从球等鞭金藻中提取DHA藻油和藻蛋白的工艺的制作方法

本发明属于藻类
技术领域：
，具体涉及从球等鞭金藻中提取dha藻油和藻蛋白的工艺。
背景技术：
dha，二十二碳六烯酸，俗称脑黄金，是一种对人体非常重要的不饱和脂肪酸，属于ω-3不饱和脂肪酸家族中的重要成员。动物和人本身不能合成dha，必须从外界摄入口。dha具有重要的生理作用：1）dha是神经系统细胞生长及维持的一种主要成分，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20%，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50%，因此，对胎婴儿智力和视力发育至关重要，一直以来，多数人都通过给宝宝或孕妇自己补充dha让宝宝更聪明；2）减少产后抑郁，研究显示，我国50-75%的女性都随着孩子的出生经历一段产后抑郁，10%-15%的新妈妈会变得很强烈，被专门术语称为“产后抑郁症”。产后抑郁不仅会严重威胁产妇的身体健康，而且会影响宝宝的发育，导致婴儿发生情感障碍、行为异常。足量dha可减少产后抑郁症的发生。3）癌症治疗，瑞典科学家发现，深海鱼中所富含的ω-3脂肪酸和二十二碳六烯酸及其衍生物在机体中能够杀死神经母细胞瘤癌细胞。这项发现或许为多种癌症——如神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌等提供新的治疗方法，在该研究中，科学家使dha从神经系统中转移到髓母细胞瘤中，当dha在细胞内代谢后，再对细胞中的副产物进行分析。随后科学家研究了dha及其衍生物对癌细胞生长的影响。研究结果表明，dha杀死了所有的癌细胞，而且由dha衍生物产生的毒性比dha本身更能有效地杀死癌细胞。这表明，dha或可成为一种新的治疗神经母细胞瘤或其他癌症的新药物。4）抑制发炎，dha会抑制发炎前驱物质的形成，所以具有消炎作用，降低血脂肪、预防心脏血管疾病，dha可降低血液中三酸甘油脂、胆固醇及预防血栓的形成。5）改善老人痴呆，由于随着年龄的增长，脑中的dha就会逐渐减少，也就是说容易引起脑部功能的退化。事实上，脑细胞在二至三岁前会不断的成长，长大成人后，则会逐渐减少，根据调查，在二十至三十岁时，脑细胞会以十万个的比率逐渐减少，虽然如此，dha仍具有使剩下的脑细胞活性化的力量，充分地提高老年人的记忆及学习能力。目前dha主要从鱼油中获得，但dha主要由从深海鱼油的鱼类脂肪中提取，在海洋环境日益恶化和食物链传递等过程中，存在被污染的可能，含有多种重金属和刺激性物质，不适合儿童或有心脏病史的人服用。近来通过微生物发酵法获得dha已经成为国内外研究的热点口，从单细胞藻类中提取，未经食物链传递，不介入海洋环境，不含色素和重金属物质，而且藻油dha中epa含量较少，避免刺激儿童性早熟的可能，比较适合孕婴、儿童服用。球等鞭金藻是一种单细胞微藻，属普林藻纲等鞭藻目，等鞭藻科，等鞭藻属，营光合自养，培养方式简单，成本低廉，增殖速率快，细胞内含有丰富的不饱和脂肪酸，但是dha含量不够高，仅为10%左右，不能作为高品质的藻油来使用。现有技术已经对藻类产dha进行了较多的研究，文献1“肖尚，复合碳源对隐甲藻积累dha的影响，河南师范大学学报(自然科学版)2013年”主要研究了单一碳源和复合碳源对隐甲藻积累dha的影响，表明分批发酵时葡萄糖是最好的单一碳源，葡萄糖与甘油是最好的复合碳源，复合碳源dha产量比单一葡萄糖碳源提高20％以上，多次补料分批发酵时，葡萄糖和甘油都是最佳单一碳源，最好的复合碳源是葡萄糖与蔗糖的复合碳源，最终的dha产量比单一碳源多次补料分批发酵高出23.6％；但是该生产工艺停留在实验室培养瓶阶段，需要工业化大规模生产检验其具体效果。文献2“王菊芳，湛江海洋大学学报2001年，几种无机盐对隐甲藻生长和dha产量的影响”研究了3种无机盐对隐甲藻(crypthecodiniumcohniiatcc30556)生长及dha产量的影响，结果表明:隐甲藻可在nacl为唯一无机盐的培养基中生长；培养基中nacl质量浓度为6g/l，此时隐甲藻有着最大的生物量和dha产量；但是生物量和dha产量均不够理想，需要进一步提高，以实现产业化生产。文献3“cn201410597451”公开了一种提高金藻中dha含量的方法，包括往培养液中添加一定量的甘油，dha产量可以提高，同时提高了其他脂肪酸的含量。