagaattattccattcaccc-3’

根据引物的tm值进行pcr条件的优化后，按照以下程序进行扩增：

pcr体系及条件为：

将获得的pcr产物纯化，纯化采用omega的琼脂糖凝胶回收试剂盒，依照说明书进行。纯化后的产物与peasy-blunt载体连接，转化大肠杆菌。用aftoe1l的cdna扩增引物对单菌落进行pcr检测，有目的条带的克隆送测序。

3、总dna的提取

(1)称取0.2g幼嫩的蜻蜓凤梨心叶叶片入1.5-ml离心管中，液氮中冷冻，研磨器研磨成粉末。

(2)迅速加入500μl65℃预热的ctab裂解液(用前加入2％巯基乙醇)，混匀后置于65℃温浴30min，其间间断性地混匀，以使裂解充分。

(3)室温冷却后，加入等体积的酚/氯仿(1:1)，颠倒混匀后静置5min，12000rpm室温离心15min。

(4)小心吸取上清入新的离心管中，加入等体积的氯仿，颠倒混匀以抽提。静置5min。12000rpm室温离心15min。

(5)小心吸取上清入新离心管中，加入1/3体积3mol/l的naac溶液，混匀。

(6)加入2倍体积的预冷的无水乙醇，颠倒混匀后置于-20℃沉淀至少20min。

(7)4℃，12000rpm离心15min，弃上清。

(8)加入适量的70％乙醇洗涤2或3次，注意勿将白色沉淀倒掉。

(9)将洗涤后的离心管倒置于吸水纸上晾干。

(10)加入20μl的ddh2o溶解管底的dna。可直接进行接下来的实验或者置于-20℃冻存。

4、aftoe1l基因序列的克隆

根据已经获得的aftoe1l基因的cdna序列，利用ncbi的orffinder在线软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测到aftoe1l的cds序列。依据cds序列设计引物，以提取的dna为模板，pcr扩增基因全长。引物序列如下：

5’端引物：5’-atgatgctcgatctgaacatggccg-3’

3’端引物：5’-tcagctcttgaagaaattcaaagaa-3’

根据引物的tm值进行pcr条件的优化后，按照以下程序进行扩增：

pcr体系及条件为：

将获得的pcr产物纯化，纯化采用omega的琼脂糖凝胶回收试剂盒，依照说明书进行。纯化后的产物与peasy-blunt载体连接，转化大肠杆菌。用aftoe1l的cds扩增引物对单菌落进行pcr检测，有目的条带的克隆送测序。

实施例二：蜻蜓凤梨aftoe1l基因植物表达载体的构建

1、根据蜻蜓凤梨aftoe1l的cds序列，参照植物表达载体cam35s-gfp图谱，选择合适的酶切位点设计引物。引物序列如下：

过表达引物f：

5’-ggggtaccatgatgctcgatctgaacat-3’

过表达引物r：

5’-gctctagatcagctcttgaagaaattc-3’

以总rna反转录的cdna为模板，进行pcr扩增。pcr反应体系同扩增全长基因的体系，除退火温度由60℃变为62℃外，其他反应条件均相同。

2、将获得的pcr产物纯化，纯化采用omega的琼脂糖凝胶回收试剂盒，依照说明书进行。纯化后的产物与peasy-blunt载体连接，转化大肠杆菌。转化方法依据peasy-blunt载体说明书进行。用aftoe1l的表达载体扩增引物对单菌落进行pcr检测，有目的条带的克隆送测序。

3、对测序结果正确的单克隆进行质粒提取。用kpni和xbai两个限制性内切酶将该基因从peasy-blunt载体上切下，与相同酶酶切的cam35s-gfp连接。连接产物转化dh5α细胞，然后在含100mg/l卡那霉素的lb固体平板上培养，对菌落进行pcr鉴定和质粒dna的酶切分析。将构建好的重组子命名为35s::aftoe1l。

实施例三：aftoe1l的功能鉴定

1、在培养间(23℃，16h光/8h暗，光强120μmolm^-2s^-1)种植拟南芥col-0野生型植株并待其开花。

2、将表达载体35s::aftoe1l转化农杆菌eha105，挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50mg/l卡那霉素和100mg/l利福平的lb液体培养基中，28℃振荡培养。

