一种长喙壳菌原生质体的制备方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种真菌原生质体的制备方法，具体涉及一种长喙壳菌原生质体的制备方法。

背景技术：

长喙壳菌属子囊菌门，核菌纲，球壳目，长喙壳科，是一种危害严重的病原真菌，遍布于世界6大洲，41个国家，可侵染14个属30余种木本及草本植物。我国对长喙壳菌侵染引起甘薯黑斑病的报道可追溯至1956年。近年来，陆续有该菌危害石榴、桉树、芋头、枇杷、天南星、芒果等作物的报道。该类真菌在危害甘薯、芋头等草本植物主要引起黑斑、腐烂等病害症状；危害石榴、芒果等木本植物主要引起植株的木质部褐变、溃疡、植株枯萎、死亡等现象，是一种严重的维管束病害，生产上称之为“癌症病害”。2003年该菌引起我国云南蒙自万亩石榴园爆发石榴枯萎病，对当地石榴种植业造成毁灭性灾害。

目前对该类真菌的研究多集中于传统生物学方面，鲜有其分子机制方面的研究，检索国内外相关文献未见其原生质体制备方法相关报道。然而利用原生质体进行分子转化技术已成为真菌致病机制研究的基础，制备高质量的原生质体是原生质体分子转化技术的必备条件。但由于真菌细胞结构及组分的不同，不同真菌制备原生质体适宜的体系及条件存在较大差异。因而为进一步研究该类真菌的分子转化技术，更好地解析其致病机制，迫切需要建立一种高效的长喙壳菌原生质体的制备方法。

技术实现要素：

为此，本发明的目的是提供一种高效的、简便的长喙壳菌原生质体的制备方法。

为此，本发明的技术方案如下：

一种长喙壳菌原生质体的制备方法，包括步骤如下：

1)菌株活化培养：将保存的长喙壳菌接种至myea平板培养基中进行活化培养；

2)菌丝体制备及收集：在菌落边缘取菌丝块，接入液体培养基中进行摇床培养，用滤膜过滤收集菌丝；

3)酶解及原生质体收集：将收集的菌丝体用酶解液酶解，酶解后用渗透压稳定剂洗涤，离心去除酶解液，再用stc溶液洗涤，离心收集，得到原生质体；

其中所述酶解液为含有25-30mg/ml崩溃酶和20-25mg/ml裂解酶的0.5mmgso4溶液。

上述方法中，所述活化培养的条件为：23-28℃条件下培养5-14天。

上述方法中，所述myea平板培养基的组成为：麦芽提取物20g/l、酵母2g/l、琼脂16g/l和氯霉素100mg/l。

上述方法中，所述取菌丝块的方法为：用打孔器在菌落边缘取3-5mm菌丝块7-8个。

上述方法中，所述液体培养基为cm培养基，其组分为：硫酸铵1.32g/l、麦芽提取物5g/l、酵母5g/l。

上述方法中，所述酶解的条件为：在温度为25-30℃、100-150rpm/min下溶解4-6h。

上述方法中，所述渗透压稳定剂为0.6mkcl溶液；

上述方法中，所述离心的条件为2-6℃、4000rpm离心15-20min。

上述方法中，所述stc溶液为：含有山梨醇和氯化钙的25mmtris-hcl溶液，其ph值为7.5，其中山梨醇的浓度为1.0m，氯化钙的浓度为50mm。

上述方法中，优选的，所述裂解酶为自哈茨木霉的裂解酶。

上述方法中，所述摇床培养的条件为：在温度为25-30℃、100-150rpm/min下培养36-60h。

本发明有益效果为：

本发明的长喙壳菌原生质体的制备方法，工艺简单，对设备要求低，易于操作，利用本发明方法进行生产原生质体产量可达5.0-7.0×10⁷个/ml，效率高，制备的原生质体质量好。

附图说明

图1为实施例制备的长喙壳菌原生质体在光学显微镜下的形态。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或成分比例上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围内。本发明中所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。

