拟茎点霉的原生质体制备方法及基因敲除方法与流程

本申请涉及分子生物学和生物技术领域，特别是涉及一种拟茎点霉的原生质体制备方法及基因敲除方法。

背景技术：

内生真菌枫香拟茎点霉是一种广谱内生真菌，能与多种植物共生(yangb,etal.,plantphysiolbiochem.2014,82:172-82)，如小麦、水稻、花生等。前期研究表明，该菌在低氮条件下，可促进氮素积累，增强氮素代谢关键酶活力，从而有利于植株氮素营养的吸收，提高氮肥利用率和植株总生物量(yangb,etal.,frontmicrobiol.2015,6:982)；还能够促进花生结瘤增产(zhangw,etal.,plantphysiolbiochem.2016,98:1-11)。转录水平研究表明，该菌在共生状态时，其苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成相关基因明显上调(zhouj,etal.,frontplantsci.2017,8:121)，而这三种氨基酸是多种次级代谢产物的前体物质，在生长、再生，防御和环境响应等方面具有重要作用(maedah,dudarevan.annurevplantbiol.2012,63,73–105)。抑菌实验研究发现，该菌能够抑制尖孢镰刀菌的生长，而尖孢镰刀菌是引起小麦赤霉病的重要病原病之一。目前防治植物病害的主要策略是采用化学试剂(figueroam,etal.,molplantpathol.2017,doi:10.1111/mpp.12618;张洁，etal.,小麦赤霉病的防治技术研究进展.中国植保导刊.2014,34(1):24-28,53)，如拜耳的戊唑醇、丙硫菌唑以及丙硫菌唑与氟吡菌酰胺复合制剂，巴斯夫的多菌灵、甲基硫菌灵、三唑酮、戊唑醇、咪鲜胺、井冈霉素等。市面上较为通用的药剂有戊唑醇与咪鲜胺的混剂以及氰烯菌酯的相关混剂产品。我国防治小麦赤霉病常用多菌灵。多菌灵能够刺激病菌产生don毒素，尤其是使得抗药性菌株产毒能力更强(zhangl,etal.,molplantpathol.2016,17(1):16-28)。抗药性的产生，使得无论使用什么药剂，很难起到防治作用。除此之外，药剂的大量使用还会造成环境污染和食品安全问题。其次，防治植物病害最经济有效的措施是选用抗病品种。国内育种工作者在选育和推广抗病品种方面做了大量工作，但总体而言其抗病性和丰产性还不够理想(giancasproa,etal.,frontplantsci.2016,7:1381)。植物转基因品种可以提高植物的抗病性，但是植物转基因品种的生物安全性备受争议(devosy,etal.,2014,23(1):1-25)，使得植物转基因品种的应用十分受限。枫香拟茎点霉在植物中的定殖不进入种子，具有良好的生物安全性，避免了植物转基因带来的争议问题，为开发新型的农业生防菌剂提供支撑。近年来研究表明，内生真菌次级代谢产物不仅揭示了内生真菌在与植物的互惠共生中的重要作用，而且可保护植物免受生物胁迫和非生物胁迫损伤(panaccionedg,etal.,pnas.2001,98,12820–12825)。lahrmann等发现内生真菌次级代谢产物是维护互惠互利的主要决定因素(lahrmannu,etal.,pnas.2013,110,13965–13970)。因此，内生真菌枫香拟茎点霉与植物良好的互惠共生关系机制的研究，使得其遗传操作体系的构建显得尤为重要。迄今为止，该菌的遗传操作体系的研究及应用尚属空白。本发明旨在提供适合在枫香拟茎点霉中使用的遗传操作体系。

枫香拟茎点霉为丝状真菌，而丝状真菌遗传背景较细菌和酵母而言，更加复杂，遗传操作困难，也导致丝状真菌的分子生物学和遗传学研究进展相对缓慢。对丝状真菌进行基因敲除、敲入或阻断的限制因素主要有四个方面：（1）原生质体制备较困难；（2）同源重组效率低，例如在烟曲霉中同源重组效率低于5%；（3）可使用的筛选标记有限，目前丝状真菌主要使用的抗生素筛选标记有3种：潮霉素、草丁膦和博莱霉素等，而且有限的筛选标记并不是对所有的丝状真菌都起作用；（4）rna干扰技术不能完全消除基因的背景影响，并且在一些丝状真菌中很难建立有效的rna干扰系统(李红花，刘钢.遗传.2017,39(5):355-367)。本发明提供了该菌的原生质体制备技术、转化及基因敲除技术，为解析这个独特菌株的遗传背景和深入研究枫香拟茎点霉与植物共生，次级代谢产物生物合成对植物的抗病性研究创造必要条件。

