一种极细链格孢在防控外来入侵杂草意大利苍耳中的应用的制作方法

本发明属于植物保护领域，具体为一种极细链格孢在防控外来入侵杂草意大利苍耳中的应用。

背景技术：

外来生物入侵是一个世界性的问题。入侵生物通过取代原有物种或抑制新物种在入侵地的生存而降低生物多样性，从而破坏生态系统稳定性，影响当地经济发展。我国是受生物入侵危害最为严重的国家之一，特别是近年来随着经济的飞速发展和国际贸易的日益繁荣，一些外来物种通过商业、旅游等途径悄然进入我国。据统计，目前在我国已有外来入侵植物600余种，其中有50余种位列国际自然保护联盟公布的全球100种最具威胁的外来物种中；目前已造成严重危害的种类已多达103种，其中仅紫茎泽兰、豚草、水葫芦和大米草等几种外来入侵植物每年给我国造成的经济损失就超过140亿美元，总体损失可高达千亿。

近年来，外来植物意大利苍耳(xanthiumitalicum)在我国的入侵态势逐渐加剧。意大利苍耳为菊科苍耳属一年生草本植物，原产地为北美洲和南欧，现主要分布在东、西半球的中纬度地区，是我国重要的外来入侵植物之一。1991年9月在北京市昌平区北祁家镇马坊桥的沟渠边首次发现，目前已经蔓延到八大处、密云等地，在深圳、广西、河北、新疆、辽宁、山东等地均有发现，2007年度被列入《中华人民共和国省进口植物检疫有害生物名录》。意大利苍耳适生性强,在荒地、田间、河滩、沟边路旁都能生长。在湿润地、水浇地、沟渠边植株生长得更加茂盛高大。意大利苍耳植株覆盖度大，竞争力强,与当地物种争夺水分、营养、光照和生长空间,很容易在新的生态环境中形成优势群落，而且由于意大利苍耳适应性极强，在野外极易形成大范围单一群落。

目前防控意大利苍耳的主要手段有人工防治和化学除草。人工防治只能在较短时间、较小范围起作用，且费时费力；化学除草剂因为靶向单一，易产生抗体，而且由于在自然界中缺乏将其分解的微生物，会对环境造成污染；而生物农药因其来源于自然，可被微生物降解，对环境较为友好，适应可持续发展的需求。因此，开展生物防治是目前防治意大利苍耳最具潜力的和开发前景的方法。

技术实现要素：

本发明目的在于，提供一种真菌极细链格孢在防控外来入侵杂草意大利苍耳中的应用，该真菌极细链格孢(alternariatenuissima)是从新疆乌鲁木齐市郊的野外居群中意大利苍耳自然发病植株叶片上分离纯化获得的，从分离纯化得到的真菌极细链格孢中分别采用常规方法制备菌丝悬浮液和粗毒素，再分别将制备的菌丝悬浮液和粗毒素均匀喷洒在杂草意大利苍耳植株上，对恶性杂草意大利苍耳具有很强的致病作用和控制效果，本发明培养操作简单、培养基质材料易获得、所得到的菌丝悬浮液及毒素稳定性强，获取工艺简单，可大批量生产；以其作茎叶喷施，使用方便，可有效杀灭目标杂草意大利苍耳，具有较高的环境安全性。

本发明所述的一种极细链格孢在防控外来入侵杂草意大利苍耳中的应用，该真菌极细链格孢(alternariatenuissima)是从新疆乌鲁木齐市郊的野外居群中意大利苍耳自然发病植株叶片上分离纯化获得的，从分离纯化得到的真菌极细链格孢中分别采用常规方法制备菌丝悬浮液和粗毒素，再分别将制备的菌丝悬浮液和粗毒素均匀喷洒在杂草意大利苍耳植株上，其中：

将制备的菌丝悬浮液喷洒在杂草意大利苍耳叶面上，接种后48h后植株叶片出现明显病斑点；3d后植株患病率达100％，整个植株叶片已经开始失水黄化；10d后整个植株萎蔫死亡；

将制备的真菌粗毒素配制为5㎎/ml的溶液，均匀喷洒在野外杂草意大利苍耳植株上，喷雾处理3d后，意大利苍耳植株死亡。

所述一种真菌极细链格孢在防控外来入侵杂草意大利苍耳中的应用，粗毒素的野外实施量为30ml/m²。

本发明所述的一种真菌极细链格孢在防控外来入侵杂草意大利苍耳中的应用，该真菌极细链格孢(alternariatenuissima)是从新疆乌鲁木齐市郊野外自然居群中意大利苍耳自然发病植株叶片上分离纯化获得的，采集时间为2016年7月。

