本发明涉及一种菌株的用途，特别是一种海洋解淀粉芽孢杆菌bmf01的抑菌用途。
背景技术：
：：海洋解淀粉芽孢杆菌（ｂacillusamyloliquefaciens）bmf01，其保藏号为cctccno：m2017153，是公开号为cn107460145a的中国专利文献所公开的菌株。该文献还公开了bmf01菌株所得到的抗菌蛋白对小麦根腐病菌具有明显抑菌效果。解淀粉芽孢杆菌是重要的农业生防菌之一，可产生一系列抑制细菌和真菌的代谢物。在美国、德国解淀粉芽孢杆菌已商品化，制成不同制剂用于马铃薯黑痣病、黄瓜白粉病和稻瘟病等病害的防治。我国农业部于2013年为解淀粉芽孢杆菌颁发了100亿活芽孢/g的母药和10亿活芽孢/g可湿性粉剂生产许可证，已有产品登记销售。生物防治是一种利用生物多样性控制有害生物的无公害治理方法，可以通过生物或其代谢产物抑制病原菌的发生和传播，安全且对生态环境影响小，能够弥补应用化学药物带来的不足。因此，进一步研发海洋解淀粉芽孢杆菌（ｂacillusamyloliquefaciens）bmf01的用途具有重要的意义。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的海洋解淀粉芽孢杆菌bmf01的用途。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种海洋解淀粉芽孢杆菌（bacillusamyloliquefaciens）bmf01（下称bmf01或bmf01菌株）的用途，其特点是：所述的用途为bmf01菌株与/或其发酵液抑制病原真菌或者作为有效成份制备抑制病原真菌药物的用途，所述的病原真菌选自：食用菌污染菌链孢霉或绿色木霉或者白色念珠菌。本发明所述的用途还可以为bmf01菌株与/或其发酵液作为有效成份制备杏鲍菇种植过程中的抗链孢霉或绿色木霉的药物的用途。本发明还公开了一种海洋解淀粉芽孢杆菌（ｂacillusamyloliquefaciens）bmf01的产芽孢的方法，其特点是：发酵培养基配方为：麦麸0.75%、花生饼粉2.5%、caco30.05%；发酵条件为：ph7.0，温度30℃，装液量60ml/250ml，接种量8%，转速200r/min，培养时间54h。发酵培养得到的bmf01菌株发酵液用于作为有效成份制备抑制病原真菌药物，所述的病原真菌选自：食用菌污染菌链孢霉或绿色木霉或者白色念珠菌。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明针对食用菌栽培过程中链孢霉和木霉污染严重，而食用菌栽培周期短，应用化学药剂控制链孢霉和木霉不仅对食用菌生长有抑制作用，同时导致农药残留引起食品安全问题，发现并验证了解淀粉芽孢杆菌bmf01菌株或者其发酵液对链孢霉和木霉有较强抑制作用，同时对食用菌生长安全。本发明还研发了bmf01菌株的产芽孢发酵培养方法，为研制bmf01菌株生物制剂提供培养方法以解决食用菌生长过程中化学药剂控制污染的不足。再者，本发明针对现有技术白色念珠菌的控制主要用化学药物，且有一些菌株已经产生抗药性的不足，发现并验证了解淀粉芽孢杆菌bmf01菌株或者其代谢产物对白色念珠菌有较强的抑制作用，具有开发抗白色念珠菌药物的潜力。附图说明图1为bmf01菌株发酵液对链孢霉和绿色木霉的抑制作用图；图2为bmf01无菌发酵液对白色念珠菌的抑制作用图。具体实施方式以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例1，bmf01菌株对食用菌污染菌链孢霉（链孢霉属）、绿色木霉(木霉属)的抑菌效果实验。1材料与方法1.1材料1.1.1供试菌株：bmf01菌株，由淮海工学院实验室从连云港海域中分离获得并保藏。其保藏号为cctccno：m2017153。链孢霉、绿色木霉由淮海工学院海洋微生物实验室从连云港恒润食用菌有限公司菇房污染菌袋中分离纯化获得。