实施例1长喙壳菌的原生质体制备方法

本实施例中的myea平板培养基组成为：麦芽提取物20g/l、酵母2g/l、琼脂16g/l和100mg/l氯霉素。

本实施例中的液体cm培养基的组分为：硫酸铵1.32g/l、麦芽提取物5g/l和酵母5g/l。

本实施例中的酶解液为含有25mg/ml崩溃酶和20mg/ml裂解酶的0.5mmgso4溶液，其中裂解酶为哈茨木霉的裂解酶(sigmal1412)。

本实施例中的stc溶液为：含有山梨醇和氯化钙的25mmtris-hcl溶液，其ph值为7.5，其中山梨醇的浓度为1.0m，氯化钙的浓度为50mm。

制备过程如下：

1)菌株活化培养：将保存的长喙壳菌株(ceratocystisfimbriata)重新活化至myea平板，在25℃条件下培养7天；

2)菌丝体制备及收集：用打孔器取长喙壳菌株(菌株编号mg-1-10)菌落边缘生长新鲜的5mm菌丝块8个，加入装有200mlcm液体培养基的500ml锥形瓶中，在25℃条件下120rpm/min摇床培养48h，用包好一层miracloth滤膜的200ml烧杯过滤收集菌丝；

3)酶解及原生质体收集：将收集好的菌丝体用4℃预冷的0.5mmgso4溶液冲洗后转至50ml无菌管中，加入10ml已过滤灭菌的酶解液，在25℃、120rpm/min下酶解5h，用0.6mkcl溶液洗涤两次，4℃、4000rpm离心15min去除酶解液，再用stc溶液洗涤一次，4℃、4000rpm离心20min收集原生质体，血球计数板计数，加入4mlstc溶液重悬原生质体，浓度为6.5×10⁷个/ml。

将所获得的原生质体在光学显微镜下观察，其形态如图1所示。所获得原生质体为球形，结构完整，大小均一，且该次制备的原生质体破裂的细胞较少，浓度适宜。

实施例2长喙壳菌的原生质体制备方法

本实施例中的myea平板培养基和液体cm培养基组分以及stc溶液和实施例1相同。

本实施例中的酶解液为含有30mg/ml崩溃酶和22mg/ml裂解酶的0.5mmgso4溶液，其中裂解酶为哈茨木霉的裂解酶(sigmal1412)。

制备过程如下：

1)菌株活化培养：将保存的长喙壳菌株(ceratocystisfimbriata)重新活化至myea平板，在25℃条件下培养9天；

2)菌丝体制备及收集：用打孔器取长喙壳菌株(菌株编号mg-1-10)菌落边缘生长新鲜的5mm菌丝块7个，加入装有200mlcm液体培养基的500ml锥形瓶中，在28℃条件下100rpm/min摇床培养60h，用包好一层miracloth滤膜的200ml烧杯过滤收集菌丝；

3)酶解及原生质体收集：将收集好的菌丝体用4℃预冷的0.5mmgso4溶液冲洗后转至50ml无菌管中，加入10ml已过滤灭菌的酶解液，在28℃、100rpm/min下酶解6h，用0.6mkcl溶液洗涤两次，4℃、4000rpm离心20min去除酶解液，再用stc溶液洗涤一次，4℃、4000rpm离心20min收集原生质体，血球计数板计数，加入4mlstc溶液重悬原生质体，浓度为5.0×10⁷个/ml。

实施例3长喙壳菌的原生质体制备方法

本实施例中的myea平板培养基和液体cm培养基组分和实施例1相同。

本实施例中的酶解液为含有27mg/ml崩溃酶和25mg/ml裂解酶的0.5mmgso4溶液，其中裂解酶为哈茨木霉的裂解酶(sigmal1412)。

制备过程如下：

1)菌株活化培养：将保存的长喙壳菌株(ceratocystisfimbriata)重新活化至myea平板，在23℃条件下培养10天；

2)菌丝体制备及收集：用打孔器取长喙壳菌株(菌株编号mg-1-10)菌落边缘生长新鲜的3mm菌丝块7个，加入装有200mlcm液体培养基的500ml锥形瓶中，在30℃条件下100rpm/min摇床培养36h，用包好一层miracloth滤膜的200ml烧杯过滤收集菌丝；

3)酶解及原生质体收集：将收集好的菌丝体用4℃预冷的0.5mmgso4溶液冲洗后转至50ml无菌管中，加入10ml已过滤灭菌的酶解液，在30℃、100rpm/min下酶解4h，用0.6mkcl溶液洗涤两次，4℃、4000rpm离心20min去除酶解液，再用stc溶液洗涤一次，4℃、4000rpm离心20min收集原生质体，血球计数板计数，加入4mlstc溶液重悬原生质体，浓度为5.7×10⁷个/ml。