本发明涉及药物领域，特别涉及一种新型tepotinib衍生物和制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
癌症是严重危害人民健康的重大疾病之一。据国家癌症中心发布的2017年全国癌症统计数据，全国恶性肿瘤新发病例数380.4万例，相当于平均每天超过1万人被确诊为癌症。城市发病率前五位癌症是肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、女性乳腺癌；农村发病率前五位是肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、结直肠癌。因此，寻找和发展有效的抗癌新药极为重要。
c-met原癌基因属于酪氨酸激酶(proteintyrosinekinases,ptks)家族ron亚族，其编码的c-met蛋白是唯一肝细胞生长因子/离散因子(hepatocytegrowthfactor/scatterfactor,hgf/sf)的高亲和性受体。hgf/c-met信号通路与血管新生和肿瘤生长过程密切相关，抑制该通路成为靶向抗肿瘤治疗的新策略。文献中已有不少新型c-met抑制剂的设计合成与抗肿瘤活性研究报道，其中，tepotinib(emd1214063)是默克雪兰诺研发的高选择性、强效小分子c-met抑制剂，结构式如式1所示，化学结构上属于哒嗪酮衍生物。目前tepotinib已进行了肝细胞癌的2期临床试验，取得了积极的效果，很有可能被批准成为新的重磅抗癌药物。但是，tepotinib也有其自身的不足，由于分子中存在容易代谢的位点，在狗和猴子的pk数据中，显示出生物利用度不高的缺点。
手性是自然界的基本特征，构成生命现象的几类重要物质如糖类、蛋白质、核酸、酶以及细胞表面受体都具有手性。人和其他生物体系具有复杂的手性环境，手性分子可以对生物体进行精确识别。这种专一性识别与手性作用，对人类的健康和生存环境具有极其重要的意义。当手性药物作用于生物体时，组成相同但构型不同的药物分子往往具有不同的药理和毒副作用。因此，手性在生命过程中发挥着独特的功能，手性药物也越来越受到人们的重视。
氘(deuterium，d或2h)是氢的稳定非放射性同位素。碳-氘键比碳-氢键的零点振动能低，因而更加稳定。药物分子中易代谢位点用氘取代后，可直接影响药物的吸收、分布、代谢等过程，可以产生提高药物的疗效、封闭代谢位点、延长药物半衰期的作用。氘代药物作为一类新型药物，已引起国际国内的广泛关注。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种新型tepotinib衍生物，具有良好生物利用度和抗肿瘤活性。
本发明的另一目的在于提供一种上述新型tepotinib衍生物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供一种上述新型tepotinib衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种新型tepotinib衍生物，结构式如式2所示：
其中，x1和x2是彼此独立的碳原子或氮原子；y是氢原子或氢的同位素氘；r1是氢原子、氢的同位素氘、ch3基团、cd3基团、或者是含二个到四个碳的烷基、烯基或炔基、或者是氘代烃基；z是氧原子、硫原子、硒原子、nh、nch3或亚砜so；r2为2-(n,n-二烷基氨基)乙基、或氮原子上连有1到4个碳的烷基的4-哌啶基，如n-甲基4-哌啶基，n-乙基4-哌啶基。
结构式2中，x1和x2可以分别或同时为碳原子或氮原子；当x1为碳原子、x2为氮原子时，b环属于哒嗪酮结构；当x1为氮原子、x2为碳原子时，b环属于环脲结构；当x1和x2都为碳原子时，b环属于酰胺结构。
优选的，所述新型tepotinib衍生物为tepotinib的手性衍生物，其分子中引入手性结构，即结构式2中，y是氢原子或氢的同位素氘，r1是ch3、cd3或者是含二个到四个碳的烷基、烯基或炔基，r1和y所链接的碳为手性碳，由此产生r-构型和s-构型两种不同构型的光学手性异构体。
优选的，所述新型tepotinib衍生物，在容易代谢的位点将氢替换为氘，即结构式2中，y和r1至少有一个含有氢的同位素氘，使其具有更好的药代动力学效果，如y可以是氢的同位素氘、r1可以是氢的同位素氘或氘代甲基cd3。
优选的，所述新型tepotinib衍生物的侧链含有硫醚、亚砜so或硒醚结构，即结构式2中，z为硫原子、硒原子或亚砜so基团，使其可以产生其它药学性质。
更优选的，所述新型tepotinib衍生物为tepotinib的手性氘代衍生物，即结构式2中，y为氢的同位素氘，r1是ch3或是含二个到四个碳的烷基、烯基或炔基，r1和y所链接的碳为手性碳，由此产生r-构型和s-构型两种不同构型的光学手性氘代异构体。
更优选的，所述新型tepotinib衍生物为tepotinib的手性氘代衍生物，即结构式2中，y为氢原子，r1是cd3或氘代烃基，r1和y所链接的碳为手性碳，由此产生r-构型和s-构型两种不同构型的光学手性氘代异构体。
更优选的，所述新型tepotinib衍生物为tepotinib的手性氘代衍生物，即结构式2中，y为氢的同位素氘，r1是cd3或氘代烃基，r1和y所链接的碳为手性碳，由此产生r-构型和s-构型两种不同构型的光学手性氘代异构体。
最优选的，所述新型tepotinib衍生物为tepotinib的手性氘代衍生物，具有手性结构，在容易代谢的位点将氢替换为氘，且侧链含有硫醚、亚砜so或硒醚结构；即在结构式2中，r1和y所链接的碳为手性碳；y和r1至少有一个含有氢的同位素氘；z为硫原子、硒原子或亚砜so基团。
上述各类r-构型和s-构型的光学手性异构体或光学手性氘代异构体均具有良好的抗肿瘤细胞增殖活性；更优选r-构型的光学手性异构体或光学手性氘代异构体，其在抗肿瘤细胞增殖活性的实验中，表现出更好的结果。
所述新型tepotinib衍生物不具有手性中心、或虽有手性中心但为消旋体时(消旋体是指两种构型(r和s)是等量的)，其制备方法包括下述步骤：
(1)2-氯-5-氟嘧啶与3位带有羟甲基的苯基硼酸衍生物反应，得到中间体3(结构式为式4)；或者2-氯-5-氟嘧啶与3位带有乙酰基的苯基硼酸衍生物反应，得到中间体2(结构式为式3)，再经硼氢化钠还原，得到中间体3；