1.1.2培养基菌株活化、平板对峙试验培养基及菌落特征观察培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml。淀粉水解培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，可溶性淀粉10g，琼脂20g，1000ml，ph自然。1.2方法1.2.1链孢霉、绿色木霉拮抗菌株实验无菌发酵液的制备：将活化好的bmf01菌株接种到装有60mlpd培养基的250ml三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养52h。发酵液于4℃、8000r/min离心，取上清，上清液采用0.22μm的细菌过滤器过滤得到无菌发酵液备用。实验：在pda平板中央接种活化好的病原菌，在距病原菌15mm处等距离打孔，在打好的孔中添加150μlbmf01菌株的无菌发酵液，以等量pd培养基为对照，28℃恒温培养，观察病原菌生长状况，测量bmf01菌株无菌发酵液对链孢霉的抑菌圈直径和菌株无菌发酵液对绿色木霉的抑菌带宽度，每个菌株为1个处理，每处理3次重复。1.2.2bmf01菌株对杏鲍菇菌丝生长的安全性测定在pda平板中央接种活化好的杏鲍菇菌苔，在距菌苔15mm处等距离接种活化好的bmf01菌株，28℃恒温倒置培养，观察杏鲍菇生长状况，测量抑菌带宽度，每个菌株为1个处理，每处理3次重复。1.2.3bmf01菌株的种类鉴定形态特征观察将bmf01菌株接种于pda培养基平板上，28℃培养24h，观察记录菌落形态特征并进行革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛然色、荚膜染色。革兰氏染色：取生长16-20h的菌株按照常规染色方法进行制片，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位染色1-2min。缓流水冲洗至无色，用卢戈氏碘液冲去残留水迹，95%，乙醇脱色20-3s，水洗，番红复染液染色2min，缓流水冲洗至无色，晾干后镜检。菌体被染成红色为革兰氏阴性，菌体被染成紫色为革兰氏阳性。芽孢染色：取生长36-48h的菌株按常规方法制片，向载玻片上滴加5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在酒精灯上方加热至染液冒蒸汽5min，加热时补充染液，玻片冷却后，用缓流水冲洗至无色，干燥后用番红复染液染色2min，水洗，晾干后镜检。鞭毛染色：取生长16-20h的菌株按照常规染色方法进行制片，向载玻片上滴加鞭毛染色液6-7min，用缓流水冲洗至无色，干燥后用油镜检测荚膜染色：按照常规方法制片，向载玻片上滴加荚膜染色液1min，用缓流水冲洗至无色，用吸水纸吸干残夜，自然干燥，用油镜检测。2结果与分析2.1筛选试验结果表明，bmf01菌株对链孢霉和绿色木霉具有较强的抑制作用。具体实验结果参照图1。2.2bmf01菌株对杏鲍菇菌丝生长的安全性测定结果bmf01菌株对杏鲍菇菌丝生长没有明显的抑制作用，对杏鲍菇生长安全。实施例2，bmf01菌株对白色念珠菌的抑菌效果实验。材料与方法1.1材料1.1.1供试菌株bmf01菌株，由淮海工学院实验室从连云港海域中分离获得并保藏。其保藏号为cctccno：m2017153。白色念珠菌，由淮海工学院实验室保存。1.1.2培养基bmf01菌株和白色念珠菌活化培养基：pda培养基；bmf01菌株种子培养基：蛋白胨5g/l、酵母膏1g/l、葡萄糖5g/l，水1000ml；bmf01菌株发酵培养基：糊精玉米20g/l，牛肉膏15g/l，硫酸镁1.4g/l。白色念珠菌种子培养基：pd培养基；白色念珠菌发酵培养基：沙氏液体培养基：葡萄糖40g，蛋白胨10g，蒸馏水1000ml；ypd液体培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏10g，蒸馏水1000ml。