本发明涉及微生物
技术领域：
，具体涉及一种提高白腐真菌产酶酶活的方法。
背景技术：
：2017年，我国农业生产中各类秸秆年产量约为10亿吨，这些农业废弃物中蕴含着丰富的可再生资源。充分利用这些秸秆生产饲料、肥料以及生物能源(乙醇、沼气等)是目前秸秆木质纤维素定向生物转化利用的研究热点。木质纤维素主要成分为纤维素、半纤维素和木质素。制约秸秆高值化综合利用的主要瓶颈是木质纤维素的有效降解。到目前为止，木质素降解方法主要包括物理法、化学法、物理化学法以及生物降解法。其中，生物降解作为绿色环保的木质素处理方法而成为研究热点。生物降解主要有微生物降解法和酶降解法。但是微生物降解方法存在时间长(一般需要21-60天)以及生长条件要求苛刻(无菌，排除外界杂菌的干扰)的问题，因此限制了其在实际生产中的商业化应用。因此，研究人员将重点转移到酶降解上。因此，提高微生物纤维素、半纤维素和木质素降解酶活性成为研究重点。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高白腐真菌产酶酶活的方法，使得所述方法能够同时提高白腐真菌生产的纤维素酶和半纤维素酶的酶活；本发明的另外一个目的在于提供一种提高白腐真菌产酶酶活的方法，使得所述方法能够同时提高白腐真菌生产的纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶的酶活；为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种提高白腐真菌产酶酶活的方法，将白腐真菌接种到发酵培养基中，采用蓝光照射进行发酵。白腐真菌常规发酵产酶是在黑暗环境中，但是存在酶活较低的问题。针对该问题，本发明采用蓝光照射的方法诱导白腐真菌发酵产酶，提高了所产纤维素酶和半纤维素酶的酶活。作为优选，所述白腐真菌为杏鲍菇、平菇、黄孢原毛平革菌以及白囊耙齿菌中的一种或两种以上。其中，杏鲍菇、平菇、黄孢原毛平革菌、白囊耙齿菌均可通过cicc或中国普通微生物菌种保藏管理中心处获得，作为优选，所述蓝光为440-470nm蓝光，强度为50-100μmolm-2s-1，在本发明具体实施方式中选择455nm蓝光，强度为80μmolm-2s-1。作为优选，所述发酵的温度为25-30℃；在具体实施过程中可以选择为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃，也可在25-30℃范围内波动。在本发明具体实施方式中，分别以杏鲍菇、平菇、黄孢原毛平革菌以及白囊耙齿菌四种代表性的不同白腐真菌在黑暗和蓝光环境下发酵，结果显示，蓝光照射下的白腐真菌所产纤维素酶和半纤维素酶的酶活得到明显提升；同时，本发明采用了产纤维素酶和半纤维素酶的哈茨木霉再次验证蓝光照射效果的专属性，结果显示哈茨木霉所产纤维素酶和半纤维素酶的酶活并未得到显著提升，黑暗环境和蓝光照射的酶活几乎一致，这表明蓝光照射的措施并不适合所有微生物菌。此外，本发明就发酵过程中使用的发酵培养基提供了优选方案，即所述发酵培养基为含有苎麻秸秆的发酵培养基；进一步优选地，所述发酵培养基包括葡萄糖、苎麻秸秆、(nh4)2so4、尿素、蛋白胨、kh2po4、cacl2、mgso4、feso4、mnso4、znso4、cocl2、tween和水；更优选地，所述发酵培养基为：葡萄糖0.5-2g/l、苎麻秸秆15-60g/l、(nh4)2so41.1-4.4g/l、尿素0.25-1g/l、蛋白胨0.5-2g/l、kh2po41-4g/l、cacl20.15-0.6g/l、mgso40.04-0.16g/l、feso40.0025-0.01g/l、mnso40.0008-0.0032g/l、znso40.0007-0.0028g/l、cocl20.00185-0.0074g/l、tween1-4滴/l，余量水。