3、5000rpm室温离心5分钟收集农杆菌，沉淀用转化液(5％蔗糖，0.02％silwet，1×ms)悬浮至od600为0.8～1.0。

4、将前一天浇足水的植株的花序浸泡在悬有菌体的转化液中20～50sec，避光培养24h，之后移至弱光下生长。

5、如此转化3～5次，收取植株的成熟种子。

6、使用0.1％的升汞消毒收取的种子10min，随后点播到含50mg/l潮霉素的ms固体平板培养基上进行抗性筛选，获得t1代阳性转基因植株。

7、收集t1代种子，再次在50mg/l潮霉素的ms固体平板培养基上进行抗性筛选，获得性状分离的t2代阳性转基因植株。

8、t2代继续播种，通过观察t3代表型是否分离及分子水平鉴定是否为纯合体植株。观察发现t3代的转基因阳性株系的种子变小，千粒重下降，且在短日照条件下显著晚花。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所

<120>蜻蜓凤梨aftoe1l基因的克隆及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2186

<212>dna

<213>蜻蜓凤梨(aechmeafasciata)

<400>1

gggacactctcctcctctctctatatctctctctctctctctctcatctcgttcatcgcc60

gactctctcttcctttgagagaactcgtcgccgactcctttactgttcgcgacctcgctt120

ccctcgattagattgttactatcctcctcttcgtcctcctcttcgtcttcttcttcttct180

tctatttgtttttaacattttcatcgtcaatcgactcttcttggatctgattgttagggt240

atttgggattcgttcatgtagtttttcgatcgatttagctgaggaaggggaggaatcgga300

ggggggagaggaggaggaggtggtaacttgaggaatttggaaggattcgtattgattaat360

gtattggtcgatcgatttttgcttccgagctcgtaatccgagtccaaatgtttcgtaaga420

acgactcgttttcatcctgcttctaccggttcctgctccggctcttcgtttttgtagtag480

agctggggtcgaaaccctagcttgcccggaatccctgattcagtgtctcggaacagcgga540

gccggctccgatcggatcttagtaggctgagtttttgttttgagttatcttataacgacg600

aggaggatgatgctcgatctgaacatggccggggagccctccgatttagcggcgaagccc660

cggtcgaagggctgcggcagtgattccgccacctccgactcctcggtcctcaatgccgag720

gccgggggtaatcctgccgatgaggattcgagcactgcacagccgacgacggctggtatg780

gccttgcagttcagtatactgaggagctcggcgtcggccgagctggagaacgaggcggag840

gacgagaactgcggttccccggagtccgacgttgtgaccaagcagttatttcccctcaac900

gcggtctcggagtggccgcaggcgctgcagacgtcttcgtcgtctaataggtcgcaattg960

atcgatctcccgttctgccactccgatgctcagccggagattaaggtttttccgcagccg1020

cagctgcagccgcctcagcagcagcaggtgaagaagagtaggagggggccgcggtcccgg1080

agctctcagtatagaggggttacgttctaccgtagaaccggtagatgggagtcgcacata1140

tgggactgcgggaaacaagtttatttgggaggattcgacactgctcatgctgctgctaga1200

gcatacgatcgagctgcgatcaagtttcgaggtgtcgatgccgacatcaatttcaacctt1260

agtgactatgaggaggatatgaagcagatgaggaatctaacaaaggaagagtttgtgcac1320

attctgcgtcggcaaagcaccgggttctccagaggtagctcaaaatatagaggggttacg1380

cttcataagtgtggccgctgggaagctcggatgggacagtttctgggcaagaaggcttat1440

gacaaggcagctataaaatgtaatgggagggaggctgtaaccaattttgatcctaacgtc1500

tatgatggcgagctacttgctgatgtcgatgttgaaggtcatgaagttgatttgagcttg1560

aggatatctcaacctatcatccaaagtccgaagagggatcatgaatctgttggcatccag1620

ttccagtatggatcgttggaaacatctgaaaccaagaaatcgaaggttgacagctccttc1680

caacaggctagtcagccacacaacacagtgatgctgcctgagcacccttattcccgaact1740

gcaataggccctgccatctttactgctagtgaggaaagagccatagagaagaggccggag1800

gcgcccggcgcgcaatctctccccatctgggcaaggatgacgcatggccgtaatactagt1860

attgctccattactgccgctgttctcgtctgcagcatcatcaggattctctacacctact1920

accgtgactgccatgctcgccaccccgcgctcttcgaacacgcatttccattcaagccct1980

gcatcttctttgaatttcttcaagagctgattctaatggaaaagccaaaagaggcatgcg2040

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aaacatcaaactcgatagcttaaaagaagctaatcttgggtgaatggaataattcttggt2160

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2186