1.3.1bmf01无菌发酵液的制备利用50l发酵罐对bmf01菌株进行分批发酵，发酵条件为：接种量为7%、温度28℃、、初始搅拌速度220r·min－1、通气量3l·min－1、发酵时间36h。发酵液在4℃、9000r·min－1的条件下离心20min，弃菌体，得无菌体的澄清发酵液,备用。1.3.2bmf01菌株发酵液抗菌活性的测定采用牛津杯法测定发酵液的抑菌活性，在已经涂布菌液（菌数约106个/ml)的培养基表面等距离放置牛津杯，向其中分别加入200μl待测发酵液，后移至28℃恒温培养箱中培养36h左右，观察是否有清晰透明的抑菌圈产生，并测量抑菌圈的直径大小。1.3bmf01无菌发酵液抗菌作用1.3.1bmf01无菌发酵液对白色念珠菌超微结构的影响采用扫描电镜法。以牛津杯法作用于白色念珠菌（同时以未作用的白色念珠菌作对照），28℃恒温培养，待抑菌圈边缘由清晰变模糊后，取抑菌圈边缘内侧的白色念珠菌及对照菌在扫描电镜下观察，对比菌体细胞发生的超微结构变化。1.3.2bmf01无菌发酵液对白色念珠菌生物膜形成的影响1.3.2.1白色念珠菌生物膜制备将白色念珠菌接种于ypd培养基中，35℃摇床过夜培养，收集菌体，用rpmi-1640培养基稀释，调整菌液浓度为1×106个细胞/ml。将100μl该浓度菌液接种于96孔细胞培养板中，37°c培养2h后弃去培养基，用ph7.4、0.01mol/l磷酸缓冲盐水（pbs）洗涤3次，加入100μlrpmi-1640培养基，作为培养的0点，37°c继续培养，每24h更换1次培养基。mtt法测定od值：弃去多孔板最后培养液，用pbs缓冲液轻轻洗去悬浮细胞，每孔加入100μlpbs缓冲液及20μlmtt，37℃孵育4h后弃上清，每孔加入100μl二甲基亚砜，振荡5min，室温静置30min后，用酶标仪测定od492nm值。每孔均设6复孔，取平均值。1.3.2.2不同浓度无菌发酵液对白色念珠菌生物膜形成的影响在生物膜培养的0点，分别加入不同倍比稀释的bmf01发酵液（浓度分别为0%，5%，10%，20%，40%，60%，100%），空白对照孔加入无菌水，37°c继续培养48h后，弃去培养基，pbs洗涤3次，用mtt法测定不同浓度bmf01发酵液对白色念珠菌生物膜的抑制作用。1.3.2.3无菌发酵液对白色念珠菌生物膜形成不同阶段的影响将100μl菌液接种于96孔细胞培养板中，分别在生物膜培养的0、2、12、24、48和72h时弃去培养基，加入bmf01发酵液，空白对照组加入无菌水，37°c继续培养48h。mtt法测量各孔在492nm处的od值。每组设6个重复。1.3.3bmf01无菌发酵液对白色念珠菌细胞通透性的影响将培养18h后的白色念珠菌10000r/min离心20min收集菌体，pbs洗涤三次。用含0.001%tween80的pbs悬浮细胞，菌体浓度调至109个细胞/ml。向悬浮细胞中加入一定量的的发酵液，以等量的无菌水为对照，37℃、180r/min培养，分别于0、1、2、4、6h取样，10000r/min离心后测上清液od260nm值。2结果与分析2.1bmf01无菌发酵液对白色念珠菌的抑制作用海洋细菌bmf01发酵液对白色念珠菌具有明显的抑制作用，抑菌带宽度为38.00mm，见图2。2.2mf01菌株无菌发酵液对白色念珠菌超微结构的影响扫描电子显微镜下观察经无菌发酵液作用后的白色念珠菌以及正常生长的菌株。结果发现，经无菌发酵液作用后的白色念珠菌菌体表面出现凹陷，凹陷大小不一。菌体出现不规则形态，细胞壁残缺，细胞上出现破洞。说明无菌发酵液可以破坏正常生长的细胞，抑制其生长。而正常生长的白色念珠菌菌体细胞形态规则、饱满，细胞表面完整光滑。2.3bmf01无菌发酵液对白色念珠菌生物膜形成的影响2.3.1不同浓度bmf01菌株无菌发酵液对白色念珠菌生物膜形成的影响无菌发酵液对白色念珠菌生物膜的形成有明显的影响，当发酵液的体积分数在0-5%范围内，od492nm值明显降低，之后随着发酵液浓度的升高，od492nm值也随之降低，但是下降的比较缓慢。说明在较低的浓度范围内，无菌发酵液就可以明显的抑制白色念珠菌生物膜的形成。