特异性结合诺如病毒GI.1基因型VP1蛋白和/或VLP的抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种特异性结合诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp的抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

诺如病毒是一种全球范围内重要的食源性病毒，可感染人和动物，引起急性胃肠炎。无论是在发达国家还是发展中国家，诺如病毒流行性感染涉及到各个年龄段人群，并可造成暴发性流行，已成为影响人类日常健康的不可忽视的问题。1995年我国报道了首例诺如病毒感染，20多年来，全国各地相继暴发多起群体及散发诺如病毒感染性腹泻，尤其是在幼儿园、学校、军队、医院等半封闭环境的暴发性感染，引起一定的社会恐慌。诺如病毒主要来源于海产品，常见于牡蛎等贝类中。可经食源性途径、水源性途径及人-人直接接触(粪口途径或呕吐物的气溶胶)传播；病毒粒子具有高度传染性，约18到100个病毒粒子就可以让人感染，病毒易在小范围内迅速传播，在半封闭和人口集中场所中常出现聚集性感染及群体暴发。目前市场上没有特异性抗nov的药物及预防和治疗性疫苗，抗生素对该病毒感染引起的腹泻几乎没有作用。

诺如病毒属于人类杯状病毒科，诺如病毒属，是一组无包膜单链rna病毒，病毒颗粒呈二十面体对称结构，直径约为26～35nm。病毒基因组全长约7.7kb，包含3个开放阅读框(openreadingframes，orfs)。orf1长约5kb，编码一个多聚蛋白(蛋白前体)，病毒复制过程中经过蛋白酶解后可形成6个病毒复制所必需的非结构蛋白，包括n末端蛋白、ntpase(核苷磷酸酶)、p22(3a样蛋白)、vpg(与病毒基因组共价结合)，pro(3c样蛋白酶)、rna依赖的rna聚合酶等；orf2和orf3编码结构蛋白，orf2长约1.8kb，编码57kd的主要结构蛋白vp1，vp1蛋白可在体外包装成vlps；orf3长约0.6kb，编码22kd的次要结构蛋白vp2，vp2的功能可能与基因组包装成病毒体有关。

诺如病毒的衣壳由90个vp1二聚体组成，180个vp1构成了t＝3的二十面体对称结构。vp1蛋白结构上可分为s区和p区两个相邻的区域，两者通过灵活的铰链相连。s区形成内壳，构成vp1的底座，无法与受体结合；p区二聚体结构突出于内壳外，包含受体结合区域，决定nov的抗原性。p区可进一步分为p1和p2两个亚区，后者位于vp1的最外层，高度变异，目前认为是免疫识别和受体结合的关键部位。诺如病毒的基因和抗原性呈高度多样性，根据完整vp1序列的差异，可分为7个基因组，gⅰ～gⅶ，每个基因组可进一步划分为基因型。共有30个以上基因型可以感染人类，主要包含gⅰ和gⅱ基因组，人类诺如病毒感染中，gi.1和gii.4型占据主导地位，占世界范围内流行nov的70～80％。

诺如病毒不能够体外培养，也没有适合的动物模型，因此，目前没有准确的方法评价诺如病毒疫苗免疫后血清中的中和抗体水平。病毒受体是公认的病毒感染宿主细胞的起始步骤和关键因素之一。受体对于宿主非常关键，且感染性病原体往往为了适应不同的受体表型选择性进化。2002年hutson等首次提出诺瓦克病毒感染与abo血型抗原有联系的假说。此后诺如病毒的受体定位一直是国际上的研究热点，经过几年的研究目前己确认肠道黏膜上的人类组织血型抗原(humanhisto-bloodgroupantigens，hbgas)是nov的病毒受体或协同作用物，这一发现成为诺如病毒研究的里程碑。hbgas是红细胞、呼吸道、泌尿生殖和消化道粘膜上皮细胞表面的一类具有高度多态性的糖类抗原，在肠道上皮细胞上表现为abo、分泌型及lewis。hbga在细胞表面的表达受abo血型控制，由于单体糖之间的连接方式不同而具有多样性，包括a、b、htype1，htype2，lewisy，lewisx，和leb等型别。

目前对诺如病毒感染、致病机制、病毒与宿主相互作用、靶细胞受体等机理性研究相对较少，而传统的减毒疫苗和灭活疫苗的发展受到限制，另一方面，由于诺如病毒基因型别的复杂和快速变异性使疫苗研发进程缓慢，迄今为止，尚无相关疫苗上市，而基于基因工程的亚单位疫苗是诺如病毒疫苗主要的研究策略。日本武田(takeda)公司通过昆虫细胞/杆状病毒表达系统研制的重组novvlps疫苗已开展ii期临床研究，美国vaxart公司研制的口服诺如病毒疫苗以非复制型的腺病毒为载体，已开展ⅰ期临床研究。