技术实现要素：在申请人之前专利“提高球等鞭金藻生物量以及dha产量的方法”的基础上，本发明继续对dha藻油进行了提取分离，并且同时制备得到藻蛋白，提供了从球等鞭金藻中提取dha藻油和藻蛋白的工艺。本发明是通过如下技术方案来实现的：从球等鞭金藻中提取dha藻油和藻蛋白的工艺，其包括如下步骤：步骤1）种子培养，步骤2）发酵培养，步骤3）分离粗油脂和藻蛋白，步骤4）纯化油脂。进一步地，所述工艺包括如下步骤：步骤1）种子培养：将培养至对数生长期的球等鞭金藻接种到含有种子培养基的种子罐中，培养48h，收集种子液；步骤2）发酵培养：将种子液接种到含有发酵培养液的反应池中，22-25℃发酵培养，培养至48h时，往发酵培养液中添加花生四烯酸和没食子酸丙酯，继续发酵培养72-96h。步骤3）分离粗油脂和藻蛋白：收集藻液,离心收集沉淀，真空干燥，粉碎，然后添加到氯仿甲醇混合溶液中，添加量为1g粉末：3ml氯仿甲醇混合溶液，微波提取60min，，然后进行超声提取60min，然后离心，收集沉淀和氯仿相，将氯仿相置于氮气中吹干，并且真空干燥，得到粗油脂，将沉淀用两倍重量的水浸泡10min，然后离心收集藻蛋白，干燥即得；步骤4）纯化油脂：将粗油脂经过阳离子交换树脂进行离子交换，然后加入活性炭，在氮气保护下，脱色，将脱色后的油脂进行过滤，收集滤过液，即得dha藻油。进一步地，所述方法包括如下步骤：步骤1）将培养至对数生长期的球等鞭金藻接种到含有种子培养基的种子罐中，光照强度5000lux，22-25℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2-0.3vvm，培养48h，收集种子液；步骤2）将种子液按照3-5%的接种量接种到含有发酵培养液的反应池中，22-25℃发酵培养，通气速率为0.5-1vvm；发酵培养至48h时，往发酵培养液中添加花生四烯酸和没食子酸丙酯，继续发酵培养72-96h；整个发酵培养过程中通过流加氨水控制ph在7.0-8.0；步骤3）分离粗油脂和藻蛋白：收集藻液,4000r/min离心10min,沉淀用蒸馏水清洗3次,50℃真空干燥，将藻细胞粉碎，然后添加到氯仿甲醇混合溶液中，添加量为1g粉末：3ml氯仿甲醇混合溶液，微波提取，微波功率为150w，提取时间为60min，提取温度为50℃，然后进行超声提取，提取温度为60℃，超声功率为300w，提取时间为60min，再进行离心，收集沉淀和氯仿相，将氯仿相置于氮气中吹干，并且真空干燥，得到粗油脂，将沉淀用两倍重量的水浸泡10min，然后离心收集藻蛋白，干燥即得；步骤4）纯化油脂：将粗油脂经过阳离子交换树脂进行离子交换，然后加入0.5-0.8wt%的活性炭，在氮气保护下，150-200rpm搅拌脱色30-60min，将脱色后的油脂通过500-1000目的过滤膜进行过滤，收集滤过液，即得dha藻油。优选地，所述种子培养基的组分为：硝酸钠1.5g/l，硅酸钠0.5g/l，氯化钠0.3g/l，硫酸铵0.2g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，vb10.5mg/l，vb120.1mg/l。优选地，所述发酵培养液的组分为：硝酸钠2g/l，碳酸钠0.5g/l，氯化铵0.2g/l，氯化钠0.2g/l，硅酸钠0.1g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，氯化铁20mg/l，氯化锰20mg/l，萘乙酸钠20mg/l，赤霉素10mg/l。优选地，所述花生四烯酸的添加量为50-100mg/l。优选地，所述没食子酸丙酯的添加量为20-30mg/l。优选地，所述氯仿甲醇混合溶液由氯仿与甲醇按照体积比为2:1混合制得。与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于几个方面：本发明对培养基进行了优化，在培养基中添加合理比例的无机盐配方可代替人造海水，不仅能满足球等边金藻生长和产物积累的需求，还能显著地提高dha产量，为降低生产dha成本提供可能。本发明发酵培养液中通过添加萘乙酸钠和赤霉素，培养前期可以提高球等鞭金藻的分裂速率，藻细胞迅速生长繁殖，氮源大幅消耗，随着氮源的消耗，藻增殖缓慢，进入稳定期，生物量变化不显著，由自身生长转变为代谢产物的积累，细胞内开始大量积累油脂，dha含量大幅度上升。