一种高效降解纤维素的微生物菌剂及制备方法与流程

本发明涉及一种微生物领域，具体涉及一种高效降解纤维素的微生物菌剂及制备方法。

背景技术：

中国是一个农业大国,各类秸秆资源非常丰富，年产量近八亿吨，秸秆是一种具有非常大的利用空间的资源。但大部分秸秆资源并未合理的开发利用，绝大多数被弃置田间或被焚烧,造成资源的浪费和环境的严重污染。

随着人口的迅猛增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等社会问题日益严重。寻找并开发新的能源、节省粮食、减少环境污染越来越重要，因此加强秸秆的综合利用是必不可少的环节。

秸秆还田被认为是一种有效的农田培肥措施,也是秸秆资源利用经济且可持续的方式。玉米秸秆的主要成分为纤维素、半纤维素和木质素，少量蛋白质和灰分。

纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上最为丰富的可再生资源。从可持续发展的角度出发，纤维素被彻底降解而不会对环境造成污染的一条有效途径便是利用纤维素酶的水解作用，它可使大量纤维素资源和城市纤维素废料转变成人类所需的物质，具有积极的深远意义。到目前为止，纤维素酶已广泛应用于工、农、畜、医等领域中，并取得了初步成效。我国对纤维素酶的研究虽然有几十年的历史，但由于纤维素酶的酶系组成相当复杂，活性不高，生产成本过高而导致其应用仍受到限制。因此选育高活性的纤维素酶是我国酶制剂研究的一项重要任务。

由于纤维素酶水解纤维素会产生大量的纤维二糖和寡糖的积累，纤维二糖是纤维素酶系中其他酶的抑制剂，从而整个纤维素的水解过程受到抑制，故β-萄葡萄糖苷酶水解纤维二糖从而释放出葡萄糖成为关键的一步。而目前β-葡萄糖苷酶表达量低是在纤维素酶降解纤维素糖化过程中的瓶颈，因此提高β-葡萄糖苷酶表达量及产酶速率是促进秸秆降解的有效途径。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高效降解纤维素的微生物菌剂，其活性成分包括高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉突变株以及增加产酶活性的培养基。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种高效降解纤维素的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉突变菌株（aspergillusniger），所述黑曲霉突变菌株已于2018年3月23日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址是中国湖北武汉市武昌区珞珈山街16号武汉大学，保藏编号是cctccno:m2018150。

上述微生物菌剂还包含：添加量为14.94g/l的葡萄糖，添加量为14.82g/l的蛋白胨，添加量为1g/l的mn²⁺；其初始ph值为4.98。

本发明微生物菌剂中含有的黑曲霉突变菌株是经过采集土壤的菌株→培养基初筛选菌株→酶活力测定复筛菌株→artp诱变菌株→发酵条件优化培养等步骤，得到的株，并提供最优的发酵条件，发酵培养基成份的最优配比使得该黑曲霉突变菌株活性进一步提高。

本发明获得的有益效果：

本发明提供一种高效降解纤维素的微生物菌剂，1、该微生物菌剂活性成分包括高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉突变株，其可产β-葡萄糖苷酶酶活性约为140.023iu/ml。2、本发明所提供的微生物菌剂在发酵生长过程中，可以产生大量草酸和柠檬酸等多种有机酸和植酸酶，从而使有机磷和无机磷得以吸收利用，将本发明的菌剂作物生物有机肥的成分时可以增加土壤的肥力提高作物产量。3、同时，本发明微生物菌剂中包含的黑曲霉突变菌株与目前关于纤维素酶生产菌株所用的绝大部分纤维素酶系齐全且酶活力较高的木霉如绿色木霉和里氏木霉等菌株相比更安全无毒。

附图说明

图1：野生型菌株与突变株生长曲线及β-葡萄糖苷酶产酶历程。

具体实施方式

实施例1菌株筛选

采用随机采样法，用灭菌铲除去土壤的表层，取土壤100g于无菌塑料袋内，并标明采样地点和时间。称1g土样加入到10ml无菌水中，摇匀，吸取1ml于液体pda培养基（酵母粉10g/l、蛋白胨20g/l、琼脂20g/l）中，28℃180r/min摇床培养24h。菌株经富集培养后，稀释10⁴-10⁷倍，各取50μl稀释液涂布在pda培养基上，于28℃培养3d，挑取单菌落用于菌种初筛。