本发明所述的一种真菌极细链格孢在防控外来入侵杂草意大利苍耳中的应用，根据形态学特征和分子生物学手段将其鉴定为极细链格孢。

本发明所述的一种真菌极细链格孢在防控外来入侵杂草意大利苍耳中的应用，其中真菌极细链格孢的分离鉴定为：

意大利苍耳强致病菌株的分离纯化：在乌鲁木齐市郊采集意大利苍耳自然发病植株，通过马铃薯蔗糖培养基(pda)分离纯化得到多种真菌，并用柯赫氏法则验证，经过致病性试验的比较筛选，获得了对意大利苍耳有很强致病作用的杀草病原真菌极细链格孢，其所对应的rdnaits基因片段已上传至在genbank，登录号为ky087531.1，名称为极细链格孢xif10。

菌株的形态特征鉴定：在马铃薯蔗糖培养基(pda)培养基上25℃培养5d菌落(图1a)直径可达64mm以上，病菌菌落圆形，表面气生菌丝较发达，绿色，短絮状，呈辐射状扩展：菌丝(图1c)无色，分隔，直径约1.3－2.7m，该真菌在马铃薯蔗糖培养基(pda)培养基上难以产生孢子。

菌株分子技术鉴定：提取菌株的基因组dna，采用rdnaits通用引物：its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3)，its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3)进行rdnaits序列的pcr扩增，获得长度为530bp(rdnaits)基因片段，从ncbiblast检索与目标序列同源性高的dna序列，与本试验所测序列分别进行菌株种内比对，由比对结果确定真菌极细链格孢与极细链格孢(alternariatenuissima)是同一个种。

菌株的最佳培养条件和接种侵染条件：菌株的最佳培养条件和接种侵染条件：该真菌菌落生长的最适培养基为马铃薯葡蔔糖培养基(pda)，最适温度28℃，最适酸碱度为ph6.5，在这些条件下，菌落生长快，病菌侵染致病时，菌丝悬浮液的最佳条件是菌丝湿重与无菌水比例在1:100甚至更高，接种后保湿和暗光48h，并在整个侵染时期保持温度25-28℃。

极细链格孢(xif10)菌块的致病性：将经灭菌的培养皿大小的滤纸放入培养皿中，每皿一张，并加入1ml灭菌蒸馏水，剪取生长健壮无病斑的叶片，用清水冲洗干净后，用浓度为70％酒精擦洗1遍，然后再用灭菌蒸馏水漂洗3次后晾干，叶片正面向上展开放入培养皿中，每皿放1片，保湿培养备用；在叶片近边缘约1cm处针刺造成微伤口，切取在马铃薯蔗糖培养基(pda)上培养的大小约为0.5×0.5cm²的极细链格孢(xif10)菌块，置于伤口处，再用保鲜膜密封保湿，重复3次，另做空白对照，恒温培养箱25℃保存5d，5d后病菌直径达2cm²。

极细链格孢(xif10)菌丝悬浮液致病性：挑取极细链格孢(xif10)菌种接种马铃薯蔗糖培养基(pda)中，在温度25℃恒温培养7d，拨取菌丝并将其配制成菌丝悬浮液(菌丝湿重与无菌水1:100)，采用涂抹法接种，用无菌毛刷将菌丝均匀地涂抹于意大利苍耳叶片上，直至叶片上菌丝液开始下滴为止，用无菌水涂抹的意大利苍耳作对照，接种后用塑料袋套在意大利苍耳上以保持高湿度，48h后揭去塑料袋，接种期间温度为25-28℃，接种后48h后植株叶片出现明显病斑点；3d后植株患病率达100％，整个植株叶片已经开始失水黄化；10d后整个植株萎蔫死亡。

极细链格孢(xif10)粗毒素的致病性：用马铃薯葡萄糖(pdb)培养液培养7d后，四层纱布过滤1次，所得滤液再用双层层析滤纸过滤，然后滤液离心20min，转速为4000r/min，所得上清液经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发器真空蒸发得到致病粗毒素，将所得粗毒素配制为5㎎/ml的溶液，用该毒素的喷洒意大利苍耳叶片后3dh后植株死亡。