申请内容

解决的技术问题：

本申请需要解决的技术问题是现有技术中原生质体制备较困难、同源重组效率低、可使用的筛选标记有限、rna干扰技术不能完全消除基因的背景影响等技术问题，提提供一种拟茎点霉的原生质体制备方法及基因敲除方法，主要包括原生质体制备条件的选择、转化条件、基因敲除表达框的构建策略。

技术方案：

一种拟茎点霉的原生质体制备方法，包括以下步骤：

第一步，菌种的活化：从保存于试管中的pda固体培养基上刮取菌丝接到含有50mlpda液体培养基的锥形瓶中，在28℃、180rpm条件下培养两天，从液体培养基中吸取2ml菌丝液接到新的含有50mlpda液体培养基的锥形瓶中，继续在28℃、180rpm条件下培养36h；

第二步：使用尼龙膜过滤菌丝液获得菌丝，然后用0.6m的mgso4将菌丝清洗干净，取1g湿菌丝体于10ml裂解液中孵育，孵育温度≥28℃，孵育时摇床转速≥80rpm；

第三步：孵育≥8h后取出，3000rpm-5000rpm先离心10min，弃去上清液，用5mlstc缓冲液重悬后得原生质体悬浊液，将悬浊液在3000rpm-5000rpm再离心10min，用移液枪吸取顶部的原生质体于新的1.5ml离心管中，稀释至10⁸个·ml^-1制得。

作为本申请的一种优选技术方案：所述第一步中pda液体培养基由土豆200g/l和葡萄糖20g/l组成。

作为本申请的一种优选技术方案：所述第二步中孵育温度为28℃，孵育时摇床转速80rpm。

作为本申请的一种优选技术方案：所述第二步中裂解液由20mg的trichoderma、20mg的yatalase和0.8m无机盐离子定容至10ml制得，所述无机盐离子是cacl2,nacl或mgcl2。

作为本申请的一种优选技术方案：所述第三步中孵育时间为13h，离心条件为先在3000rpm下离心10min，弃去上清液，用5mlstc缓冲液重悬后得原生质体悬浊液，将悬浊液在5000rpm再离心10min。

作为本申请的一种优选技术方案：所述第三步中stc缓冲液由山梨醇1.2moll^-1、cacl210mm·l^-1和ph7.5的tris·hcl10mm·l^-1组成。

拟茎点霉的基因敲除方法，包括以下步骤：

第一步：构建剪切元件和基因敲除表达框，所述剪切元件主要包括以下核心元件：来源于真菌的u6启动子、靶标基因的grna和终止子，所述剪切元件还包括以下核心元件：来源于真菌的toxa启动子、cas9基因及nos终止子，基因敲除表达框包括以下核心元件：靶标基因ura上游同源臂、潮霉素抗性基因hygr和靶标基因ura下游同源臂；

第二步：将质粒转化进入原生质体的过程：制备peg溶液和软琼脂再生培养基，取制备好的原生质体80μl于新的1.5ml离心管中，加入20μlpeg溶液和5μg质粒，用移液枪轻轻混匀，冰浴；冰浴30min后加入900μlpeg溶液，用移液枪轻轻混匀，室温条件下静置，热激；热激20min后加入10ml提前融化了的含有100μg·ml^-1潮霉素的再生培养基，混匀后倒入灭菌的平板，待培养基凝固后于28℃条件下倒置培养；敲除菌株在添加尿嘧啶的培养基上正常生长，而无尿嘧啶的培养基，敲除菌株不能生长；

第三步：基因敲除菌株的分子鉴定过程：倒置培养2-3天后挑选转化子单菌落提取基因组dna，左右臂向外各延伸约100bp后分别设计上下游引物，以转化子基因组dna为模板扩增靶点处dna片段，琼脂糖电泳鉴定；基因成功被敲除的菌株电泳条带比未被敲除的菌株或野生型菌株电泳条带大1.4kb，将成功敲除的电泳条带切下测序，比对测序结果最终确定基因是否被成功敲除。