在具体实施过程中，可任意选择如下发酵培养基：(1)葡萄糖0.5g/l、苎麻秸秆60g/l、(nh4)2so41.1g/l、尿素1g/l、蛋白胨0.5g/l、kh2po44g/l、cacl20.15g/l、mgso40.16g/l、feso40.0025g/l、mnso40.0032g/l、znso40.0007g/l、cocl20.0074g/l、tween1滴/l，余量水；(2)葡萄糖1g/l、苎麻秸秆30g/l、(nh4)2so42.2g/l、尿素0.5g/l、蛋白胨1g/l、kh2po42g/l、cacl20.3g/l、mgso40.08g/l、feso40.005g/l、mnso40.0016g/l、znso40.0014g/l、cocl20.0037g/l、tween2滴/l，余量水；(3)葡萄糖2g/l、苎麻秸秆15g/l、(nh4)2so44.4g/l、尿素0.25g/l、蛋白胨2g/l、kh2po41g/l、cacl20.6g/l、mgso40.04g/l、feso40.01g/l、mnso40.0008g/l、znso40.0028g/l、cocl20.00185g/l、tween4滴/l，余量水；(4)葡萄糖1.5g/l、苎麻秸秆45g/l、(nh4)2so43g/l、尿素0.5g/l、蛋白胨1.5g/l、kh2po43g/l、cacl20.2g/l、mgso40.1g/l、feso40.006g/l、mnso40.0025g/l、znso40.001g/l、cocl20.0025g/l、tween3滴/l，余量水。在本发明提供的优选发酵培养基上，在常规黑色环境下发酵产酶，所获得的各酶酶活明显要高于现有专利中的常规发酵培养基，再配合蓝光照射，可以获得更佳的提高效果。此外，本发明所述方法还包括在发酵培养基中加入铜离子或锰离子或两者的组合，由此在前述技术效果基础上还可以明显提高木质素降解酶的酶活；其中，所述铜离子的终浓度为0.1mm-0.5mm，所述锰离子的终浓度为0.1mm-0.5mm；在本发明具体实施方式中，所述铜离子的终浓度为0.2mm，所述锰离子的终浓度为0.2mm。其中，铜离子可以通过添加cuso4来实现，锰离子通过添加mnso4来实现。根据上述各方面的技术效果，本发明还提出了蓝光照射或者蓝光照射联合加入铜离子或锰离子或两者组合的发酵培养基在白腐真菌发酵产酶中的应用。由以上技术方案可知，本发明以蓝光照射替换传统的黑暗环境对白腐真菌进行产酶发酵，能够明显提高所产纤维素酶和半纤维素酶的酶活；此外配合在发酵培养基中添加铜离子和/或锰离子还可同时提高所产木质素降解酶的酶活。具体实施方式本发明公开了一种提高白腐真菌产酶酶活的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。在白腐真菌接种发酵培养基之前，一般会先接种至种子培养基活化，制成种子液接种，例如可以采用pda培养基加葡萄糖作为种子培养基，如下：配置pda培养基(取去皮马铃薯200g，切成小块，加1000ml水煮沸20min。滤去马铃薯块，并将滤液补足至1000ml。添加葡萄糖20g，溶化后分装，115℃，灭菌30min)，接种白腐真菌斜面菌种(20-30mm2每块，接种2-3块，150-170r/min，25-30℃摇床上培养1-2天。本发明还提供了一种种子培养基，即葡萄糖0.5-2g/l、玉米粉15-60g/l、(nh4)2so41.1-4.4g/l、尿素0.25-1g/l、蛋白胨0.5-2g/l、kh2po41-4g/l、cacl20.15-0.6g/l、mgso40.04-0.16g/l、feso40.0025-0.01g/l、mnso40.0008-0.0032g/l、znso40.0007-0.0028g/l、cocl20.00185-0.0074g/l、tween1-4滴/l，余量水；然后接种白腐真菌斜面菌种(20-30mm2每块，接种2-3块，150-170r/min，25-30℃摇床上培养1-2天。将所制备的种子液以10-20％的接种量接种至发酵培养基发酵产酶。在本发明各项对比试验中，各组除去应有的差别外，其余试验环境和材料保持一致。本发明酶活测定方法采用如下三种方法检测纤维素酶、半纤维素酶以及木质素降解酶的酶活：(1)cmc纤维素酶活测定法将cmc至于ph5.0柠檬酸柠檬酸钠缓冲液中，配制成0.5％(w/v)反应底物溶液。