极细链格孢(xif10)菌株生防菌的制备和应用：

(1)菌丝悬浮液的制备：

将保藏的菌种移殖于试管马铃薯蔗糖培养基(pda)斜面培养基进行活化，将活化后的极细链格孢(xif10)移入马铃薯蔗糖培养基(pda)平板培养基上培养5d后，拨取菌丝将其制为菌丝悬浮液(菌丝湿重与无菌水1:100)，将所得菌丝悬浮液喷洒在意大利苍耳叶面上，接种后48h后植株叶片出现明显病斑点；3d后植株患病率达100％，整个植株叶片已经开始失水黄化；10d后整个植株萎蔫死亡。

(2)粗毒素的制备：

将菌种移殖于试管马铃薯蔗糖培养基(pda)斜面培养基进行活化，将活化后的极细链格孢移入马铃薯蔗糖培养基(pda)平板培养基上培养5d后，然后用直径为5mm的打孔器打取菌饼接入马铃薯葡萄糖培养液中(2块/100ml)，放入摇床振荡培养，设置温度为25℃、转速110r/min，连续培养7d，将马铃薯葡萄糖培养液经过四层纱布过滤得到滤液，所得滤液再用双层滤纸过滤，然后滤液离心20min，转速4000r/min，所得上清液经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发仪真空蒸空得到粗毒素，将所得粗毒素配制为5㎎/ml的溶液，于晴天或阴天傍晚均匀得喷洒在杂草意大利苍耳叶面，喷雾处理3d后，意大利苍耳植株枯萎死亡。

极细链格孢粗毒素制剂的应用及其优点：将所得的极细链格孢粗毒素制剂均匀的喷洒在杂草意大利苍耳叶面，每平方米喷雾使用量为稀释后的菌液30ml，对意大利苍耳有良好的防除作用，且对人、畜安全，没有毒害。

本发明所述的一种真菌极细链格孢在防控外来入侵杂草意大利苍耳中的应用，其极细链格孢(xif10)的rdnaits序列：

gaagggcgggctggacctctcggggttacagccttgctgaattattcacccttgtcttttgcgtacttcttgtttccttggtgggttcgcccaccactaggacaaacataaaccttttgtaattgcaatcagcgtcagaaacaaattaataattacaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtagtgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccctttggtattccaaagggcatgcctgttcgagcgtcatttgtaccctcaagctttgcttggtgttgggcgtcttgtctctagctttgctggagactcgccttaaagtaattggcagccggcctactggtttcggagcgcagcacaagtcgcactctctatcagcaaaggtctagcatccattaagcctttttttcaacttttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggagg

附图说明

图1为本发明意大利苍耳在野外的单一群落图片；

图2为本发明意大利苍耳极细链格孢(xif10)的形态特征图片，其中a为马铃薯蔗糖培养基(pda)上第5d菌落正面；b为马铃薯蔗糖培养基(pda)上第5d菌落背面；c为菌丝；

图3为本发明极细链格孢(xif10)菌块侵染意大利苍耳叶片5d后的症状(病斑)图片；其中a为清水对照；b为极细链格孢(xif10)菌块处理；

图4为本发明极细链格孢(xif10)菌丝悬浮液喷洒室内意大利苍耳盆栽后10d植株发病情况图片；其中a为清水对照；b为极细链格孢(xif10)菌丝悬浮液处理；

图5为本发明意大利苍耳极细链格孢(xif10)粗毒素室内生物测定结果图片；其中a为清水对照；b为极细链格孢(xif10)粗毒素处理；

图6为本发明极细链格孢(xif10)粗毒素悬浮液喷洒野外意大利苍耳48h植株发病情况图片；其中a为极细链格孢(xif10)毒素溶液作用前；b为极细链格孢(xif10)毒素溶液作用后。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

意大利苍耳病原菌的分离纯化与筛选：

意大利苍耳病原菌分离、纯化：

菌株的分离：分别选取意大利苍耳带有典型病斑的叶片或茎杆，用清水冲洗干净，在病健交界处剪取2mm×2mm大小的组织块，在超净工作台依次在70％的酒精，0.1％的升汞中消毒，然后在灭菌水中连续漂洗3次，取出后用灭菌的吸水纸吸去多余的水分之后放在马铃薯蔗糖培养基(pda)平板中，于温度25℃恒温培养箱中培养；

待pda平板培养基上的菌落长到一定大小时，进行分离纯化并经致病性测定后移入马铃薯蔗糖培养基(pda)试管斜面后于冰箱4℃下保存备用；

寄主植物来源及培植：采集无明显病害症状的相对健康植株，去除衰老叶片后移栽到温室内的水槽内备用，在接种试验前2d选取长势良好且大小适中的健康意大利苍耳植株，分别植入塑料钵中，塑料钵底部加施少量营养土并灌满自来水，将盆钵植株放在温室自然温度下生长；