作为本申请的一种优选技术方案：所述靶标基因为ura基因和mapk途径的关键基因mapk1，分别编码乳清酸脱氧核苷5'-磷酸脱羧酶和丝裂原激活蛋白激酶1。

作为本申请的一种优选技术方案：所述第五步中peg溶液由peg4000（60%）、cacl2（50mm·l^-1）和tris·hcl（50mm·l^-1，ph7.5）组成，软琼脂再生培养基由土豆200g·l^-1、山梨醇182g·l^-1、尿苷1g·l^-1、尿嘧啶1g·l^-1和琼脂粉10g·l^-1组成。

作为本申请的一种优选技术方案：所述第五步中待培养基凝固后于28℃条件下倒置培养3天得到阳性克隆。

作为本申请的一种优选技术方案：所述u6启动子序列如seqidno.1所示。

作为本申请的一种优选技术方案：所述toxa启动子序列如seqidno.2所示。

作为本申请的一种优选技术方案，所述nos终止子序列如seqidno.3所示。

作为本申请的一种优选技术方案：所述grna-ura序列如seqidno.4所示。

作为本申请的一种优选技术方案：所述grna-mapk1序列如seqidno.5所示。

作为本申请的一种优选技术方案：所述cas9序列如seqidno.6所示。

作为本申请的一种优选技术方案：所述潮霉素抗性基因序列如seqidno.7所示。

附图说明：

图1为本申请所述拟茎点霉原生质体显微镜观察结果图；

图2为本申请所述构建的基因敲除载体图；

图3为本申请所述pcr验证ura基因的敲除，ura敲除原理设计图；

图4本申请所述pcr验证ura基因的敲除，pcr验证敲除后的b3菌株图；

图5本申请所述pcr验证ura基因的敲除，菌株仅在添加尿嘧啶时能生长图。

有益效果：

本申请所述一种拟茎点霉的原生质体制备方法及基因敲除方法采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：1、基因敲除效率高；2、原生质体制备技术简单；3、同源重组效率高；4、增加了内生真菌拟茎点霉基因敲除的筛选标记；5、所述拟茎点霉原生质体制备和基因敲除的方法，将剪切元件和表达原件构建在同一个载体上，整合到拟茎点霉基因组中，只需对拟茎点霉进行一次转化；6、本发明可用于多个基因的敲除；7、应用本发明，成功敲除了拟茎点霉中的ura基因和mapk1基因，其中ura的敲除对表型没有任何影响，形态正常，遗传转化稳定；8、mapk1基因是与生长发育密切相关的基因，可看到表型变化,菌株生长缓慢，菌丝细小。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本申请的内容，但不应理解为对本申请的限制。在不背离本申请精神和实质的情况下，对本申请方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本申请的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1:

菌种的活化：从保存于试管中的pda固体培养基上刮取菌丝接到含有50mlpda液体培养基的锥形瓶中，在28℃、180rpm条件下培养两天，从液体培养基中吸取2ml菌丝液接到新的含有50mlpda液体培养基的锥形瓶中，继续在28℃、180rpm条件下培养36h，所述pda液体培养基由土豆200g/l和葡萄糖20g/l组成。

原生质体的制备过程：使用尼龙膜过滤菌丝液获得菌丝，然后用0.6m的mgso4将菌丝清洗干净，取1g湿菌丝体于10ml裂解液中孵育，孵育温度≥28℃，孵育时摇床转速≥80rpm，所述裂解液由20mg的trichoderma、20mg的yatalase和0.8m无机盐离子定容至10ml制得，所述无机盐离子是cacl2,nacl或mgcl2；孵育≥8h后取出，3000rpm-5000rpm先离心10min，弃去上清液，用5mlstc缓冲液重悬后得原生质体悬浊液，将悬浊液在3000rpm-5000rpm再离心10min，此时原生质体漂浮在离心管液面顶部，杂质则沉降到管底，用移液枪小心吸取顶部的原生质体于新的1.5ml离心管中，稀释至10⁸个·ml^-1备用，所述stc缓冲液由山梨醇1.2moll^-1、cacl210mm·l^-1和ph7.5的tris·hcl10mm·l^-1组成。

实施例2：

菌种的活化：从保存于试管中的pda固体培养基上刮取菌丝接到含有50mlpda液体培养基的锥形瓶中，在28℃、180rpm条件下培养两天，从液体培养基中吸取2ml菌丝液接到新的含有50mlpda液体培养基的锥形瓶中，继续在28℃、180rpm条件下培养36h，所述pda液体培养基由土豆200g/l和葡萄糖20g/l组成。