取0.5ml粗酶液加入1.5ml底物混匀后于50℃反应1h。反应结束后添加3mldns溶液混匀后沸水浴15min，显色反应结束后测其吸光值。cmc酶活定义为每1min从底物中释放出1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位。(2)木聚糖酶活力测定法取1ml经稀释的酶液，加入5ml缓冲溶液，沸煮10min(灭活木聚糖酶)后加入底物木聚糖溶液。处理一定时间后，加入dns显色8min,得到参比液。另取木聚糖溶液1ml于刻度试管中，加入不同ph值的缓冲溶液5ml，在一定温度的水浴中平衡5min。加入稀释后的木聚糖酶溶液1ml，摇匀并开始计时。酶处理一段时间后，迅速加入dns试剂5ml，并将刻度试管放入沸水浴中显色8min，冷却，定容至25ml。以参比液为空白，采用分光光度计在540nm下测定溶液吸光度。如果吸光度过大,可以进行适当稀释后测试。1ml酶在一定温度和ph值条件下，1h分解木聚糖产生1mgd(+)-木糖，视为一个酶活力单位u。c＝(a-n)/m；u＝(c×0.025l)/(t×1ml)；式中：c-生成木糖的质量浓度(mg/l)；a-溶液吸光度；u-木聚糖酶酶活；0.025l-显色后定容体积；t-酶反应时间(h)；1ml-木聚糖酶体积；(3)漆酶活性测定法：利用lac氧化abts，用可见-紫外分光光度计测定420nm处0-3min内吸光度值，随时间的变化，从而得知酶反应速率，进而推算酶活。用等体积0.5mmol/l2,2-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(abts)溶液和酶液反应，测定反应前3min内420nm处吸光值的增加，每分钟使1umolabts转化所需的酶量为1个活力单位(u)。酶活测定所需试剂：0.5mmol/labts；0.2mol/l醋酸-醋酸钠缓冲溶液(ph＝5.0)以及一定量的粗酶液；酶活测定步骤：空白样(4ml):2ml0.2mol/l缓冲液-0.4mlabts-1.6ml去离子水；样品(4ml):2ml0.2mol/l缓冲液-0.4mlabts-1.2ml去离子水-0.4ml酶液用紫外分光光度计检测420nm处吸收值变化，30秒间隔读数，记录210秒内吸收值变化。酶活计算公式为以下就本发明所提供的一种提高白腐真菌产酶酶活的方法做进一步说明。实施例1：本发明所述方法(同时提高纤维素酶和半纤维素酶酶活)制备白腐真菌(杏鲍菇、平菇、黄孢原毛平革菌或白囊耙齿菌)种子液，按照10％、15％或20％的接种量接种至发酵培养基中，培养温度为25-30℃，置于455nm、80μmolm-2s-1蓝光下发酵产酶。发酵培养基：葡萄糖1g/l、苎麻秸秆30g/l、(nh4)2so42.2g/l、尿素0.5g/l、蛋白胨1g/l、kh2po42g/l、cacl20.3g/l、mgso40.08g/l、feso40.005g/l、mnso40.0016g/l、znso40.0014g/l、cocl20.0037g/l、tween2滴/l，余量水；实施例2：蓝光和黑暗环境的酶活对比试验按照实施例1的方法，分别接种杏鲍菇、平菇、黄孢原毛平革菌以及白囊耙齿菌种子液，置于蓝光或者黑暗下培养7-28天，定期对纤维素酶、半纤维素酶以及木质素降解酶活性进行检测，种子液的制备方法、接种量、发酵培养温度均保持一致，结果见表1和表2；表1表2由表1和表2可以明显看出，在蓝光环境下，各白腐真菌的纤维素酶以及半纤维素酶酶活均得到明显提高。此外，本发明还改变蓝光波长和强度进行上述实验，结果显示，各白腐真菌的纤维素酶以及半纤维素酶酶活均得到明显提高，相对于黑暗环境的提高程度与表1和表2结果一致，各组蓝光波长和强度如下：440nm、50μmolm-2s-1蓝光；460nm、70μmolm-2s-1蓝光；470nm、100μmolm-2s-1蓝光。