初筛：产β-葡萄糖苷酶菌株在以p-npg（对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷20g/l、酵母粉10g/l、蛋白胨20g/l、琼脂20g/l）为唯一碳源的筛选培养基上能水解p-npg生成p-np，并在na2co3作用下可形成黄色光圈，光圈大小颜色深浅能初步反映酶活性高低。因此，将分离到的菌株接种在pda培养基上28℃活化24h后接种在筛选培养基上，28℃培养72h，喷1mol/lna2co3进行显色，黄色光圈明显的菌株即为目标菌株。将产β-葡萄糖苷酶菌株分离，接种于液体发酵培养基中，用于筛选高产β-葡萄糖苷酶菌株。

复筛：将初筛得到的目标菌株，接种到初始发酵培养基中，以180r/min，28℃摇床培养。每24h取发酵液10ml于4℃，8000r/min离心10min，收集上清液，测定上清液中的酶活力，从中筛选酶活较高菌株。

酶活测定方法：标准曲线的绘制，称取对硝基苯酚139.0mg，蒸馏水定容至1000ml，分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml于25ml容量瓶中，加入5ml1mol/lna2co3溶液,以蒸馏水定容后混匀，于400nm处测其吸光值。以对硝基苯酚浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

利用p-npg法测定β-葡萄糖苷酶酶活，取0.1ml稀释了适当倍数的粗酶液,加入1mlph4.8的0.05mmol/l柠檬酸缓冲溶液,于50℃水浴预热10min,加入已预热10min的0.9ml5mmol/lp-npg溶液,计时10min,后立即加入5ml1mol/lna2co3溶液终止反应,加入蒸馏水定容到25ml,室温放置5min,于400nm处测吸光度。在上述条件下，1ml酶液1min水解产生1umol的对硝基苯酚酶活力，定义为一个酶活单位。

实施例2artp诱变筛选突变株

将黑曲霉菌种接种于pda培养基上，30℃培养96h。加入10ml灭菌的生理盐水洗脱孢子，吸取孢子悬液于ep管中，将孢子浓度调整到(10⁶~10⁷)cfu/ml作为诱变原液。

利用常温常压(artp)等离子体育种机对黑曲霉进行诱变。诱变时的工作气体为氦气。按照处理功率100w，氦气流量12slm，样品与等离子体发生器出口距离2mm，处理样品为10ul,150s诱变照射时间来处理包子混悬液。

对处理后的孢子悬液稀释10^-1-10^-6倍，取100μl稀释液在pda平板中涂布，置于30℃培养箱中培养到的突变株直径较大生长速度较快，进行摇瓶培养并对秸秆进行发酵。

实施例3突变株酶活力进行测定

本实验获得的突变株进行摇瓶发酵，并对酶活力进行测定，测定方法同实施例2，所得到的一株突变菌株生长、产酶加快且酶活力稳定。经传代确定为稳定正突变株后，对其与野生型菌株进行对比，测定其生长曲线及β-葡萄糖苷酶活力。如图1所示：突变株于第9天达到菌丝体生长极限，菌株生长对数期为4-7天，野生型于第12天达到菌丝体生长极限，菌种生长的对数期为7-10天，突变株优于野生型提前到达对数期3天。突变株于第9天达到产酶顶峰，酶活力104.305iu/ml；野生型于第12天达到产酶顶峰，酶活力77iu/ml，突变株产酶加快且酶活力升高。

实施例4突变株发酵玉米秸秆产β-葡萄糖苷酶发酵培养

黑曲霉摇瓶培养基发酵玉米秸秆条件为：初始ph值4.98，葡萄糖添加量14.94g/l,蛋白胨添加量14.82g/l,mn²⁺添加量1g/l，培养温度28℃，转速150r，接种量为2%，秸秆粉的添加量为40g/l。

按照此配比进行摇瓶培养，进行实验验证，结果显示在该条件下所测得β-葡萄糖苷酶活力为140.023iu/ml，得到最佳产酶的培养条件：将初始ph值调到4.98，葡萄糖添加量14.94g/l,蛋白胨添加量14.82g/l,mn²⁺添加量1g/l。