硬脂酸生成不饱和脂肪酸的合成主要分成两条途径，途径之一是进入花生四烯酸途径进而生成其他不饱和脂肪酸，另一途径生成dha；通过添加花生四烯酸，可以产生反馈抑制，使得不饱和脂肪酸途径更多地流向dha；适量花生四烯酸的添加对总不饱和脂肪酸产量影响不大，但是可以提高dha的产量。没食子酸丙酯可以抑制花生四烯酸途径中△5脂肪酸去饱和酶的活性，从而使得脂肪酸途径流向dha合成途径。本发明对藻细胞进行微波-超声先后辅助有机溶剂提取的工艺，结合离子交换以及脱色等工艺，对dha藻油进行了提取和纯化，收率和纯度提高，并且收获了藻蛋白。附图说明图1：培养液组分对生物量的影响；图2：培养液组分对脂肪酸产量的影响；图3：花生四烯酸添加量对dha产量的影响；图4：没食子酸丙酯添加量对dha产量的影响。具体实施方式本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。实施例1从球等鞭金藻中提取dha藻油和藻蛋白的工艺，其包括如下步骤：将培养至对数生长期的球等鞭金藻接种到含有种子培养基的种子罐中，接种初始密度为1×105个/ml，光照强度5000lux，22℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2vvm，培养48h，收集种子液；所述种子培养基的组分为：硝酸钠1.5g/l，硅酸钠0.5g/l，氯化钠0.3g/l，硫酸铵0.2g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，vb10.5mg/l，vb120.1mg/l；将种子液按照3%的接种量接种到含有发酵培养液的反应池中，22℃发酵培养，通气速率为0.5vvm；培养至48h时，往发酵培养液中添加花生四烯酸和没食子酸丙酯，使得花生四烯酸的浓度为50mg/l，没食子酸丙酯的浓度为20mg/l，发酵培养的时间共为144h。整个培养过程中通过流加氨水控制ph在7.5；所述发酵培养液的组分为：硝酸钠2g/l，碳酸钠0.5g/l，氯化铵0.2g/l，氯化钠0.2g/l，硅酸钠0.1g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，氯化铁20mg/l，氯化锰20mg/l，萘乙酸钠20mg/l，赤霉素10mg/l；收集藻液,4000r/min离心10min,沉淀用蒸馏水清洗3次,50℃真空干燥，将藻细胞粉碎，然后添加到氯仿甲醇混合溶液（氯仿与甲醇的体积比为2:1）中，添加量为1g粉末：3ml氯仿甲醇混合溶液，微波提取，微波功率为150w，提取时间为60min，提取温度为50℃，然后进行超声提取，提取温度为60℃，超声功率为300w，提取时间为60min，然后离心，收集沉淀和氯仿相，将氯仿相置于氮气中吹干，并且真空干燥，得到粗油脂，将沉淀用两倍重量的水浸泡10min，然后离心收集藻蛋白，干燥即得；将粗油脂经过cd-552型阳离子交换树脂进行离子交换，收集洗脱液，然后加入0.5wt%的活性炭，在氮气保护下，150rpm搅拌脱色60min，将脱色后的油脂通过800目的过滤膜进行过滤，收集滤过液，即得dha藻油。经检测，油脂收率为79.7%，纯度为95.4%。实施例2从球等鞭金藻中提取dha藻油和藻蛋白的工艺，其包括如下步骤：将培养至对数生长期的球等鞭金藻接种到含有种子培养基的种子罐中，接种初始密度为2×105个/ml，光照强度5000lux，25℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.3vvm，培养48h，收集种子液；所述种子培养基的组分为：硝酸钠1.5g/l，硅酸钠0.5g/l，氯化钠0.3g/l，硫酸铵0.2g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，vb10.5mg/l，vb120.1mg/l；将种子液按照5%的接种量接种到含有发酵培养液的反应池中，25℃发酵培养，通气速率为0.5-1vvm；培养至48h时，往发酵培养液中添加花生四烯酸和没食子酸丙酯，控制花生四烯酸的浓度为100mg/l，没食子酸丙酯的浓度为30mg/l，发酵培养的时间共为120h，收集藻细胞，用于提取脂肪酸。