2.3.2bmf菌株无菌发酵液对白色念珠菌生物膜形成不同阶段的影响无菌发酵液对白色念珠菌生物膜形成的各阶段有一定的的影响，在白色念珠菌生物膜形成的0-2h内，无菌发酵液对其抑制作用最强，在2-24h范围内，处理组的od值逐渐上升，在24-72h内，处理组的od值趋于平缓。有研究者发现白色念珠菌生物膜的形成可以分为三个阶段，早期（0-11h），中期（12-30h）和成熟期（38-72h）。本实验结果表明bmf菌株无菌发酵液对白色念珠菌生物膜形成的早期和中期具有明显的抑制作用，而到了生物膜形成的成熟期，抑制作用逐步减弱。2.4bmf01无菌发酵液对白色念珠菌细胞通透性的影响bmf01菌株无菌发酵液对白色念珠菌细胞通透性具有一定的影响。在1-6h范围内，处理组的od260nm值均高于对照组，随着培养时间的增长，对照组与处理组的差异越来越明显。当培养时间为6h时，对照组的od260nm值为0.506，而处理组的od260nm值为0.697，明显高于对照组，可见无菌发酵液导致白色念珠菌od260nm特征吸收值物质的泄露，增加了细胞的通透性。2.5bmf01无菌发酵液对白色念珠菌孢子萌发的影响bmf01菌株无菌发酵液对白色念珠菌孢子萌发具有较强的抑制作用，从结果可以看出，对照组白色念珠菌的孢子萌发率随时间增加迅速提高，5h时白色念珠菌孢子的萌发率达到92.44％，而bmf01菌株无菌发酵液处理的白色念珠菌孢子萌发速度较缓慢，5h时孢子的萌发率仅为34.22％，萌发率明显低于对照组，说明bmf01无菌发酵液对白色念珠菌孢子的萌发具有较强的抑制作用。3结论与讨论本实验结果表明bmf01菌株发酵液对白色念珠菌具有较强的抑菌作用。bmf01菌株发酵液对破坏白色念珠菌的细胞壁和影响生物膜的形成及细胞的通透性，抑制白色念珠菌的孢子萌发。实施例3，bmf01菌株产芽孢发酵条件实验。材料与方法1.1材料1.1.1供试菌株海洋解淀粉芽孢杆菌bmf01；1.1.2培养基菌株活化培养基：pda培养基。种子培养基：蛋白胨5g/l、酵母膏1g/l、葡萄糖5g/l。1.2方法1.2.1种子液制备接种1环活化的bmf01菌株于盛有60ml种子培养基的250ml三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养24h，调整菌液浓度为108个细胞/ml，作发酵用种子液。1.2.2摇瓶发酵初始条件将种子培养液按10%的接种量接种到装有60ml发酵培养基的250ml三角瓶中，ph7.0，28℃，180r/min振荡培养54h。1.2.3测定项目与方法细菌总数测定：血球计数板法。芽孢产率测定：结晶紫染色法。1.2.4基础培养基筛选将bmf01菌株在不同的培养基中发酵培养，以细菌总数和芽孢产率为指标，选择细菌总数和芽孢产率较高的培养基作为培养基优化的基础培养基。表1供试培养基及其配方1.2.5培养基优化单因素试验选择8种碳源(蔗糖、棉子糖、玉米粉、淀粉、葡萄糖、乳糖、麦麸、麦芽糖)，7种氮源(胰蛋白胨、脲、硫酸铵、酵母粉、牛肉膏、花生饼粉、豆饼粉)，10种无机盐(k2hpo4、kh2po4、znso4、mgcl2、mnso4、caco3、caco3+mnso4、caco3+mgcl2、caco3+mnso4+mgcl2、mnso4+mgcl2)，等量代替筛选出的基础培养基中碳源、氮源和无机盐的种类，配制不同发酵培养基进行发酵，根据发酵液中细菌总数与芽孢产率，筛选出最适碳源、氮源和无机盐种类。设置筛选出的碳源、氮源和无机盐的不同浓度，分别进行发酵，筛选出碳源、氮源和无机盐的适宜浓度。1.2.6培养基优化的正交试验根据单因素试验筛选出的的培养基最佳碳源、氮源和无机盐种类和浓度，按正交试验l9（33）设计配制不同培养基进行发酵，确定最佳培养基配方。