意大利苍耳病害诊断和回接：挑取少量分离纯化所得的病原菌菌种接种马铃薯蔗糖培养基(pda)培养基中，在温度25℃恒温培养7d，拨取菌丝并将其配制成菌丝悬浮液(菌丝湿重与无菌水1:100)，采用涂抹法接种，用无菌毛刷将菌丝均匀地涂抹于意大利苍耳叶片上，直至叶片上菌丝液开始下滴为止，用无菌水涂抹的意大利苍耳作对照，接种后用塑料袋套在意大利苍耳上以保持高湿度，48h后揭去塑料袋，接种期间温度为25-28℃，接种后适时观察发病情况并记录病害症状；

待接种植株的叶片出现症状后，用组织分离法对病原菌进行再分离，对前后分离病原菌的培养性状、菌丝等形态特征等进行比较；

意大利苍耳病原菌的筛选：

在温度25℃条件下，将分离所得的各个菌株分别按菌丝湿重与无菌水1:100的比例配制成菌丝悬浮液，接种前，用无菌水将意大利苍耳叶片冲洗干净，采用涂抹法接种，用无菌毛刷将菌丝均匀地涂抹于意大利苍耳叶片上，直至叶片上菌丝液开始下滴为止，以无菌水涂抹的意大利苍耳作为对照，接种后，用塑料袋套在意大利苍耳上，保持高湿度，48h后，除去塑料袋,观察记录植株的感病率和病害严重度；

意大利苍耳病原菌分类地位鉴定：

病原菌的形态学鉴定：马铃薯蔗糖培养基(pda)上培养病原菌，适时观察记录病原菌的各种形态特征；菌落直接用数码相机拍摄，真菌的菌丝在光学显微镜下观察，并用显微成像系统拍摄；

病病原菌的分子鉴定：总dna的提取采用氯仿/异戊醇提取法，采用rdnaits序列的pcr扩增通用引物：its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3)，its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3)进行rdna序列的pcr扩增，再将得到的pcr产物进行测序，获得长度为530bp(rdnaits)基因片段(详见序列表)在genbank的登录号为ky087531.1，名称为极细链格孢(xif10)，获得的菌株株rdnaits序列在www.ncbi.nlm.nih.gov数据库中进行blast比对，进而确定病原菌的分类地位；

极细链格孢xif10菌块对意大利苍耳叶片的致病性测验：

将经灭菌的培养皿大小的滤纸放入培养皿中，每皿一张，并加入1ml灭菌蒸馏水，剪取生长健壮无病斑的叶片，用清水冲洗干净后，用70％酒精擦洗一遍，然后再用灭菌蒸馏水漂洗3次后晾干，叶片正面向上展开放入培养皿中，每皿放1片，保湿培养备用；在叶片近边缘约1cm处针刺造成微伤口，切取在马铃薯蔗糖培养基(pda)上培养的大小约为0.5×0.5cm²的极细链格孢(xif10)菌块，置于伤口处，再用保鲜膜密封保湿，重复3次，另做空白对照，恒温培养箱25℃保存5d，5d后病菌直径达2cm²(图3)；

极细链格孢xif10菌丝悬浮液对意大利苍耳盆栽的致病性测验：

挑取极细链格孢(xif10)菌种接种马铃薯蔗糖培养基(pda)中，在温度25℃恒温培养7d，拨取菌丝并将其配制成菌丝悬浮液(菌丝湿重与无菌水1:100)，采用涂抹法接种，用无菌毛刷将菌丝均匀地涂抹于意大利苍耳叶片上，直至叶片上菌丝液开始下滴为止，用无菌水涂抹的意大利苍耳作对照，接种后用塑料袋套在意大利苍耳上以保持高湿度，48h后揭去塑料袋，接种期间温度为25-28℃，接种后48h后植株叶片出现明显病斑点；3d后植株患病率达100％,整个植株叶片已经开始失水黄化；10d后整个植株萎蔫死亡(图4)；

极细链格孢(xif10)菌丝悬浮液水剂的制备方法：

将菌种移殖于试管马铃薯蔗糖培养基(pda)斜面培养基进行活化，将活化后的极细链格孢(xif10)移入马铃薯蔗糖培养基(pda)平板培养基上培养5d后，拨取菌丝将其制为菌丝悬浮液(菌丝湿重与无菌水1:100)，即极细链格孢(xif10)的菌丝悬浮液制剂；

