一株呕吐毒素降解菌及其应用的制作方法

本发明具体涉及一株可降解呕吐毒素的地衣芽胞杆菌及其应用，属于生物技术领域。

背景技术：

镰刀菌在粮食和饲料中生长可产生呕吐毒素，该毒素的摄入可引起人和家畜的呕吐反应以及急性和慢性中毒。因此，对呕吐毒素污染的粮食和饲料的脱毒处理具有重要的理论和实际意义。目前，发达国家和部分发展中国家对食品和饲料中呕吐毒素（don）的限量标准具有明确的规定并禁止呕吐毒素超标的食品和饲料在市场上销售。因此，消除食品和饲料中超限的呕吐毒素是全球研究的热点。呕吐毒素的脱毒处理主要为物理法、化学法和生物法脱毒。其中，生物法是利用微生物及其分泌的酶等代谢物降解呕吐毒素，由于微生物降解呕吐毒素具有高效、成本低，对食品、饲料和环境无污染等特点，因此在消解真菌毒素方面具有潜在的应用价值。近年来，已发现多种微生物可降解呕吐毒素，其相关应用研究也在推进，并在业内受到关注。

技术实现要素：

本发明的目的正是基于上述现有技术状况，而提供一株呕吐毒素降解菌，该菌株是从土壤样品中筛选到了一株可高效降解呕吐毒素的地衣芽胞杆菌，分析其降解机理及应用效果，并为该菌在呕吐毒素污染的粮食及饲料的生物脱毒处理方面的应用提供了理论基础和技术条件。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的呕吐毒素降解菌，为地衣芽胞杆菌（bacilluslicheniformis）fmm-hx，该菌株2018年6月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018358，保藏单位地址为湖北省武汉市，武汉大学保藏中心，邮编430072。

该地衣芽胞杆菌fmm-hx的菌落为扁平、边缘不整齐、表面粗糙，边缘白色但中心为粉色；主要生物学特性如下：革兰氏阳性（g⁺），菌体为直杆状，兼性厌氧；接触酶阳性、v－p反应阳性、柠檬酸盐实验阳性。

一种呕吐毒素降解菌剂，含有上述地衣芽胞杆菌（bacilluslicheniformis）fmm-hx或其发酵产物，该菌剂为喷雾干燥制备的粉状产品。

本发明的呕吐毒素降解菌在降解粮食或饲料中呕吐毒素的应用，可明显降低粮食或饲料中呕吐毒素的含量。

本发明的优点是：可高效降解呕吐毒素，明显降低粮食或饲料中的呕吐毒素含量，在呕吐毒素污染的玉米、小麦等粮食及饲料的生物脱毒处理方面具有较好的应用价值。

附图说明：

图1为菌株fmm-hx降解don液相图。图1中，a：对照组；b：实验组。

具体实施方式

本发明以下结合实施例做进一步描述：

下述实施例中所使用的实验方案如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复，结果取平均值。

初筛培养基：1g(nh4)2so4，0.5gnacl，3gkh2po4，0.05gcacl2，6gk2hpo4•3h2o，0.5gmgso4·7h2o，0.001gfeso4·7h2o，20g琼脂溶解于1000ml蒸馏水中，在121℃灭菌20min，等培养基冷却后，每瓶加入don至终浓度为10μg/ml。

nb培养基（种子培养基）：3g酵母粉，5g蛋白胨，6g葡萄糖，10gnacl，溶解于1000ml蒸馏水中。

lb固体培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10gnacl，20g琼脂溶解于1000ml蒸馏水中。

实施例1降解呕吐毒素的地衣芽胞杆菌（bacilluslicheniformis）fmm-hx(cctccm2018358）的分离及鉴定

一、菌株的分离

2018年1月采集河南郑州的土壤，带回实验室后称取10g样品放入装有90ml无菌水的三角瓶，于35℃，180r/min摇床震荡1h,带样品均匀分散到无菌水中后，吸取1ml悬液于装有9ml无菌水的试管中，混匀，制成浓度分别为10^-1-10^-6g/ml的菌悬液，从各浓度的菌悬液中分别吸取200μl涂布于初筛培养基平板上，35℃恒温培养箱培养2d-3d。待菌落长出后，挑选平板上形态、大小、颜色、透明度不同的单菌落于初筛培养基上划线纯化，并于相同条件培养，记作初步筛选的don降解菌。