1.2.7发酵条件优化以优化的培养基为发酵培养基，分别测定不同初始ph值（5、6、7、8、9）、发酵时间（0-60h（每间隔4h为一时间梯度，产芽孢后每隔2h为一时间梯度））、装液量（30、50、60、70、90、110ml/250ml）、温度（24、26、28、30、32℃）、接种量（5%、8%、10%、12%、15%）和摇床转速（140、160、180、200、220r/min）对bmf01菌株的细菌总数与芽孢产率的影响，以初始发酵条件为基础，每一因素的优化均在前一因素优化的基础上进行。结果与分析2.1培养基的优化2.1.1基础培养基筛选5种培养基中c号培养基发酵液中的细菌总数和芽孢产率达到最高，分别为4.04×109个细胞/ml、82.73%，其次是d号培养基，细菌总数为3.6×109个细胞/ml，芽孢产率为73.62%，培养基a和e不产芽孢，将培养基c号作为bmf01菌株产芽孢培养基优化基础培养基。2.1.2培养基优化单因素试验2.1.2.1碳源以麦麸为碳源的培养基中细菌总数和芽孢产率最高，分别为3.65×109个细胞/ml，85.74%，其次是以蔗糖为碳源的基础培养基，细菌总数和芽孢产率分别为3.1×109个细胞/ml，82.21%。其余碳源的培养基细菌总数都较少。因此，选择麦麸作为产芽孢培养基的碳源。麦麸的浓度浓度为0.5%时发酵液中细菌总数和芽孢产率达到最高，分别为3.8×109个细胞/ml和85.71%；当浓度低于或高于0.5%时，细菌总数和芽孢产率有所下降，因此选择0.25%、0.5%、0.75%作为正交试验碳源浓度的3个水平。2.1.2.2氮源氮源牛肉膏的发酵液中细菌总数最高，为5.58×109个细胞/ml，但是不产生芽孢；其次是花生饼粉为氮源的培养基，细菌总数为3.91×109个细胞/ml，芽孢产率最高，为87.10%，氮源脲、硫酸铵、牛肉膏的发酵液均不产生芽孢。因此，选择花生饼粉作为bmf01菌株产芽孢发酵培养基的最佳氮源。花生饼粉浓度对bmf01菌株发酵液的细菌总数和芽孢产率有明显影响，花生饼粉浓度为2.5%时，细菌总数和芽孢产率分别达到最高为，3.80×109个细胞/ml，86.30%；浓度高于或低于2.5%时，发酵液中的细菌总数和芽孢产率均有所降低。因此选择2%、2.5%、3%作为正交试验氮源花生饼粉浓度的3个水平。2.1.2.3无机盐添加无机盐caco3的发酵液细菌总数和芽孢产率均较高，分别为4.68×109个细胞/ml和88.15%，添加无机盐znso4的发酵液中芽孢产率最高为89.44%，但其细菌总数少，仅为1.64×109个细胞/ml。添加其余几种无机盐的发酵液中细菌总数和芽孢产率均较低。因此，选择无机盐caco3为bmf01菌株产芽孢发酵培养基的无机盐。caco3浓度为0.1%时，细菌总数和芽孢产率达到最高，分别为3.95×109个细胞/ml和81.08%；浓度低于或高于0.1%时，细菌总数和芽孢产率明显下降。因此选择0.05%、0.1%、0.2%作为正交试验无机盐浓度的3个水平。2.1.3培养基优化的正交试验正交试验结果表明，氮源花生饼粉（b）对细菌总数的影响的影响最大，其次是碳源麦麸（a），最后是无机盐caco3（c），即b＞a＞c，由均值k得到的最佳组合是a3b2c1；碳源对芽孢产率的影响最大，其次是无机盐，最后是氮源，即a＞c＞b，由均值k得到的最佳组合是a3b2c2.。表2的试验结果表明，8号试验a3b2c1的培养基中细菌总数和产芽胞率最高，分别为5.90×109个细胞/ml和88.78%，显著高于其他试验组合，因此确定产芽孢发酵培养基配方为：麦麸0.75%，花生饼粉2.5%，caco30.05%。表2海洋细菌bmf01菌株发酵培养基正交试验设计l9(33)及试验结果table2orthogonaldesignoffermentationmediumformarinebacteriabmf01strainl9(33)anditsresults2.2发酵条件优化2.2.1ph值ph对bmf01菌株的细菌总数和芽孢产率有明显的影响，在ph值为5~7时，细菌总数和芽孢产率随ph增大而增加，ph为7时细菌总数和芽孢产率最高，分别为5.75×109个细胞/ml和90.92%。