原生质体的制备过程：使用尼龙膜过滤菌丝液获得菌丝，然后用0.6m的mgso4将菌丝清洗干净，取1g湿菌丝体于10ml裂解液中孵育，孵育温度28℃，孵育时摇床转速80rpm，所述裂解液由20mg的trichoderma、20mg的yatalase和0.8m无机盐离子定容至10ml制得，所述无机盐离子是cacl2,nacl或mgcl2；孵育13h后取出，3000rpm先离心10min，弃去上清液，用5mlstc缓冲液重悬后得原生质体悬浊液，将悬浊液在5000rpm再离心10min，此时原生质体漂浮在离心管液面顶部，杂质则沉降到管底，用移液枪小心吸取顶部的原生质体于新的1.5ml离心管中，稀释至10⁸个·ml^-1备用，所述stc缓冲液由山梨醇1.2moll^-1、cacl210mm·l^-1和ph7.5的tris·hcl10mm·l^-1组成。实验结果见说明书附图1所示。

实施例3:

拟茎点霉的基因敲除方法：根据靶标序列设计合适的grna序列，将u6启动子和ura的grna通过融合pcr融合成片段1，连接到载体pct74上；再将toxa启动子、cas9和nos终止子通过融合pcr融合成片段2，连接到载体上；将靶标序列上游序列、潮霉素抗性基因和靶标序列下游序列通过融合pcr连接成片段3，再连接到载体上，得到新的载体pctu。

根据靶标序列设计合适的grna序列，将u6启动子和mapk1的grna通过融合pcr融合成片段1，连接到载体pct74上；再将toxa启动子、cas9和nos终止子通过融合pcr融合成片段2，连接到载体上；将靶标序列上游序列、潮霉素抗性基因和靶标序列下游序列通过融合pcr连接成片段3，再连接到载体上，得到新的载体pctm。

取制备好的原生质体80μl于新的1.5ml离心管中，加入20μlpeg溶液和5μg质粒，用移液枪轻轻混匀，冰浴。冰浴30min后加入900μlpeg溶液，用移液枪轻轻混匀，室温条件下静置，热激。热激20min后加入10ml提前融化了的含有100μg·ml^-1潮霉素的软琼脂再生培养基，混匀后倒入灭菌的平板，待培养基凝固后于28℃条件下倒置培养2-3天得到阳性克隆。peg溶液由peg4000（60%）、cacl2（50mm·l^-1）和tris·hcl（50mm·l^-1，ph7.5）组成，软琼脂再生培养基由土豆200g·l^-1、山梨醇182g·l^-1、尿苷1g·l^-1、尿嘧啶1g·l^-1和琼脂粉10g·l^-1组成。

倒置培养2-3天后挑选转化子单菌落提取基因组dna,左右臂向外各延伸约100bp后分别设计上下游引物，以转化子基因组dna为模板扩增靶点处dna片段，琼脂糖电泳鉴定。基因成功被敲除的菌株电泳条带比未被敲除的菌株或野生型菌株电泳条带大1.4kb，将成功敲除的电泳条带切下测序，比对测序结果最终确定基因是否被成功敲除。

实施例4:

本实验说明ura基因敲除质粒的构建：

以pct74质粒为原始质粒，从px330质粒中pcr扩增出cas9蛋白的cds区，将扩增出的dna片段无缝克隆进入pct74质粒中荧光蛋白前，使cas9蛋白和荧光蛋白无缝融合成一个蛋白，构建出第一个质粒pct74-cas9。

以烟曲霉基因组为模板pcr扩增出烟曲霉的u6启动子，以px330为模板扩增出sgrna骨架，将u6启动子和sgrna骨架融合pcr成一个dna片段后无缝克隆至第一个质粒pct74-cas9的xhoⅰ限制性酶切位点，构建出第二个质粒pct74-cas9-sgrna。

使用网站http://zifit.partners.org/zifit/csquare9nuclease.aspx设计靶标基因的grna序列，选取互补的两条grna序列送去公司合成出两条单链oligos，将单链oligos混合后使用磷酸化酶对5’-端进行磷酸化，磷酸化完成后变性退火成一条互补双链oligo，最后使用dna连接酶将互补双链oligo酶连进入第二个质粒pct74-cas9-sgrna的bbsⅰ限制性酶切位点，构建出第三个质粒pct74-cas9-sgrna-ura。