(2)中间体3在氯仿溶剂中与二氯亚砜反应，醇羟基被氯置换后，再与带有吡啶基的哒嗪酮或环脲衍生物发生亲核取代反应，得到中间体4(结构式为式5，其中r3、r4为-f，或r3为-cn、r4为-h)；
(3)中间体4与链状或环状的氨基醇在氢化钠/n,n-二甲基甲酰胺中反应，得到非手性或消旋体tepotinib衍生物5；或，中间体4与硫醇反应，得到非手性或消旋体tepotinib衍生物6；或，中间体4与硒醇反应，得到非手性或消旋体tepotinib衍生物7，非手性或消旋体tepotinib衍生物5、6、7的结构通式为式6，其中x为氧原子，硫原子或硒原子。
步骤3中，硫醇或硒醇，是由脂肪氨基异硫脲或脂肪氨基异硒脲，经一锅法水解得到的。
当新型tepotinib衍生物不具有手性中心、或虽有手性中心但为消旋体时，其具体合成路线如下所示：
其中，各步骤的试剂和反应条件为：
a步骤：2-氯-5-氟嘧啶、3位有羟甲基或乙酰基的苯硼酸衍生物、双三苯基膦二氯化钯、碳酸钠的摩尔比为(33～51.5)：(32～50)：(0.33～0.52)：(66～103)，溶剂为甲苯/水/乙醇的质量比为1:1:2，反应温度为80～100℃，反应时间为8～10小时；
b步骤：中间体2与硼氢化钠的摩尔比为(10～30)：(15～45)，溶剂为异丙醇，在0～4℃下反应1～2小时，然后在25～35℃下反应1～2小时，得到中间体3；
c步骤：首先，中间体3与二氯亚砜进行反应，反应温度为30～40℃，反应时间为2～4小时；然后加入碳酸钾，溶剂为n-甲基吡咯烷酮，继续反应，反应温度为80～100℃，反应时间为20～24小时，得到中间体4；其中，中间体3、二氯亚砜、碳酸钾的摩尔比为(5～15)：(25～75)：(10～30)；
d步骤：制备非手性或消旋体tepotinib衍生物5：中间体4、氢化钠(质量浓度为60％)、3-(二甲基氨基)-1-丙醇/1-甲基哌啶-3-甲醇的摩尔比为(1～4)：(1.5～6)：(1.2～4.8)，溶剂为n,n-二甲基甲酰胺，在0～4℃下反应15～30分钟，然后在25～30℃下反应1～2小时，得到非手性或消旋体tepotinib衍生物5；
制备非手性或消旋体tepotinib衍生物6、非手性或消旋体tepotinib衍生物7：(i)首先，硫脲或硒脲与r2ch2cl的摩尔比为(2～10)：(2～10)，溶剂为无水乙醇，制备得到烷基氨基异硫脲或烷基氨基异硒脲；(ii)然后，中间体4、烷基氨基异硫脲或烷基氨基异硒脲、氢氧化钠的摩尔比为(1～5)：(2～10)：(4～20)，溶剂为n,n-二甲基甲酰胺/水(质量比为5:1)，在25～35℃反应15～30分钟，然后在60～80℃反应3～6个小时，得到非手性或消旋体tepotinib衍生物6或7。
所述新型tepotinib衍生物为手性含氧衍生物时，其制备方法包括下述步骤：
(1)2-氯-5-氟嘧啶与3位带有乙酰基的苯基硼酸衍生物反应，得到中间体2；中间体2与链状或环状的氨基醇，在氢化钠存在下反应，得到中间体8(结构式7；
(2)中间体8在催化剂伞花烃钌(ii)二氯二聚体，手性配体(s,s)-csdpen或者(r,r)-csdpen作用下，经不对称氢转移反应，得到手性醇中间体9(结构式8)；
(3)s-构型的醇中间体9与带有氰基的哒嗪酮经mitsunobu反应，得到构型反转的r-构型的手性tepotinib衍生物5；r-构型的醇中间体9与带有氰基的哒嗪酮经mitsunobu反应，得到构型反转的s-构型的手性tepotinib衍生物5；其中，r-构型或s-构型的手性tepotinib衍生物5的结构式为式9。
当新型tepotinib衍生物为手性含氧衍生物时，其具体合成路线如下所示:
其中，各步骤的试剂和反应条件为：
a步骤：中间体2、氢化钠(质量浓度为60％)、3-(二甲基氨基)-1-丙醇或1-甲基哌啶-3-甲醇的摩尔比为(5.0～20)：(7.5～30)：(6.0～24)，溶剂为n,n-二甲基甲酰胺，在0～4℃反应15～30分钟，然后在25～35℃反应1～4小时，得到中间体8；
b步骤：先加入伞花烃钌(ii)二氯二聚体、(s,s)-csdpen或(r,r)-csdpen，溶剂为水，氮气保护下在25～40℃反应4～8个小时；然后加入中间体8与甲酸钠，溶剂为二氯甲烷/h2o(质量比为2:1)，在25～40℃反应8～20小时，得到手性醇中间体9；其中，伞花烃钌(ii)二氯二聚体、(s,s)-csdpen或(r,r)-csdpen、中间体8、甲酸钠的摩尔比为(0.01～0.04)：(0.02～0.08)：(1.0～4.0)：(5.0～20.0)；
c步骤：手性醇中间体9、3-(6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-苯甲腈、三苯基膦、偶氮二甲酸二异丙酯的摩尔比为(0.5～2.5)：(0.5～2.5)：(0.75～3.75)：(0.75～3.75)，溶剂为四氢呋喃/n,n-二甲基甲酰胺(质量比为10:1)，先在0～4℃反应1～30分钟，然后在25～35℃反应18～24小时，得到r-构型或s-构型的手性tepotinib衍生物5。
所述新型tepotinib衍生物为手性含硫或含硒衍生物时，其制备方法包括下述步骤：
(1)2-氯-5-氟嘧啶与3位带有乙酰基的苯基硼酸衍生物反应，得到中间体2；中间体2在催化剂伞花烃钌(ii)二氯二聚体，手性配体(s,s)-csdpen或者(r,r)-csdpen作用下，经不对称氢转移反应，得到手性醇中间体3(结构式10)；
(2)手性醇中间体3与硫醇反应，得到手性含硫中间体10；或，手性醇中间体3与硒醇反应，得到手性含硒中间体11；其中，手性含硫中间体10或手性含硒中间体11的结构式为式11；
(3)s-构型的手性含硫中间体10或手性含硒中间体11与带有氰基的哒嗪酮经mitsunobu反应，得到构型反转的r-构型的手性tepotinib衍生物6f和7j；r-构型的手性含硫中间体10或手性含硒中间体11与带有氰基的哒嗪酮经mitsunobu反应，得到构型反转的s-构型的手性tepotinib衍生物6f和7j；其中，r-构型或s-构型的手性tepotinib衍生物6f和7j的结构式为式12。