整个培养过程中通过流加氨水控制ph在7.0；所述发酵培养液的组分为：硝酸钠2g/l，碳酸钠0.5g/l，氯化铵0.2g/l，氯化钠0.2g/l，硅酸钠0.1g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，氯化铁20mg/l，氯化锰20mg/l，萘乙酸钠20mg/l，赤霉素10mg/l；收集藻液,4000r/min离心10min,沉淀用蒸馏水清洗3次,50℃真空干燥，将藻细胞粉碎，然后添加到氯仿甲醇混合溶液（氯仿与甲醇的体积比为2:1）中，添加量为1g粉末：3ml氯仿甲醇混合溶液，微波提取，微波功率为150w，提取时间为60min，提取温度为50℃，然后进行超声提取，提取温度为60℃，超声功率为300w，提取时间为60min，然后离心，收集沉淀和氯仿相，将氯仿相置于氮气中吹干，并且真空干燥，得到粗油脂，将沉淀用两倍重量的水浸泡10min，然后离心收集藻蛋白，干燥即得；将粗油脂经过cd-180型阳离子交换树脂进行离子交换，然后加入0.8wt%的活性炭，在氮气保护下，150rpm搅拌脱色30min，将脱色后的油脂通过500目的过滤膜进行过滤，收集滤过液，即得dha藻油。经检测，油脂收率为80.8%，纯度为95.1%。实施例3藻细胞密度和dha含量测定：藻细胞密度测定：利用od法，在680nm处测定培养系统中的吸光度，利用公式“细胞密度(×104cells/ml)＝(od680×1250-90.125)×稀释倍数”计算出对应的细胞密度，绘制生长曲线。脂质成分分析：称重粗油脂，色谱进行分析组分和纯度，计算占藻细胞干重的比例，。dha含量测定：往粗油脂中加入内标物十七烷酸，用甲醇钠/甲醇溶液甲酯化，用正己烷多次萃取，收集后氮气吹干,重新定容后用毛细管气相色谱法分析。色谱条件:热导池检测器，db-5毛细管柱，0.35mmol/l×15m。载气为氦气，流速20ml/min，初温170℃，保留2min，升温速率8℃/min，终温235℃，保留8min，汽化室温度及检测器温度均为265℃。1、发酵培养液对生物量和脂肪酸含量的影响：对照组1：发酵培养液中不添加萘乙酸钠，其余同实施例1；对照组2：发酵培养液中不添加赤霉素，其余同实施例1；对照组3：发酵液中不添加萘乙酸钠和赤霉素，其余同实施例1；对照组4：将发酵培养液中萘乙酸钠替换为吲哚乙酸，其余同实施例1；实验组为实施例1。如图1-2所示，实验组中藻密度和脂肪酸产量最高，其中，对照组4的藻密度和对照组1比较接近，脂肪酸产量有所提高，藻密度最低的是对照组3，说明萘乙酸钠和赤霉素均可以提高球等鞭金藻的生物量，将二者同时添加到发酵培养液中，藻密度和脂肪酸大幅提高，说明萘乙酸钠和赤霉素具备较好的协同作用；将萘乙酸钠替换为吲哚乙酸，藻密度有所降低，与不添加萘乙酸钠的对照组1比较接近，说明吲哚乙酸对球等鞭金藻密度影响不大，但是可以小幅提高脂肪酸产量。2、花生四烯酸和没食子酸丙酯对dha产量的影响。以实施例1为例进行试验。分别设置花生四烯酸的添加量为（mg/l）：0,25,50,100,200；没食子酸丙酯的添加浓度为（mg/l）：0,10,20,30,40。如图3-4所示，随着花生四烯酸量的增加，dha产量明显提高，当花生四烯酸增加到100mg/l后，dha增幅并不明显，可见，过量增加花生四烯酸的浓度并不会提高dha产量的增加；没食子酸丙酯抑制了花生四烯酸途径的脂肪酸去饱和酶的活性，从而使得脂肪酸途径更多地流向dha合成途径，进而提高dha的产量，20mg/l后增幅不明显，当没食子酸丙酯增大到40mg/l时，dha产量反而下降，可能是过量的没食子酸丙酯对藻细胞产生了一定的毒性，抑制了藻细胞的代谢。3、花生四烯酸和没食子酸丙酯对粗油脂组成的影响。以实施例1为例，设置对照组，其中，对照组1：不添加花生四烯酸，其余同实施例1；对照组2：不添加没食子酸丙酯，其余同实施例1；对照组3：不添加花生四烯酸和没食子酸丙酯，其余同实施例1。各组别主要脂肪酸组成见表1：表1组别实施例1对照组1对照组2对照组3c22:623.5719.4121.0616.34c18:228.3331.5832.2633.73c14:012.5713.2112.9513.84c16:017.1218.5217.8819.46结论：花生四烯酸和没食子酸丙酯共同作用，能够提高c22:6脂肪酸的含量，其他主要不饱和脂肪酸含量降低，其主要原因是，花生四烯酸产生了反馈抑制，使得不饱和脂肪酸的合成更多地流向dha途径，而且没食子酸丙酯对其它不饱和脂肪酸酶产生了抑制，使得其它不饱和脂肪酸途径受到抑制，从而提高dha的产量。需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。当前第1页12