以枫香拟茎点霉基因组为模板，分别pcr扩增出ura基因靶点上游1kbdna片段（左臂）和下游1kbdna片段（右臂），以pct74质粒为模板pcr扩增出潮霉素抗性基因hygr，将上游左臂、潮霉素抗性基因hygr、右臂按顺序融合pcr成一个dna片段。使用限制内切酶salⅰ对第三个质粒pct74-cas9-sgrna-ura进行酶切，最后将前面融合好的dna片段无缝克隆至酶切后质粒的salⅰ限制性酶切位点构建出最后一个质粒pct74-cas9-sgrna-ura-donor,即pctu；采用同样的方法得到敲除质粒pctm。

载体构建实验结果见说明书附图2所示。所构建的载体可同时表达cas9基因，grna基因及敲除基因上下游同源臂。

实施例5

本实验说明将质粒转化进入原生质体的过程：

取制备好的原生质体80μl于新的1.5ml离心管中，加入20μlpeg溶液和5μg质粒，用移液枪轻轻混匀，冰浴。冰浴30min后加入900μlpeg溶液，用移液枪轻轻混匀，室温条件下静置，热激。热激20min后加入10ml提前融化了的含有100μg·ml^-1潮霉素的软琼脂再生培养基，混匀后倒入灭菌的平板，待培养基凝固后于28℃条件下倒置培养2-3天得到阳性克隆。peg溶液由peg4000（60%）、cacl2（50mm·l^-1）和tris·hcl（50mm·l^-1，ph7.5）组成，软琼脂再生培养基由土豆200g·l^-1、山梨醇182g·l^-1、尿苷1g·l^-1、尿嘧啶1g·l^-1和琼脂粉10g·l^-1组成。

成功敲除菌株实验结果如附图3所示。pda+δura,指敲除菌株在pda培养基中不能生长；pda+uu，敲除菌株可在添加有尿嘧啶的培养基中生长；pda+wt，指野生型菌株的对照。

实施例6：

本实验说明ura基因敲除菌株的分子鉴定过程：

倒置培养2-3天后挑选转化子单菌落提取基因组dna,左右臂向外各延伸约100bp后分别设计上下游引物，以转化子基因组dna为模板扩增靶点处dna片段，琼脂糖电泳鉴定。基因成功被敲除的菌株电泳条带比未被敲除的菌株或野生型菌株电泳条带大1.4kb，将成功敲除的电泳条带切下测序，比对测序结果最终确定基因是否被成功敲除。

实验结果如附图4所示。左侧为基因敲除时同源臂的设计原理示意图，右侧为pcr实验验证目标基因敲除前后所得到的目标片段大小，野生型基因片段约2200bp,目标基因敲除后片段大小为3600bp。

u6启动子序列seqidno.1：

cccagtagcgaaaatgccactccagacttatccgcgtttggcggtactggcataccactgggagggtatgatctgggaatgacgggaatgaatcaaaggtcccatcggtgatgggtattgctcctttttttttttttttttttttttttttctctctttgcgagcggttctggttgggcgaatatggtgtcttggaaaagggtggggggttcacgacttctatatgctctgtatgctgaactgtttgtgtaactgagttgtatatccctgctttactccgtactctgatccattactttctttgtctgtgtcgtctaatctcgttgccatactgacccgcttaccgaccaatcatgccactggaaattcctttatagttcattctaatgtcttcacaagt

toxa启动子序列seqidno.2：

atcgattggaatgcatggaggagttctgtacgcgcaattccgctctccgtaaggatgcttcggaggtgcacatggtctcatacatgtaggcccgacgaggatcgagtcggttccgaagtaggatcgtctcgattgttgggcatcattgcatggacattcagagggcctactgatacctggaatccgcaccgtccggctacctagcaataagattctgtgtatataaagggctaaggtgtccgtccttgataaaaccaccaccctcaacaacttacctcgactatcagcatcccgtcctatctaacaatcgtccatcggtatccaactccaactctattcgcagggtcctagaatcgtaagtacacgcttatatcttgttgccagcgatagctgacaatgaatgaatataggcc

nos终止子序列seqidno.3：

gcggccgcccggctgcagatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatccgatgataagctgtcaaacatgagaattcctgcagcccgggggatccactagttctagagcggccgc