当ph大于7时，细菌总数和芽孢产率明显下降。因此，选择ph7.0为bmf01菌株摇瓶产芽孢发酵的最佳ph值。2.2.2发酵时间发酵时间对发酵液的细菌总数和芽孢产率有明显的影响，在0~20h内细菌总数增长缓慢，20h后细菌总数快速增加，进入对数生长期，28h达到高峰，细菌总数为6.65×109个细胞/ml，20~28h为对数期，28h开始进入稳定期，细菌总数增加缓慢，芽孢开始形成，32h后产芽孢率快速增加，40h细菌总数达到最高，为6.95×109个细胞/ml，54h芽孢率达到最高，为91.81%，其后细菌总数开始下降，进入衰退期。因此认为bmf01菌株摇瓶产芽孢发酵的最佳发酵时间为54h。2.2.3装液量装液量为30~60ml/250ml三角瓶时，随装液量增加细菌总数呈上升趋势，装液量在60ml时发酵液的细菌总数最高，为5.95×109个细胞/ml，芽孢产率为87.37%，对芽孢产率无明显影响，装液量大于60ml细菌总数明显下降，因此将60ml/250ml作为bmf01菌株摇瓶产芽孢发酵的最佳装液量。2.2.4接种量接种量对bmf01菌株的细菌总数和芽孢产率有明显的影响。当接种量为8%时，bmf01菌株发酵液的细菌总数和芽孢产率达到最高，分别为6.3×109个细胞/ml和87.25%。随接种量低于或高于8%，菌体细菌总数和芽孢产率均减少。因此选择8%为bmf01菌株摇瓶产芽孢发酵的最佳接种量。2.2.5发酵温度温度在24℃~30℃范围内，随温度上升细菌总数和芽孢产率呈上升趋势，30℃时细菌总数和芽孢产率达到最高，分别为7.2×109个细胞/ml和88.34%，超过30℃时，细菌总数和芽孢产率明显下降。因此，选择30℃作为bmf01菌株的摇瓶产芽孢发酵的最佳温度。2.2.6摇床转速当转速为140~200r/min时，随着转速增大，细菌总数和芽孢产率呈上升趋势。在200r/min时其细菌总数最高达到7.4×109个细胞/ml，芽孢产率为89.42%；在转速为220r/min时芽孢产率最大，为92.08%，但其细菌总数较低为3.2×109个细胞/ml。综合考虑，选择200r/min作为bmf01菌株摇瓶产芽孢发酵最佳摇床转速。讨论芽孢是产芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆休眠体，芽孢的形成受营养物质和环境等因素的综合影响。细菌总数和芽孢产率是衡量生防菌剂品质的关键指标，通过优化培养基和发酵条件可以提高产芽孢细菌的芽孢产率和细菌总数，为工业化扩大生产、开发生防菌剂提供了理论数据参考。本实施例结果表明，麦麸作为碳源对源于海洋的解淀粉芽胞杆菌bmf01菌株的细胞总数和芽孢的形成有利，这一结果与王继雯等人对巨大芽孢杆菌c2产芽孢培养条件的优化中碳源优化的结果一致，且麦麸廉价易得，成本低。菌株在以花生饼粉为氮源的培养基上细菌总数和芽孢产率较高，这与刘宽博等人对枯草芽孢杆菌c3的研究中氮源优化结果相同，而所检测的其他无机氮源如硫酸铵、脲不利于细菌总数的增加和芽胞的形成；添加速效氮源的培养基中细菌芽孢形成率明显低于长效氮源，这与郭荣君等在研究生防菌bh-1时发现速效氮源对菌株芽孢的形成效果较差结果相一致。有研究表明添加无机盐会提高芽孢产率李文哲等对枯草芽孢杆菌d1的研究中发现添加钙离子能促进芽孢产率，在本研究中同样发现添加钙离子能促进芽孢的生成，大多数钙离子与芽孢所特有的化学成分吡啶二羧酸结合，形成的钙－吡啶二羧酸复合物约占芽孢干重的10%，复合物通过降低芽孢含水量增加芽孢抗逆性。结论本实验对源于海洋的解淀粉芽孢杆菌bmf01菌株产芽孢发酵培养基和摇瓶发酵条件进行了优化，获得最佳发酵培养基配方为：麦麸0.75%、花生饼粉2.5%、caco30.05%。最佳发酵条件为：温度为30℃，ph为7.0，装液量60ml/250ml，接种量为8%，转速为200r/min，培养54h。经优化后，该菌株发酵培养基的细菌总数和芽孢产率有了明显提高，分别达到7.4×109个细胞/ml，89.42%。当前第1页12当前第1页12