当新型tepotinib衍生物为手性含硫或含硒衍生物时，其具体合成路线如下所示:
其中，各步骤的试剂和反应条件为：
a步骤：先加入伞花烃钌(ii)二氯二聚体、(s,s)-csdpen或(r,r)-csdpen，溶剂为水，氮气保护下，在25～40℃反应4～8小时；然后加入中间体2和甲酸钠，溶剂为二氯甲烷/水(质量比为2:1)，在25～35℃反应8～12小时，得到手性醇中间体3；其中，伞花烃钌(ii)二氯二聚体、(s,s)-csdpen或(r,r)-csdpen、中间体2、甲酸钠的摩尔比为(0.05～0.25)：(0.10～0.50)：(5.0～25)：(25.0～125)；
b步骤：(i)首先，硫脲或硒脲、n,n-二甲氨基氯丙烷盐酸盐的摩尔比为(2～10)：(2～10)，溶剂为无水乙醇，制备得到n,n-二甲氨基丙基异硫脲或n,n-二甲氨基丙基异硒脲；(ii)然后，手性醇中间体3、n,n-二甲氨基丙基异硫脲或n,n-二甲氨基丙基异硒脲、氢氧化钠的摩尔比为(1～5)：(2～10)：(4～20)，溶剂为n,n-二甲基甲酰胺/水(质量比为5:1)，先在25～35℃反应15～30分钟，然后在60～80℃反应3～8个小时，得到手性含硫中间体10或手性含硒中间体11；
c步骤：手性含硫中间体10或手性含硒中间体11、3-(6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-苯甲腈、三苯基膦、偶氮二甲酸二异丙酯的摩尔比为(0.5～2.5)：(0.5～2.5)：(0.75～3.75)：(0.75～3.75)，溶剂为四氢呋喃/n,n-二甲基甲酰胺(质量比为10:1)，先在0～4℃反应15～30分钟，然后在25～35℃反应18～24小时，得到r-构型或s-构型的手性tepotinib衍生物6f和7j。
所述新型tepotinib衍生物为手性含氧氘代衍生物时，其制备方法包括下述步骤：
(1)中间体8b(结构式为式13)在氘代氯仿溶剂中，其与羰基相邻的甲基上的氢被氘置换，得到氘代中间体10(结构式为式14)；
(2)氘代中间体10在手性氢转移反应催化剂伞花烃钌(ii)二氯二聚体，配体为(s,s)-csdpen或(r,r)-csdpen作用下，与甲酸钠或氘代甲酸钠反应，得到氘代中间体12(结构式为式15)；
(3)s-构型的氘代中间体12与带有氰基的哒嗪酮经mitsunobu反应，得到构型反转的r-构型的手性含氧氘代tepotinib衍生物14；r-构型的氘代中间体12与带有氰基的哒嗪酮经mitsunobu反应，得到构型反转的s-构型的手性含氧氘代tepotinib衍生物14；其中，r-构型或s-构型的手性含氧氘代tepotinib衍生物14的结构式为式16。
当新型tepotinib衍生物为手性含氧氘代衍生物时，其具体合成路线如下所示:
其中，各步骤的试剂和反应条件为：
a步骤：中间体8b、1,5,7-triazabicyclo[4.4.0]dec-5-ene(tbd)的摩尔比为(5～25)：(0.5～2.5)，溶剂为氘代氯仿，25～40℃反应18～24小时，得到氘代中间体12；
b步骤：消旋体：氘代中间体12、硼氘化钠的摩尔比为(1.0～5.0)：(2.0～10)，溶剂为氘代甲醇，0～4℃反应1～2小时，25～35℃反应1～4小时，得到中间体(±)-13；
光学异构体：氘代中间体12、氘代甲酸钠、伞花烃钌(ii)二氯二聚体、(s,s)-csdpen或(r,r)-csdpen的摩尔比为(1.0～5.0)：(5.0～25)：(0.05～0.25)：(0.10～0.5)，溶剂为二氯甲烷/水(质量比为2:1)，在25～35℃反应8～10小时，得到中间体(r)-13或(s)-13；
c步骤：中间体(±)-13或(r)-13或(s)-13、3-(6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-苯甲腈、三苯基膦、偶氮二甲酸二异丙酯的摩尔比为(0.5～2.5)：(0.5～2.5)：(0.75～3.75)：(0.75～3.75)，溶剂为四氢呋喃/n,n-二甲基甲酰胺(质量比为10:1)，先在0～4℃反应15～30分钟，然后在25～40℃反应18～24小时，得到r-构型或s-构型的手性含氧氘代tepotinib衍生物14。
所述新型tepotinib衍生物为手性含硫氘代衍生物时，其制备方法包括下述步骤：
(1)中间体2在氘代氯仿溶剂中，其与羰基相邻的甲基上的氢被氘置换，得到氘代中间体15(结构式为式17)；
(2)氘代中间体15在催化剂伞花烃钌(ii)二氯二聚体，手性配体(s,s)-csdpen或者(r,r)-csdpen作用下，经不对称氢转移反应，得到手性醇中间体16(结构式为式18)；
(3)硫醇与手性醇中间体16反应，得到含硫氘代中间体17(结构式为式19)；
(4)s-构型的含硫氘代中间体17与带有氰基的哒嗪酮经mitsunobu反应，得到构型反转的r-构型的手性tepotinib衍生物18；r-构型的含硫氘代中间体17与带有氰基的哒嗪酮经mitsunobu反应，得到构型反转的s-构型的手性氘代tepotinib衍生物18；其中，r-构型或s-构型的手性氘代tepotinib衍生物18的结构式为式20。
当新型tepotinib衍生物为手性含硫氘代衍生物时，其具体合成路线如下所示:
其中，各步骤的试剂和反应条件为：
a步骤：中间体2、1,5,7triazabicyclo[4.4.0]dec-5-ene(tbd)的摩尔比为(5～25)：(0.5～2.5)，溶剂为氘代氯仿，25～35℃反应18～24小时，得到氘代中间体15；
b步骤：消旋体：氘代中间体15、硼氘化钠的摩尔比为(1.0～5.0)：(2.0～10)，溶剂为氘代甲醇，先在0～4℃反应1～2小时，然后在25～35℃反应1～3小时，得到中间体(±)-16；
光学异构体：氘代中间体15、氘代甲酸钠、伞花烃钌(ii)二氯二聚体、(s,s)-csdpen或(r,r)-csdpen的摩尔比为(1.0～5.0)：(5.0～25)：(0.05～0.25)：(0.10～0.25)，溶剂为二氯甲烷/水(质量比为2:1)，25～35℃反应8～12小时，得到手性醇中间体16；
