一种杏鲍菇原生质体制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种杏鲍菇原生质体制备方法，属于生物工程【技术领域】。是将湿菌体加入蜗牛酶和纤维素酶组成的酶液，35℃-40℃水浴酶解3-5小时。采用本发明方法，原生质体产量最高可达105个·mL-1。本发明为杏鲍菇原生质体融合工作奠定了技术基础，对杏鲍菇高产菌株选育工作具有重要的价值。
【专利说明】 一种杏鲍薛原生质体制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种杏鲍菇原生质体制备方法，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]鲍燕(Pleurotus eryngii)又称刺疗侧耳、雪鸾,是近年来引入我国栽培的一种大型珍稀食用菌，因其在鲜菇时具有淡杏仁味，加工后材质如鲍鱼而得名。杏鲍菇在食用价值和保健价值上比传统菌菇均高出一筹，素有“平菇之王”的美誉。其肉质肥嫩，适合东西方烹调手法，加工后口感脆韧，呈白至奶黄色，外观好，是一种高蛋白、低脂肪的营养食品。此夕卜，杏鲍菇还具有很高的药用和保健价值。杏鲍菇是一种极具开发潜力的优质食用菌，其营养和经济价值在国内、国际市场上被普遍看好，具有很好的发展前景。目前杏鲍菇的研究热点包括优良杏鲍菇菌种的选育和通过原生质体融进行育种。随着原生质体研究的不断深入，原生质体融合技术和紫外诱变等育种手段应用于食用菌的菌株改良或品种选育上。高效的制备原生质体是原生质体融合和紫外诱变等育种手段的前提条件。由于食用真菌的细胞壁的特殊结构，其原生质体制备的难度较大。迄今为止，国内外鲜有关于杏鲍菇育种中原生质体制备的报告。
【发明内容】
[0003]一种杏鲍菇原生质体制备方法，其特征在于，步骤如下:
[0004]I)将蜗牛酶和纤维素酶溶解于稳渗剂，微孔滤膜过滤除菌后作为酶液备用；
[0005]2)用稳渗剂清洗杏鲍菇液体培养基中的菌丝，离心后收集湿菌体；
[0006]3)将湿菌体加入步骤I)制备的酶液，350C _40°C水浴酶解3_5小时。
[0007]步骤I)的酶液中加入了 Y谷氨酰半胱氨酸，Y谷氨酰半胱氨酸含量为
0.1% -0.5%。
[0008]步骤I)中蜗牛酶含量为1% _3%，优选含量为3% ;纤维素酶含量为1%。
[0009]步骤I)的酶液pH为5.5。
[0010]步骤3)中水浴温度为37°C。
[0011 ] 步骤3)中酶解时间为3小时。
[0012]步骤2)和步骤3)中所述稳渗剂为甘露醇、蔗糖、氯化钾、硫酸镁或葡萄糖中任种，优选稳渗剂为甘露醇，含量为6mol.L—1。
[0013]杏鲍菇培养方法先采用PDA固体培养基培养。培养完成后，在超净工作台无菌条件下，用灭菌的接种铲挑取3块边长为0.6mm的菌块于摇瓶种子培养基中，培养基的量为150mL/500mL，将接种好的培养基于25°C，黑暗条件下静置2d，然后移入恒温摇床中培养，温度为25°C、转速140r/min，振荡培养4d。在超净工作台无菌条件下移液枪将摇瓶种子液按10% (v/v)的接种量接入发酵种子培养基中，将接种好的培养基于25°C，黑暗条件下静置2d，然后移入恒温摇床中培养，温度为25°C、转速140r/min，振荡培养4d。
[0014]本发明有益效果:
[0015]采用本发明方法，原生质体产量最高可达15个本发明为杏鲍菇原生质体融合选育工作奠定了技术基础，对杏鲍菇高产菌株选育具有重要的价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1 pH对原生质体产量的影响。
[0017]图2酶解时间对原生质体产量的影响。
[0018]图3温度对原生质体产量的影响。
[0019]图4稳渗剂种类对原生质体产量的影响。
[0020]图5酶浓度对原生质体产量的影响。
[0021]图6菌龄对原生质体产量的影响。
【具体实施方式】
[0022]实施例1:
[0023]取培养4d的菌丝，以6mol.Γ1甘露醇做稳渗剂，用0.1mol.Γ1的HCl和NaOH调节pH为4.0,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,每个pH三个平行，结果如图1所示。
[0024]由图1可知，pH值对原生质体的制备同样有较大的影响。酶的活性对pH值很敏感，从而产生对酶解细胞壁的影响。蜗牛酶最适PH5.8-7.2，纤维素酶最适pH4.0-5.0.参考其他文献实际操作最适PH是4.8。由图1数据可看出:当pH值为5.5时，原生质体的产量相对较高，达2.0X 14个.ml/1，而pH > 5.0或< 6.5，原生质体产量下降。
[0025]实施例2:
[0026]取培养4d的菌丝，以6mol.Γ1甘露醇做稳渗剂，pH5.5，酶解时间分别控制1、2、3和5小时，每个时间三个平行样，镜检计数，结果如图2所示。
[0027]实验得出随着酶解时间的延长，原生质体产量会相应增加。较长的酶解有利于细胞壁的充分溶解，且并不影响原生质体活力。结果如图2所示，酶解3-5小时原生质体产量都可以达到3.5X104个.mL—1，酶解时间为3h，原生质体的产量相对较高，达3.7X 14个.mL'
[0028]实施例3:
[0029]取培养4d的菌丝，以6mol -Γ1甘露做稳渗剂，pH5.5。设置温度25°C、30°C、35°C、37°C、40°C，每个温度三个平行实验。水浴酶解3h，镜检计数。
[0030]酶的活性主要受温度的影响，反应温度过高或是过低会导致原生质体产量下降。而实验采用的酶最适温度都偏高。纤维素酶最适温度40-60°C，而蜗牛酶是37°C。而酶解反应酶是蜗牛酶，纤维素酶只起到辅助作用。在25°C下检测到的原生质体较少，释放不明显，游离的原生质体体积小。在35°C下可以观察到许多游离的原生质体以及裂解的菌丝。从计数的结果来看，37°C效果更佳原生质体的产量相对较高，达4.7X 14个.mL—1，结果见图3。
[0031]实施例4:
[0032]选用6mol -Γ1的甘露醇、蔗糖、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖溶液作为稳渗剂，每种稳渗剂3个平行样，配置成2.0 %的酶液，取培养4d的菌丝体，温度37°C水浴中酶解3h，镜检计数。
[0033]原生质体在低渗溶液中易吸水破裂，所以采用特定的高渗溶液(即渗透压稳定剂)以维持原生质体活性。在平菇原生质体制备的研究中使用6mol.L-1的MgS04、KCl等无机盐作为稳渗剂。选用6mol.L—1不通种类的溶质为稳渗剂进行比较，结果如图4所示，用甘露醇作为稳渗剂，原生质体的产量相对较高达，到5.5X104个.mL'
[0034]实施例5:
[0035]分别用浓度为1.5% (1%蜗牛酶、0.5%纤维素酶)、2.0% (1%蜗牛酶、1%纤维素酶)、4.0% (3%蜗牛酶、1%纤维素酶)和6.0% (5%蜗牛酶、1%纤维素酶)(w/v)的酶液制备原生质体，以0.6mol/L的甘露醇做稳渗剂，调节pH为5.5，取菌龄4d的菌丝，酶解3h，镜检计数。
[0036]本实验采用蜗牛酶与纤维素酶的混酶。在预实验中单独使用一种酶效果都不佳。酶液的浓度与原生质体产量并非正相关。酶液浓度过高会造成原生质体变形，破裂，影响原生质体再生力。酶液浓度过低，则原生质体产量低，达不到后期实验要求。此实验表明酶液浓度4%是效果最好，原生质体的产量为5.7X 14个?mL—1，结果见图5。
[0037]实施例6:
[0038]以6mol ?Γ1甘露醇做稳渗剂，3%蜗牛酶和I %纤维素酶，分别取培养至第2、3、4、5天的菌丝体，在37°C水浴中酶解3h，调节pH为5.5，镜检计数。
[0039]幼嫩的菌丝能够提高原生质体的产量以及再生能力。随着培养时间的增加,菌丝变老，细胞壁加厚，不利于酶解反应的进行。实验结果如图6所示，3-4天是最佳培养时间，其中选用培养时间3天的原生质体的产量最高，达到6.7 X 14个.mL'
[0040]实施例7:
[0041]以6mol.Γ1甘露醇做稳渗剂，3%蜗牛酶和I %纤维素酶，取菌龄3d的菌丝，在37°C水浴中酶解3h，调节pH为5.5，分别在酶液中添加0.1 %、0.3%和0.5%的、谷氨酰半胱氨酸(w/v)，镜检计数。当Y谷氨酰半胱氨酸添加浓度分别为0.1% 0.3%和0.5%时，原生质体的产量分别为8.1 X 14个id O X 15个iL-1和1.1 X 15个.πι?Λ相对于不添加Y谷氨酰半胱氨酸的条件，原生质体的产量有不同程度提高。
【权利要求】
1.一种杏鲍菇原生质体制备方法，其特征在于，步骤如下: 1)将蜗牛酶和纤维素酶溶解于稳渗剂，微孔滤膜过滤除菌后作为酶液备用； 2)用稳渗剂清洗杏鲍菇液体培养基中的菌丝，离心后收集湿菌体； 3)将湿菌体加入步骤I)制备的酶液，35°C_40°C水浴酶解3-5小时。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤I)的酶液中加入0.1%-0.5%的Y谷氨酰半胱氨酸。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述蜗牛酶含量为1%_3%，所述纤维素酶含量为1%。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述蜗牛酶含量为3%。
5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤I)的酶液pH为5.5。
6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，水浴温度为37°C。
7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，酶解时间为3小时。
8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述稳渗剂为甘露醇、蔗糖、氯化钾、硫酸镁或葡萄糖。
9.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述稳渗剂为甘露醇，含量为6mol.L—1。
【文档编号】C12R1/645GK104388321SQ201410706591
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】肖建中, 张东旭 申请人:丽水学院