grna-ura序列seqidno.4：

gcttcctgatcttcgaggat

grna-mapk1序列seqidno.5：

ggggcgttcatcatggggac

cas9序列seqidno.6：

atggactataaggaccacgacggagactacaaggatcatgatattgattacaaagacgatgacgataagatggccccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccgacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggaaacctgattgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgatcaagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaaagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagcagcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtggtggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtgaagcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccggcgtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaaggacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgaggacagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacctgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggatttcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctgacctttaaagaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacgagcacattgccaatctggccggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgaaatggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaatgaagcggatcgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtggaaaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaactggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctgaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaactactggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggccgagagaggcggcctgagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcacaaagcacgtggcacagatcctggactcccggatgaacactaagtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgtccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagctggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaacggcgaaaccggggagatcgtgtgggataagggccgggattttgccaccgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagtgaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagacaggcggcttcagcaaagagtctatcctgcccaagaggaacagcgataagctgatcgccagaaagaaggactgggaccctaagaagtacggcggcttcgacagccccaccgtggcctattctgtgctggtggtggccaaagtggaaaagggcaagtccaagaaactgaagagtgtgaaagagctgctggggatcaccatcatggaaagaagcagcttcgagaagaatcccatcgactttctggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaaggacctgatcatcaagctgcctaagtactccctgttcgagctggaaaacggccggaagagaatgctggcctctgccggcgaactgcagaagggaaacgaactggccctgccctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccactatgagaagctgaagggctcccccgaggataatgagcagaaacagctgtttgtggaacagcacaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagtgatcctggccgacgctaatctggacaaagtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagcccatcagagagcaggccgagaatatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctgccgccttcaagtactttgacaccaccatcgaccggaagaggtacaccagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggcgacaaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaag

潮霉素抗性基因序列seqidno.7：

gttaactggttcccggtcggcatctactctattcctttgccctcggacgagtgctggggcgtcggtttccactatcggcgagtacttctacacagccatcggtccagacggccgcgcttctgcgggcgatttgtgtacgcccgacagtcccggctccggatcggacgattgcgtcgcatcgaccctgcgcccaagctgcatcatcgaaattgccgtcaaccaagctctgatagagttggtcaagaccaatgcggagcatatacgcccggaggcgcggcgatcctgcaagctccggatgcctccgctcgaagtagcgcgtctgctgctccatacaagccaaccacggcctccagaagaggatgttggcgacctcgtattgggaatccccgaacatcgcctcgctccagtcaatgaccgctgttatgcggccattgtccgtcaggacattgttggagccgaaatccgcatgcacgaggtgccggacttcggggcagtcctcggcccaaagcatcagctcatcgagagcctgcgcgacggacgcactgacggtgtcgtccatcacagtttgccagtgatacacatggggatcagcaatcgcgcatatgaaatcacgccatgtagtgtattgaccgattccttgcggtccgaatgggccgaacccgctcgtctggctaagatcggccgcagcgatcgcatccatggcctccgcgaccggctggagaacagcgggcagttcggtttcaggcaggtcttgcaacgtgacaccctgtgcacggcgggagatgcaataggtcaggctctcgctgaactccccaatgtcaagcacttccggaatcgggagcgcggccgatgcaaagtgccgataaacataacgatctttgtagaaaccatcggcgcagctatttacccgcaggacatatccacgccctcctacatcgaagctgaaagcacgagattcttcgccctccgagagctgcatcaggtcggagacgctgtcgaacttttcgatcagaaacttctcgacagacgtcgcggtgagttcaggctttttcatttggatgcttgggtagaataggtaagtcagattgaatctgaaataaagggaggaagggcgaacttaagaaggtatgaccgggtcgtccacttaccttgcttgacaaacgcaccaagttatcgtgcaccaagcagcagatgataataatgtcctcgttcctgtctgctaataagagtcacacttcgagcgccgccgctactgctacaagtggggctgatctgaccagttgcctaaatgaaccatcttgtcaaacgacacaaattttgtgctcaccgcctggacgactaaaccaaaataggcattcattgttgacctccactagctccagccaagcccaaaaaatgctccttcaatatcagttaac