c步骤：(i)硫脲、n,n-二甲氨基氯丙烷盐酸盐的摩尔比为(2～10)：(2～10)，溶剂为无水乙醇，制备得到n,n-二甲氨基丙基异硫脲；(ii)手性醇中间体16、n,n-二甲氨基丙基异硫脲、氢氧化钠的摩尔比为(1～5)：(2～10)：(4～20)，溶剂为n,n-二甲基甲酰胺/水(质量比为5:1)，先在25～35℃反应15～30分钟，然后在60～70℃反应3～6个小时，得到含硫氘代中间体17。
d步骤：含硫氘代中间体17、3-(6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-苯甲腈、三苯基膦、偶氮二甲酸二异丙酯的摩尔比为(0.5～2.5)：(0.5～2.5)：(0.75～3.75)：(0.75～3.75)，溶剂为四氢呋喃/n,n-二甲基甲酰胺(质量比为10:1)，先在0～4℃反应15～30分钟，然后在25～35℃反应18～24小时，得到r-构型或s-构型的手性氘代tepotinib衍生物18。
上述新型tepotinib衍生物，对肿瘤细胞、特别是对c-met表达的非小细胞肺癌细胞有优异的抑制增殖效果，抑制活性达到纳摩尔级。
本发明还提供上述新型tepotinib衍生物的药学上可接受的盐，即新型tepotinib衍生物和药学上可接受的阴离子形成相应的盐类，采用公知的成盐方法制备得到。
上述新型tepotinib衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，是以所述新型tepotinib衍生物为活性成分，有效地治疗肿瘤；优选新型tepotinib衍生物为tepotinib的手性衍生物，更优选r-构型的tepotinib的光学手性异构体；最优选r-构型的tepotinib的光学手性氘代异构体。
上述新型tepotinib衍生物以药用的溶剂化物的形式使用，所述溶剂化物优选水合物。
本发明还提供一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其中含有治疗有效量的上述新型tepotinib衍生物和药学上可接受的辅助剂。所述药物组合物可以制成注射剂、片剂、胶囊剂、丸剂、悬浮剂或乳剂的形式使用；其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。
本发明与现有技术相比具有如下优点和效果:
(1)本发明在分子中引入了手性结构，对生物利用度和抗肿瘤活性均有良好的作用。
(2)本发明在分子中容易代谢的部位引入了氢的同位素氘，由于碳氘键比碳氢键更加稳定，有利于改善这类抗肿瘤化合物的药代动力学性质，提高药效和生物利用度。
(3)本发明在分子中引入硫、硒及亚砜等原子或基团，具有不同的药理性质，对研究该类化合物的其它适应性有良好的作用。
(4)本发明通过细胞水平上的抗肿瘤活性实验(具有c-met表达的肿瘤细胞)证明，本发明的化合物具有优异的抗肿瘤活性。
(5)本发明通过化合物在肝微粒体中的代谢稳定性实验证明，引入了氢的同位素氘，抗肿瘤化合物的稳定性明显提高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：抗肿瘤化合物5b
抗肿瘤化合物5b，其结构式为式21，合成步骤如下：
中间体2的制备：将碳酸钠(66mmol)的水溶液(32ml水)中，加入含有5-氟-2-氯嘧啶(33mmol)的甲苯溶液32ml，加入氯化双(三苯基膦)钯(0.33mmol)，滴加乙酰基苯基硼酸(32mmol)的乙醇溶液65ml。反应在氮气保护下80℃下搅拌18小时，冷却到室温，过滤。滤液中加入乙酸乙酯和水，分出有机相，无水硫酸钠干燥，粗产物经硅胶柱层析(乙酸乙酯:石油醚,8:1)分离得淡黄色固体，即中间体2。产率61％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.98(t,j＝1.6hz,1h),8.70(s,2h),8.59(s,1h),8.09(s,1h),7.60(s,1h),2.71(s,3h).
中间体3b的制备：0℃下，将硼氢化钠(15mmol)分批加入到中间体2(10mmol)的无水乙醇/四氢呋喃混悬液中。在0℃搅拌1小时后，移去冰浴。室温搅拌1小时,，将水缓慢加入反应液中淬灭反应。混合物用乙酸乙酯提取三次。将有机层用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到粗产品。粗产物经柱色谱纯化，得到白色固体，即中间体3b(乙酸乙酯:石油＝4:1)，产率:83％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.65(s,2h),8.38(s,1h),8.28(d,j＝7.5hz,1h),7.52(d,j＝7.5hz,1h),7.47(t,j＝7.6hz,1h),5.01(dd,j＝6.0,3.0hz,1h),1.56(d,j＝6.4hz,3h).
中间体4b的合成：搅拌下将中间体3b(5mmol)分批加入氯化亚砜(25mmol)中，30℃反应2小时，减压除去过量的氯化亚砜，残余物加入甲苯搅拌，减压除去甲苯得到氯代中间体。将上述氯代中间体及碳酸钾(7.5mmol)加入到3-(6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-苯甲腈(6mmol)的n-甲基吡咯烷酮溶液中，80℃搅拌反应20小时。加入水淬灭反应，乙酸乙酯提取3次，有机相经饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，粗产物经硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇＝100:1)分离得到黄色固体，即中间体4b，产率68％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.70(s,3h),8.33(d,j＝7.8hz,1h),8.19(s,1h),7.98(d,j＝8.0hz,1h),7.70(d,j＝7.7hz,1h),7.66–7.52(m,3h),7.46(t,j＝7.7hz,1h),7.04(d,j＝9.7hz,1h),6.56(q,j＝7.0hz,1h),1.93(d,j＝7.1hz,3h).