极细链格孢粗毒素制剂的应用及其优点：将所得的极细链格孢粗毒素制剂均匀的喷洒在意大利苍耳叶面，每平方米喷雾使用量为稀释后的菌液30ml，对意大利苍耳有良好的防除作用，且对人、畜安全，没有毒害。

实施例2

意大利苍耳病原菌的分离纯化与筛选依据实施例1；

极细链格孢(xif10)粗毒素的提取：

意大利苍耳极细链格孢xif10的产毒培养：

在超净工作台上，取出培养好的意大利苍耳极细链格孢菌株平板，挑取少量菌丝，接种于马铃薯葡萄糖(pdb)培养基中，将接种的马铃薯葡萄糖(pdb)放入摇床振荡培养，设置温度为25℃、转速110r/min，12h黑暗交替，连续培养7d，得到发酵液；

粗毒素的提取

将所得的发酵液，用四层纱布过滤1次，所得滤液用双层层析滤纸过滤，然后滤液离心20min，转速为10000r/min，所得上清液即为毒素粗提液；

乙酸乙酯萃取试验：

在分液漏斗中先装入100ml粗毒素，再装入等体积的乙酸乙酯萃取剂，充分震荡使得两种液体混匀，静置至分层后，从下缓慢移出有机相，再向水相中加入等体积的萃取剂，如此连续萃取3次，合并有机相，得到萃取有机相和萃取水相；对有机相进行旋转蒸发，蒸发掉有机溶剂，萃取产物即为极细链格孢xif10的粗毒素，将其密封4℃冰箱保存备用；

极细链格孢xif10的粗毒素活性测试：

离体叶片针刺法：将萃取得到的毒素配制为2㎎/ml的水溶液，将灭菌的培养皿大小的滤纸放入培养皿中，每皿一张，并加入1ml灭菌蒸馏水，剪取生长健壮无病斑的叶片，用清水冲洗干净后，用70％酒精擦洗一遍，然后再用灭菌蒸馏水漂洗3次后晾干，叶片正面向上展开放入培养皿中，每皿放1片，保湿培养备用；在叶片近边缘约1cm处针刺造成微伤口，分别吸待测液40μl，滴于伤口处，再用保鲜膜密封保湿，重复3次，用无菌水作对照，恒温培养箱25℃保存5d，5d后病菌直径达1cm²(图5)；

极细链格孢(xif10)粗毒素水剂对野外意大利苍耳致病性的测试：

将菌种移殖于试管马铃薯蔗糖培养基(pda)斜面培养基进行活化，将活化后的极细链格孢(xif10)移入马铃薯蔗糖培养基(pda)平板培养基上培养5d后，挑取少量马铃薯蔗糖培养基(pda)培养基中的菌丝接种在马铃薯葡萄糖(pdb)上并摇床一周，将马铃薯葡萄糖(pdb)培养液经过四层纱布过滤得到滤液，所得滤液再用双层滤纸过滤，然后滤液离心20min，转速4000r/min，所得上清液经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发仪真空抽滤得到粗毒素，将所得粗毒素配制为5㎎/ml的溶液，于晴天或阴天傍晚均匀得喷洒在意大利苍耳叶面，喷雾处理3d后，意大利苍耳植株枯萎死亡(图6)；

极细链格孢xif10菌株粗毒素水剂的制备方法：

挑取少量马铃薯蔗糖培养基(pda)中的菌丝接种在马铃薯葡萄糖(pdb)上并摇床一周，将pdb培养液经过四层纱布过滤得到滤液，所得滤液再用双层滤纸过滤，然后滤液离心20min，转速4000r/min，所得上清液经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发仪真空蒸空得到粗毒素，进而将所得粗毒素配制为5㎎/ml的溶液；

极细链格孢粗毒素制剂的应用及其优点：将所得的极细链格孢粗毒素制剂均匀的喷洒在意大利苍耳叶面，每平方米喷雾使用量为稀释后的菌液30ml，对意大利苍耳有良好的防除作用，且对人、畜安全，没有毒害。

序列表

<110>中国科学院新疆生态与地理研究所

<120>一种真菌极细链格孢在防控外来入侵杂草意大利苍耳中的应用

<130>2018

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>480

<212>dna

<213>一种真菌极细链格孢(alternariatenuissima在防控外来入侵杂草意大利苍耳中的应用)

<400>1