实施例3：哈茨木霉蓝光和黑暗环境下的酶活对比试验完全参照实施例2的试验方法和试验环境，区别仅在于菌种变更为哈茨木霉，发酵培养时间为7天，统计纤维素酶酶活，结果见表3；表3纤维素酶酶活(cmc纤维素酶活测定法)(iu/ml)黑暗1.023蓝光0.963由表3可以看出，无论在黑暗环境还是蓝光环境，哈茨木霉的纤维素酶酶活没有明显提高，两者基本一致，表明并非所有产酶微生物均能够在蓝光环境下提高纤维素酶酶活。实施例4：本发明所述方法(同时提高纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶酶活)及效果验证1、方法在实施例1方法基础上向发酵培养基中添加cuso4至铜离子终浓度为0.1mm-0.5mm或添加mnso4至锰离子终浓度为0.1mm-0.5mm来实现添加铜离子或锰离子的目的。2、对比试验在黑暗、蓝光、黑暗+锰离子(终浓度0.2mm)、蓝光+锰离子(终浓度0.2mm)、黑暗+铜离子(终浓度0.2mm)以及蓝光+锰离子(终浓度0.2mm)各种组合情形下进行白腐真菌产木质素降解酶的酶活测定，结果见表4。表4由表4可以看出，无论在黑暗环境下还是蓝光环境下，在发酵培养基中增加锰离子或铜离子均可以明显提高木质素降解酶的酶活，其中以在蓝光环境下的酶活最优。此外，本发明更换氯化铜和氯化锰并分别调整终浓度为0.1mm和0.5mm重复上述实验，结果以上述表4结果相一致。实施例5：不同发酵培养基在常规黑暗环境下的酶活对比试验试验对象：(1)葡萄糖0.5g/l、苎麻秸秆60g/l、(nh4)2so41.1g/l、尿素1g/l、蛋白胨0.5g/l、kh2po44g/l、cacl20.15g/l、mgso40.16g/l、feso40.0025g/l、mnso40.0032g/l、znso40.0007g/l、cocl20.0074g/l、tween1滴/l，余量水；(2)葡萄糖1g/l、苎麻秸秆30g/l、(nh4)2so42.2g/l、尿素0.5g/l、蛋白胨1g/l、kh2po42g/l、cacl20.3g/l、mgso40.08g/l、feso40.005g/l、mnso40.0016g/l、znso40.0014g/l、cocl20.0037g/l、tween2滴/l，余量水；(3)葡萄糖2g/l、苎麻秸秆15g/l、(nh4)2so44.4g/l、尿素0.25g/l、蛋白胨2g/l、kh2po41g/l、cacl20.6g/l、mgso40.04g/l、feso40.01g/l、mnso40.0008g/l、znso40.0028g/l、cocl20.00185g/l、tween4滴/l，余量水；(4)葡萄糖1.5g/l、苎麻秸秆45g/l、(nh4)2so43g/l、尿素0.5g/l、蛋白胨1.5g/l、kh2po43g/l、cacl20.2g/l、mgso40.1g/l、feso40.006g/l、mnso40.0025g/l、znso40.001g/l、cocl20.0025g/l、tween3滴/l，余量水。(5)现有专利cn104419692a中培养基：葡萄糖4.5g/l，微晶纤维素30g/l，玉米浆25g/l，kh2po42g/l，(nh4)2so41.4g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，cacl20.45g/l，feso4·7h2o5mg/l，mnso4·h2o1.6mg/l，znso4·7h2o1.4mg/l，cocl2·6h2o0.37mg/l，调节ph值为4.5。上述5种发酵培养基采用相同的白腐真菌种子液，在相同的接种量和发酵培养温度下，置于黑暗环境发酵培养，检测纤维素酶、半纤维素酶以及木质素降解酶的酶活，结果见以下各表；其中表5-表8依次为发酵培养基(1)、(3)、(4)、(5)的结果，发酵培养基(2)的结果参照表1-2和表4中对应结果；表5表6表7表8对比各表结果可以明显看出，采用本发明发酵培养基，在常规黑暗环境下能够明显提高纤维素酶、半纤维素酶以及木质素降解酶的酶活，而现有专利的培养基的效果较差。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12