目标物5b的合成：在0℃下将氢化钠(60％,1.5mmol)分批加入到1-甲基哌啶-3-甲醇(1.2mmol)的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，搅拌15分钟，然后0℃下将中间体4b缓慢加入的反应液中，缓慢升温至室温并搅拌1小时。加入水淬灭反应，乙酸乙酯萃取，将合并的有机层干燥、浓缩，粗产物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1)，得到淡黄色油状物，即目标物5b，产率:69％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.69(s,1h),8.54(s,2h),8.30(d,j＝7.8hz,1h),8.22(s,1h),8.00(d,j＝8.0hz,1h),7.71(d,j＝7.7hz,1h),7.65–7.52(m,3h),7.45(t,j＝7.7hz,1h),7.05(d,j＝9.7hz,1h),6.56(t,j＝7.0hz,1h),4.20(t,j＝6.3hz,2h),2.53(t,j＝7.2hz,2h),2.31(s,6h),2.08–2.01(m,2h),1.94(d,j＝7.0hz,3h).13cnmr(101mhz,cdcl3)δ159.28,157.31,151.60,143.98,143.83,141.83,140.65,137.86,136.33,132.45,130.28,129.86,129.75,129.63,129.34,128.77,128.69,127.24,126.97,118.59,113.35,67.01,56.37,55.92,45.33,27.16,20.01.hrms(esi)m/z计算值c27h26n6ose[m+h]+,531.1408；实验值,531.1403.hplc纯度:95.2％,保留时间:16.68min.
实施例2:抗肿瘤化合物6a
抗肿瘤化合物6a，其结构式为式22，合成步骤如下：
中间体3a的制备：将碳酸钠(66mmol)的水溶液(32ml)加入含有5-氟-2-氯嘧啶(33mmol)的甲苯溶液(32ml)中，加入双(三苯基膦)二氯化钯(0.33mmol)，滴加羟甲基苯基硼酸(32mmol)的乙醇(65ml)溶液，氮气保护下，在80℃下搅拌18小时，冷却到室温，过滤，滤液中加入乙酸乙酯和水，分出有机相，无水硫酸钠干燥，粗产物经硅胶柱层析(乙酸乙酯:石油醚,8:1)，分离得淡黄色固体，即中间体3a.产率61％.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.66(d,j＝1.8hz,1h),8.37(d,j＝4.9hz,1h),8.31(s,1h),7.54-7.46(m,1h),4.80(s,1h),1.99(s,1h).
中间体4a的制备：搅拌下将中间体3a(5mmol)分批加入氯化亚砜(25mol)中，25℃反应2小时，减压除去过量的氯化亚砜，残余物加入甲苯，减压除去甲苯得氯化物粗产物，将粗产物及碳酸钾(2.75mol)加入到3-(6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-苯甲腈的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，80℃搅拌反应20小时，加入水淬灭反应，乙酸乙酯提取3次，有机相经饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，粗产物经硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇:100:1)，分离得到黄色固体，即中间体4a，产率68％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.68(s,2h),8.60(s,1h),8.34(d,j＝7.8hz,1h),8.16(s,1h),7.99(d,j＝8.0hz,1h),7.70(d,j＝7.7hz,1h),7.65(d,j＝9.7hz,1h),7.62–7.55(m,2h),7.48(t,j＝7.7hz,1h),7.09(s,1h),5.51(s,2h).
目标物6a的合成：将n,n-二甲氨基氯丙烷盐酸盐(2mmol)和硫脲(2mmol)溶解在无水乙醇(50ml)中，在氮气保护下回流7小时，冷却到室温，减压旋转蒸发除去溶剂得到异硫脲类似物，无需进一步纯化直接进行下一步。将中间体4a(1mmol)、异硫脲类似物(2mmol)和氢氧化钠固体(4mmol)置于单口瓶中，置换氮气，然后加入n,n-二甲基甲酰胺/水＝5:1，室温搅拌15分钟，然后在60℃下搅拌3小时，反应完毕后，反应液用乙酸乙酯稀释，用水洗涤，盐水洗涤，旋转蒸发浓缩，粗产物经柱色谱(ch2cl2:ch3oh＝20:1)纯化，得到黄色油状物，即目标物6a，产率56％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.77(s,2h),8.62(s,1h),8.36(d,j＝7.8hz,1h),8.16(s,1h),8.00(d,j＝8.1hz,1h),7.69(s,1h),7.65(d,j＝9.7hz,1h),7.58(dd,j＝14.7,7.0hz,2h),7.47(t,j＝7.7hz,1h),7.08(d,j＝9.7hz,1h),5.51(s,2h),3.03(t,j＝7.3hz,2h),2.41(t,j＝7.0hz,2h),2.22(s,6h),1.83(dt,j＝14.1,7.1hz,4h).13cnmr(101mhz,cdcl3)δ161.75,159.45,157.63,142.21,137.56,136.25,135.96,132.58,131.26,130.85,130.33,129.93,129.82,129.71,129.42,129.11,128.73,127.81,118.44,113.39,57.96,55.49,45.42,31.75,27.16.hrms(esi)m/zc27h26n6os[m+h]+,计算值483.1962；实验值483.1947.hplc纯度:96.8％,保留时间:9.65min.
实施例3:抗肿瘤化合物(r)-5b
抗肿瘤化合物(r)-5b，其结构式为式23，合成步骤如下：
中间体8b的制备：在0℃下将氢化钠(60％,1.5mmol)分批加入到1-甲基哌啶-3-甲醇(1.2mmol)的n,n-二甲基甲酰胺溶液10ml中，搅拌15分钟，然后将中间体2缓慢加入0℃的混合物中，使反应混合物缓慢升温至室温并搅拌1小时，将反应液用水稀释，乙酸乙酯萃取，将合并的有机层干燥、旋转蒸发得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1)，得到淡黄色油状物，即中间体8b，产率:73％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.93(t,j＝1.5hz,1h),8.56(dt,j＝7.8,1.3hz,1h),8.47(s,2h),8.04(dt,j＝7.7,1.3hz,1h),7.57(t,j＝7.8hz,1h),3.97(d,j＝5.8hz,2h),2.93(d,j＝11.0hz,2h),2.70(s,3h),2.31(s,3h),2.06–1.91(m,4h),1.88(d,j＝2.6hz,1h),1.48(qd,j＝13.6,13.1,3.6hz,2h).