再将初步筛选的don降解菌接入种子培养基，35℃、180r/min摇床培养24h，接种1ml种子培养基于24ml含don的nb培养基中，在相同条件下培养5d，对照组为加don不接菌的复筛培养基（即nb培养基）。做don降解实验，将得到的don降解能力最强的一株菌，将其命名为fmm-hx。

二、菌株的鉴定

将菌株fmm-hx在lb固体培养基上35℃培养48h后，菌株fmm-hx的菌落为扁平、边缘不整齐、表面粗糙，边缘白色但中心为粉色。

菌株fmm-hx的主要生物学特性如下：革兰氏阳性（g⁺），菌体为直杆状，兼性厌氧；接触酶阳性、v－p反应阳性、柠檬酸盐实验阳性。

菌株fmm-hx的16srrna基因部分序列如seqidno.1所示（参见后附序列表）。

菌株fmm-hx的分类命名为地衣芽胞杆菌（bacilluslicheniformis），该菌已于2018年6月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学保藏中心，邮编：430072，保藏编号为cctccm2018358。

实施例2地衣芽胞杆菌（bacilluslicheniformis）fmm-hx降解呕吐毒素的能力

一、将菌株fmm-hx按上述方法接种于5ml的nb培养基，于震荡摇床35℃、180r/min培养24h，取1ml菌悬液于24ml含500μl1mg/mldon的nb培养基中，对照组为加don不接菌的复筛培养基，在相同条件下培养5d后检测菌株fmm-hx对don的降解能力。

二、fmm-hx对don降解效果的检测

取1ml培养液于4℃、12000rpm离心15min，取上清过0.22μm微孔滤膜后，再用带有紫外检测器的hplc检测培养基中don的剩余量。hplc检测don的条件为：色谱柱：agilentzorbaxsb-c18（规格：4.6×250mm，粒径5μm）；柱温：35℃；进样量：10μl；流动相：甲醇：水(30：70，v/v)；流速：1ml/min；检测波长：218nm。

don降解率（%）=（对照组don含量-实验组don含量）/对照组don含量×100。

结果如图1所示。

图1中，a：对照组；b：实验组。

结果表明，fmm-hx对don有较好的降解效果，降解效果为84.62%。

实施例3地衣芽胞杆菌（bacilluslicheniformis）fmm-hx在腐败玉米呕吐毒素降解中的应用

在100g无菌玉米中接种禾谷镰刀菌并于28℃培养箱中培养15d后，粉碎被污染的玉米并加入200ml蒸馏水，使用超声处理20min提取玉米中的don。将地衣芽胞杆菌fmm-hx在nb培养基于35℃培养24h，并取10%培养液于100ml过滤提取液中，以100ml过滤提取溶液中加入10ml蒸馏水作为实验对照，然后在35℃180rpm培养3d。如上所述通过hplc检测超声处理前后、以及培养后提取液中don的余量。

结果表明，采用蒸馏水超声提取被禾谷镰刀菌污染的玉米粉中的don。超声处理后的玉米中don的含量低至536μg/kg，玉米中don的含量降低了约90％，这远远低于中国国家标准规定的玉米限量标准。在don提取液中加入10％地衣芽胞杆菌fmm-hx培养物，接种72h后don浓度显着降低至70.98％。由于呕吐毒素具有水溶性，通过超声波辅助提取由禾谷镰刀菌破坏的玉米中don，可有效降低腐败玉米中don的含量。与地衣芽胞杆菌fmm-hx的don生物降解相结合，被破坏的玉米可以被有效地解毒，玉米残渣可以被进一步用作饲料。

序列表

<110>河南工业大学

<120>一株呕吐毒素降解菌及其应用

<160>1

<210>1

<211>1456

<212>dna

<213>地衣芽胞杆菌（bacilluslicheniformis）

<400>1

gtgcagtgcgcatgctatacatgcaagtcgagcggaccgacgggagcttgctcccttaggtcagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatgcttgattgaaccgcatggttcaatcataaaaggtggcttttagctaccacttgcagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagcaaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttctgacaaccctagagatagggcttccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcagaacaaagggcagcgaagccgcgaggctaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttggagccagccgccgaagtgaacaaaatgtg

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<213>地衣芽胞杆菌(bacilluslicheniformis)

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