靶标基因ura序列seqidno.8：

atgtcggcaccaaggcattccagtttaacgagtagctacggcgaccgggcagcgggcgcgacacacccgttgacaaactacctccttcgcttaatggaactcaaacaatccaacttgtgcgtgtctgccgatgtacacagcgcacgggaactcttgtctctggccgacaaggtcggcccctcgatcgtcgtcctcaaaacgcactacgacctcgtcatgggctgggacttcaaccctcaaacgggcacgggagcgtaccttgccgccctggccagaaaacacggcttcctgatcttcgaggatcggaagtactgcgacattggcagcacggtgcagatgcagtatgttagtggaaccgcgagggtcatagattgggcgcacatcgtcaacgcgaacatctcagcgggaaagccaatggtgggggcaatggccgaggcagcggccaaatggcgggaaagaatcaattacgaggtgcgcacgagcgtcacagttggaacacccgtgagcgacggtttcgagagtgagtccgacgagatggacgagacggaggacgagaatgctggtgctctcggcaacaacgggcagaggaagccctccgccgcgctggaggccagggacatcaacatgatggcgccgccgccaccacctcgagacgccgatgggcgcaagggcagtatcgtcagcatcaccacggtgacacaatctttcgagccggccgactccccacgcctgtccaagagcctttccgacgttgacgacatcgtctaccccggaattgaggaggcaccactcgagaggggcctgctgctcctggcacaaatgtccagcagcggcaatctcatggacgcccgctacacaaacgcttgcatcgaggcagcgagggagaacaaggatttcgtgatgggttacgtggcacaggagagcctgaactcagaacctgatgacaactttatccacatgactccaggctgcaagctgccgccagagggcgaggaggagaatggcgaaggaatgcagggcgatggaatgggtcaacagtacaacacgccagcgaagctgattggaatatgcggcacggatatcgtcatcgtaggaaggggtatcatcaaggcgggagatccgcagggggaggcagagagataccgggtgagggcatggaaggcctaccaggcaaggctg

靶标基因mapk1序列seqidno.9：

atgctctcccagtctccaaatcctgtccccatgatgaacgccccagcgcctctccttcgacccgccataccaggtgcaagaggcggcggcgcccgtacacctcgcctgggactcgctataccaccctcaccgaatgtcaagcctgtgggcgccggcgccggcggtgtcggccagccctctcgtccgcccctacccaagctcaacctcgccactcctatgggcacgtctgtggcccctcaagaacatcaaccctcgcgtggctcacaaccgggtcacagcgccagtggcggcagcgagagcagcgctgcacacagccggacgggcagcttcgggccgctggacggcagaggcagcaacccaacctcggcaggctcgcagtactcggcgctctccttcgcatcccagtacggcctgggcggcgcaaaaccacatggcactcccgatcccgtaagtgccgtgggctcgctctattcgaacgccagcgagggcggtgccggcatggagcgcgagggcagcatgcacggcttggaagcatcctttgataagatgagcttggagaaggccaggacgcttgacgcagaggacctcgatgacgagggctggcggattgtgagcatggagaatcgaattgtcgagcttggtggcctcggtgagggtgctggaggtgccgtcacgaggtgcaagctcaaaggaggcaagactgtttttgctctcaaggtgatcaccacaaacccggatccggatgtgaagaagcagattctgcgagaaatcaacttcaacaagggctgcgcgtcggaacacatctgcaggtattacggcggtttcctcgagccttctactgccaccatctccattgcaatggagttctgcgagggtgggtcgctcgacagcatttacaaggaggtgaagaggctcggaggccggacgggcgagaaagtcctgggcaagattgccgagggcgtgttgcaaggcctgacctatctcgaagccaagcgcatcctccatcgcgacatcaagccgtccaatatcctcctctgccgcaacggcgaggtcaagctgtgcgacttcggtgtgtctggtgatttcggtaccaagggcgaggccaacaccttcatcggcacaagctactacatggcgccagagcggatcacgggccagacatatactattacttcggacgtctggtctacaggcgtgacgctgctcgaggtggcgcagcaccgcttcccattcccggcagatggcacagagatgcagcctagggccggtctgatcgacctgttgacgtacatcgtccaacagcccattcctaagctgaaggatgagcccgacgcgggcattttctggagtgataacttcaagcatttcatcgaaagctgcctagaaaagaaccccaagcgccgcggtatgccgtggaagatgctcgagcacccatggatgactgagctcaagacgaagcgtgtcaacatgggcaagtacctgtcccaagtatggggctgggacgacgccaaggggtcaaagtga

序列表

<110>南京师范大学

<120>拟茎点霉的原生质体制备方法及基因敲除方法

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>400

<212>dna

<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>1

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<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

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<211>4269

<212>dna

<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

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