中间体(s)-9b的制备：将二氯(对伞花烃)钌(ii)二聚体(0.01mmol)和手性配体(s,s)-csdpen(0.02mmol)置于50ml单口瓶中，加入纯水(5ml)，氮气保护，40℃搅拌4小时后迅速加入中间体8b(1mmol，溶于8ml二氯甲烷中)和甲酸钠(5mmol，溶于3ml纯水中)，室温下搅拌10小时。反应完毕后，向反应体系中加入水10ml，水相用二氯甲烷萃取，将合并的有机层干燥、浓缩，粗产物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1)，得到淡黄色油状物，即中间体(s)-9b，产率:70％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.44(s,2h),8.34(s,1h),8.24(d,j＝7.1hz,1h),7.53–7.42(m,2h),4.99(q,j＝6.4hz,1h),4.12(t,j＝6.3hz,2h),2.45(t,j＝7.2hz,2h),2.25(s,6h),2.02–1.94(m,2h),1.55(d,j＝6.4hz,3h).98.0％ee,大赛璐ad柱(0.46×25cm),正己烷/异丙醇＝75/25,0.5ml/min,λ＝254nm,tr＝15.79(r),ts＝18.85(s).
目标物(r)-5b的合成：在0℃下将偶氮二甲酸二异丙酯(0.600mmol，溶于1mln,n-二甲基甲酰胺中)缓慢加入到3-(6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-苯甲腈(0.40mmol)、中间体(s)-9b(0.40mmol)和三苯基膦(0.60mmol)的四氢呋喃溶液(4ml)，氮气保护，缓慢升温至室温，并在室温下搅拌18小时，减压旋转蒸发除去溶剂，粗产品经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝20:1)，得到无色油状物，即目标物(r)-5b，产率:57％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.69(s,1h),8.54(s,2h),8.30(d,j＝7.8hz,1h),8.22(s,1h),8.00(d,j＝8.0hz,1h),7.71(d,j＝7.7hz,1h),7.65–7.52(m,3h),7.45(t,j＝7.7hz,1h),7.05(d,j＝9.7hz,1h),6.56(t,j＝7.0hz,1h),4.20(t,j＝6.3hz,2h),2.53(t,j＝7.2hz,2h),2.31(s,6h),2.13–2.00(m,2h),1.94(d,j＝7.0hz,3h).13cnmr(126mhz,cdcl3)δ159.28,157.33,151.62,143.98,143.84,141.81,140.64,137.88,136.37,132.45,130.31,129.86,129.76,129.65,129.36,128.77,128.66,127.24,126.97,118.60,113.38,67.05,56.37,55.95,45.42,27.27,20.02.97.4％ee,大赛璐ad柱(0.46×25cm),正己烷/乙醇＝80/20,0.5ml/min,λ＝254nm,tr＝34.67(r),ts＝44.22(s).hplc纯度:95.0％,保留时间:16.68min.hrms(esi)m/zc28h28n6o2[m+h]+,计算值481.2347；实验值481.2331.
实施例4:抗肿瘤化合物(r)-6f
抗肿瘤化合物(r)-6f，其结构式为式24，合成步骤如下：
中间体(s)-3b的制备：将二氯(对伞花烃)钌(ii)二聚体(0.05mmol)和手性配体(s,s)-csdpen(0.10mmol)置于100ml单口瓶中，加入纯水(25ml)，氮气保护，40℃搅拌4小时后迅速加入中间体2(5mmol，溶于40ml二氯甲烷中)和甲酸钠(25mmol,溶于15ml纯水中)，室温下搅拌10小时。反应完毕后，向反应体系中加入水30ml，水相用二氯甲烷萃取，将合并的有机层干燥、浓缩，粗产物经硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到白色固体，即中间体(s)-3b，产率:71％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.65(s,2h),8.38(s,1h),8.28(d,j＝7.5hz,1h),7.52(d,j＝7.5hz,1h),7.47(t,j＝7.6hz,1h),5.01(dd,j＝6.0,3.0hz,1h),1.56(d,j＝6.4hz,3h).
中间体(s)-11a的制备：将n,n-二甲氨基氯丙烷盐酸盐(1mmol)和硫脲(1mmol)在无水乙醇(50ml)中在氮气保护下回流7小时，冷却到室温，减压旋转蒸发除去溶剂得到异硫脲类似物，无需进一步纯化直接进行下一步。将中间体(s)-3b(1mmol)、异硫脲类似物(2mmol)和氢氧化钠(4mmol)置于单口瓶中，将反应瓶里的空气置换成氮气，然后加入n,n-二甲基甲酰胺/水＝5:1，室温搅拌15分钟，然后在60℃下搅拌3小时。反应完毕后，反应液用乙酸乙酯稀释，用水洗涤，盐水洗涤，旋转蒸发浓缩，粗产物经柱色谱(二氯甲烷:甲醇＝20:1)纯化，得到无色油状物，即中间体(s)-11a，产率56％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.75(s,2h),8.40(q,j＝1.2,0.7hz,1h),8.32(dt,j＝7.6,1.6hz,1h),7.58–7.44(m,2h),5.01(q,j＝6.4hz,1h),3.08–2.97(m,2h),2.39(t,j＝7.0hz,2h),2.21(s,6h),1.85–1.78(m,2h),1.56(d,j＝6.5hz,3h).
目标物(r)-6f的合成：在0℃下将偶氮二甲酸二异丙酯(0.60mmol，溶于1mln,n-二甲基甲酰胺中)缓慢加入到3-(6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-苯甲腈(0.40mmoll)、化合物(s)-11a(0.40mmol)和三苯基膦(0.60mmoll)的四氢呋喃溶液(4ml)，氮气保护，缓慢升温至室温，并在室温下搅拌18小时，溶剂通过减压旋转蒸发除去，粗产物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝20:1)，得到淡黄色油状物，即目标物(r)-6f，产率:56％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.81(s,2h),8.76(s,1h),8.36(d,j＝7.9hz,1h),8.23(s,1h),7.97(d,j＝8.0hz,1h),7.70(d,j＝7.8hz,1h),7.59(dt,j＝12.6,8.8hz,3h),7.46(t,j＝7.7hz,1h),7.04(d,j＝9.7hz,1h),6.55(d,j＝7.0hz,1h),3.07(t,j＝7.1hz,2h),2.73–2.62(m,2h),2.43(s,6h),1.98(dd,j＝14.4,7.2hz,2h),1.92(d,j＝7.1hz,3h).13cnmr(126mhz,cdcl3)δ162.05,159.23,157.94,141.86,140.79,137.37,136.30,132.46,130.49,130.31,129.83,129.79,129.72,128.89,128.75,127.75,127.40,118.64,113.33,57.40,56.24,44.56,31.58,26.04,20.06.hrms(esi)m/zc28h28n6os[m+h]+,计算值497.2118；实验值497.2111.hplc纯度:99.0％,保留时间:17.24min.90.7％ee.大赛璐od柱(0.46×25cm),正己烷/乙醇＝80/20,0.5ml/min,λ＝254nm,tr＝29.94(r),ts＝31.88(s).
实施例5:抗肿瘤化合物(r)-14
抗肿瘤化合物(r)-14，其结构式为式25，合成步骤如下：
中间体12的制备：将1,5,7triazabicyclo[4.4.0]dec-5-ene(tbd,0.5mmol)加入到中间体8b(5mmol)的氘代氯仿(30ml)溶液中，室温下搅拌12小时，旋转蒸发得到粗产品，粗产品经柱色谱纯化(二氯甲烷:甲醇＝50:1)，得到中间体13.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.93(t,j＝1.5hz,1h),8.56(dt,j＝7.8,1.3hz,1h),8.47(s,2h),8.04(dt,j＝7.7,1.3hz,1h),7.57(t,j＝7.8hz,1h),3.97(d,j＝5.8hz,2h),2.93(d,j＝11.0hz,2h),2.70(s,3h),2.06–1.91(m,4h),1.88(d,j＝2.6hz,1h),1.48(qd,j＝13.6,13.1,3.6hz,2h).
中间体(s)-13的制备：将二氯(对伞花烃)钌(ii)二聚体(0.01mmol)和手性配体(s,s)-csdpen(0.05mmol)置于50ml单口瓶中，加入重水(3ml)，氮气保护，40℃搅拌4小时后迅速加入中间体12(1mmol，溶于8ml氘代氯仿)和氘代甲酸钠(5mmol,溶于3ml重水中)，室温下搅拌10小时，反应完毕后，向反应体系中加入水10ml，水相用二氯甲烷萃取，将合并的有机层干燥、浓缩，粗产物用乙酸乙酯重结晶，得到白色固体，即中间体(s)-13，产率:70％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.44(s,2h),8.34(dd,j＝1.9,1.4hz,1h),8.27–8.23(m,1h),7.50–7.44(m,2h),3.92(d,j＝5.9hz,2h),2.91(d,j＝11.4hz,2h),2.29(s,3h),2.00–1.93(m,2h),1.87–1.81(m,3h),1.47–1.35(m,2h).
目标物(r)-14的合成:在0℃下将偶氮二甲酸二异丙酯(0.60mmol，溶于1mln,n-二甲基甲酰胺中)缓慢加入到3-(6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-苯甲腈(0.40mmol)、化合物(s)-13(0.40mmol)和三苯基膦(0.60mmol)的四氢呋喃溶液(4ml)，氮气保护，缓慢升温至室温，并在室温下搅拌18小时，溶剂通过减压旋转蒸发除去，粗产物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝20:1)，得到淡黄色油状物，即目标物(r)-14，产率:56％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.73(s,1h),8.53(s,2h),8.29(d,j＝7.9hz,1h),8.26(s,1h),7.95(d,j＝8.0hz,1h),7.70(d,j＝7.7hz,1h),7.64–7.52(m,3h),7.44(t,j＝7.7hz,1h),7.03(d,j＝9.7hz,1h),4.06(s,2h),3.53(d,j＝9.3hz,2h),2.78(s,5h),2.12(s,5h).13cnmr(101mhz,cdcl3)δ159.28,157.31,151.60,143.98,143.83,141.83,140.65,137.86,136.33,132.45,130.28,129.86,129.75,129.63,129.34,128.77,128.69,127.24,126.97,118.59,113.35,67.01,56.37,55.92,45.33,27.16,20.01.hrms(esi)m/zc30h26d4n6os[m+h]+,计算值511.2724；实验值511.2714.hplc纯度:99.0％,保留时间:15.03min.97.1％ee.大赛璐ad柱(0.46×25cm),正己烷/乙醇＝80/20,0.5ml/min,λ＝254nm,tr＝40.66(r),ts＝64.22(s).
实施例6:抗肿瘤化合物(r)-18
抗肿瘤化合物(r)-18，其结构式为式26，合成步骤如下：
中间体15的制备:将1,5,7triazabicyclo[4.4.0]dec-5-ene(tbd,0.5mmol)加入到中间体8b(5mmol)的氘代氯仿(30ml)溶液中，室温下搅拌12小时，有机层水洗并用饱和氯化钠溶液干燥，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到粗产品，粗产品经柱色谱纯化(二氯甲烷:甲醇＝50:1)，得到所需化合物16.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.98(t,j＝1.6hz,1h),8.70(s,2h),8.60(dt,j＝7.8,1.5hz,1h),8.10(dt,j＝7.7,1.5hz,1h),7.60(t,j＝7.8hz,1h),2.71(s,3h).
中间体(s)-16的制备:将二氯(对伞花烃)钌(ii)二聚体(0.05mmol)和手性配体(s,s)-csdpen(0.10mmol)置于100ml单口瓶中，加入纯水(25ml)，氮气保护，40℃搅拌4小时后迅速加入中间体15(5mmol，溶于40ml二氯甲烷中)和甲酸钠(25mmol,溶于15ml纯水中)，室温下搅拌10小时，反应完毕后，向反应体系中加入水30ml，水相用二氯甲烷萃取，将合并的有机层干燥、浓缩，粗产物经硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到白色固体，即中间体(s)-16，产率:71％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.73(s,2h),8.40(t,j＝1.8hz,1h),8.30(dt,j＝7.6,1.6hz,1h),7.55–7.43(m,2h),4.98(s,1h),2.99(t,j＝7.3hz,2h),2.37(t,j＝7.1hz,2h),2.19(s,6h),1.81(q,j＝7.2hz,2h).
中间体(s)-17的制备：将n,n-二甲氨基氯丙烷盐酸盐(1mmol)和硫脲(1mmol)在无水乙醇(50ml)中在氮气保护下回流7小时，冷却到室温，减压旋转蒸发除去溶剂得到异硫脲类似物，无需进一步纯化直接进行下一步。将中间体(s)-16(1mmol)、异硫脲类似物(2mmol)和氢氧化钠(4mmol)置于单口瓶中，将反应瓶里的空气置换成氮气，然后加入n,n-二甲基甲酰胺/水＝5:1，室温搅拌15分钟，然后在60℃下搅拌3小时。反应完毕后，反应液用乙酸乙酯稀释，用水洗涤，盐水洗涤，旋转蒸发浓缩，粗产物经柱色谱(二氯甲烷:甲醇＝20:1)纯化，得到无色油状物，即中间体(s)-17，产率56％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.75(s,2h),8.40(q,j＝1.2,0.7hz,1h),8.32(dt,j＝7.6,1.6hz,1h),7.58–7.44(m,2h),5.01(s,1h),3.08–2.97(m,2h),2.39(t,j＝7.0hz,2h),2.21(s,6h),1.85–1.78(m,2h).
目标物(r)-18的合成：在0℃下将偶氮二甲酸二异丙酯(0.60mmol，溶于1mln,n-二甲基甲酰胺中)缓慢加入到3-(6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-苯甲腈(0.40mmol)、化合物(s)-17(0.40mmol)和三苯基膦(0.60mmol)的四氢呋喃溶液(4ml)，氮气保护，缓慢升温至室温，并在室温下搅拌18小时，溶剂通过减压旋转蒸发除去，粗产物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝20:1)，得到淡黄色油状物，即目标物(r)-19，产率:61％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.78(s,2h),8.71(s,1h),8.35(d,j＝7.7hz,1h),8.18(s,1h),7.99(d,j＝7.7hz,1h),7.69(d,j＝7.9hz,1h),7.58(dt,j＝11.2,8.8hz,3h),7.45(t,j＝7.7hz,1h),7.03(d,j＝9.7hz,1h),6.53(s,1h),3.03(t,j＝7.2hz,2h),2.41(t,j＝7.1hz,2h),2.22(s,6h),1.88–1.77(m,2h).13cnmr(101mhz,cdcl3)δ161.89,159.26,157.73,141.82,140.78,137.46,136.33,132.46,130.34,130.19,129.83,129.78,129.65,128.88,128.68,127.70,127.39,118.55,113.41,57.89,56.19,45.27,31.75,27.01.hplc纯度:96.8％,保留时间:16.83min.hrms(esi)m/zc28h25d3n6os[m+h]+,计算值500.2306；实验值500.2293.92.6％ee.大赛璐od柱(0.46×25cm),正己烷/乙醇＝80/20,0.5ml/min,λ＝254nm,tr＝28.96(r),ts＝31.90(s).
测试例：本发明新型tepotinib衍生物的抗肿瘤活性：
对本发明新型tepotinib衍生物的抗肿瘤细胞活性进行测试，我们选择人高转移性肝癌细胞mhcc-97h进行了mtt法抗肿瘤细胞增殖活性的评估。具体操作步骤如下：将肿瘤细胞按一定的细胞量接种在96孔培养板内，细胞密度为5x103-10x103个/孔，在37℃、二氧化碳浓度为5％的培养箱中过夜后，加入待测化合物样品。培养72小时后，加入mtt继续4小时，加入dmso溶解，震摇，然后在酶标仪(570nm)下进行检测。
本发明新型tepotinib衍生物对人高转移性肝癌细胞mhcc-97h的半数抑制浓度ic50值如表1所示。表1中的数据说明，在分子中引入手性中心后，对化合物的抗肿瘤活性产生了很大的影响。两个对映异构体的抗肿瘤活性差异非常明显，例如，消旋体(±)-5b(编号4)抑制人高转移性肝癌细胞mhcc-97h活性，其ic50为0.0353μm，而(r)-5b(编号5)抑制该肿瘤细胞的ic50为0.0037μm，优于消旋体和teponinib(编号14，其活性为0.0134μm)。相应，(s)-5b(编号6)的抑制活性为0.1182μm，大大低于消旋体和(r)-5b(编号5)。化合物(r)-5b的抑制肿瘤细胞活性，分别是(±)-5b和(s)-5b的9.5倍和31.9倍。由此可见，在哒嗪酮和苯环之间的位置引入手性中心，对增强抑制人高转移性肝癌细胞mhcc-97h的活性，有重要作用。在其他化合物中，也有类似的构效关系，例如，在另外三个系列，(±)-5a，(r)-5a和(s)-5a；(±)-6f，(r)-6f和(s)-6f；(±)-7j，(r)-7j和(s)-7j中，(r)构型的化合物都比相应的消旋体(±)和(s)构型的化合物有更好的抑制肿瘤细胞活性。上述结果说明，(r)构型化合物的立体空间构型对抑制人高转移性肝癌细胞mhcc-97h活性有至关重要的作用。
在化合物(r)-5b手性中心碳上的氢原子和甲基上的氢原子均被同位素氘所取代后，得到氘代化合物(r)-15。化合物(r)-15在保持了(r)-5b的优良的抑制肿瘤细胞活性的同时，具有比(r)-5b更好的代谢稳定性。如下表2所示，其中(r)-5b在肝微粒体中代谢的半衰期为26.8分钟，而化合物(r)-15的半衰期为35分钟，稳定性有所提高，二者在肝微粒体中代谢的半衰期都高于tepotinib(20.7分钟),这对于提高抗肿瘤化合物在体内的疗效，有积极的意义。
表1本发明新型tepotinib衍生物对人高转移性肝癌细胞mhcc-97h的抑制活性
表2大鼠肝微粒体稳定性试验