研究发现，具有中和能力的单抗基本都识别构象表位，并且大多数识别型特异性构象表位的单克隆抗体都具有中和能力。不同中和单抗通过封闭病毒与细胞受体的结合位点，可阻止病毒感染入胞的发生，对这些单抗结合表位的研究有利于解释病毒感染入胞的关键位点。对疫苗诱发产生的中和抗体活性的测定是检测预防性疫苗免疫保护性的重要标准。中和活性抗体在诺如病毒疫苗的免疫原性检测和含量测定中具有重要的应用前景。

由于目前还未出现针对诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白的更有效的特异性抗体，因此寻找这样一种抗体，并将其应用于诺如病毒gi.1基因型感染的诊断、检测中十分必要。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是针对现有技术中缺乏更好、更有效的抗诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白的特异性抗体，提供了一种特异性结合诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp的抗体及其制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

一种特异性结合诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp的抗体，包含有seqidno.1-3所示的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区域和/或seqidno.4-6所示的轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区域。

本发明的另一个方面是提供一种特异性结合诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp的抗体，包含有如seqidno.10所示的重链可变区氨基酸序列和/或如seqidno.11所示的轻链可变区氨基酸序列。

本发明的另一个方面是提供一种特异性结合诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp的抗原结合部分，包含有seqidno.1-3所示的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区域和/或seqidno.4-6所示的轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区域；

其中，所述抗原结合部分选自fab、fab'、f(ab')2、fd、dab、互补决定区片段、单链抗体，人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。

所述特异性结合诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp的抗原结合部分可使用本领域技术人员公知的方法获得，如利用化学试剂处理的方法，或利用蛋白酶消化的方法，如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等。

在本发明中，与上述cdr氨基酸序列具有90％以上同源性(优选为95％以上)的序列，也视为包含在本发明的保护范围之内。同样的，上述cdr氨基酸序列的其他变异形式，例如，一个或多个氨基酸的缺失、插入和/或取代，在c末端和/或n末端增加一个或多个氨基酸等，只要其不改变上述cdr氨基酸序列的生物学功能，都视为包含在本发明的保护范围之内。

本发明所述抗体可以为多克隆抗体，也可以为单克隆抗体。但作为优选，在本发明的一个实施方式中，本发明所述抗体为单克隆抗体。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述抗体是由保藏编号为cgmccno.15693的细胞产生的单克隆抗体。所述细胞是由免疫后的宿主脾细胞和骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，其被保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.15693，保藏日期为2018年04月27日。

本发明中所述抗体为型别特异性抗体，仅能特异性的结合诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp，而对gii.4基因型无交叉反应。

在本发明中，所述抗体具有中和活性，能够阻断vlps与hbga的结合。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述抗体是单价或二价抗体。

在本发明中，可以采用kohler等在nature256:495(1975)中报道的杂交瘤制备方法来制备所述单克隆抗体。首先用免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。在本发明中，所述免疫原是汉逊酵母细胞表达产生的经过层析纯化后得到的诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或该诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白在体外自动组装形成的病毒样颗粒(vlp)。其抗原的氨基酸序列如seqidno.16所示。

免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。佐剂可以利用弗氏佐剂(弗氏完全性佐剂或者弗氏不完全性佐剂)或mpl-tdm等。动物在接受免疫后，体内会产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂(如peg4000)将其与骨髓瘤细胞融合，从而获得杂交瘤细胞(goding，monoclonalantibodies：principlesandpractice，pp.59-103，academicpress，1996)。

将上述制备的杂交瘤细胞接种到合适的培养基中进行生长，所述培养基中含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(hgprt或hprt)的母体骨髓瘤细胞，在培养基中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(hat培养基)等物质将可以抑制hgprt-缺陷细胞的生长。

优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对hat培养基敏感等能力。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如mop-21和mc-11小鼠肿瘤衍生株(thesalkinstitutecelldistributioncenter，sandiego，calif.usa)，以及sp-2/0或x63-ag8-653细胞株(americantypecμlturecollection，rockville，md.usa)。另外，还可以利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(kozbor，j.immunol.，133:3001(1984)；brodeuretal.，monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications，pp.51-63，marceldekker，inc.，newyork，1987)。

杂交瘤细胞生长的培养基用于检测针对特异抗原的单抗的产生。可以使用下列方法来测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性：免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(ria)、酶联免疫吸附试验(elisa)。例如，利用munson等在anal.biochem.107:220(1980)中描述的scatchard分析法可测定单抗的亲和力。

在确定杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可以通过goding，monoclonalantibodies：principlesandpractice，pp.59-103，academicpress，1996描述的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养基可以是dmem或rpmi-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。

利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白a琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来，进而得到所述单克隆抗体。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述得到的单克隆抗体的编号为401。

本发明的另一个方面是提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述重链可变区氨基酸序列或轻链可变区氨基酸序列。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，编码上述重链可变区氨基酸序列的多核苷酸序列如seqidno.12所示，编码上述轻链可变区氨基酸序列的多核苷酸序列如seqidno.13所示。

本发明的另一个方面是提供一种载体，所述载体包含上述多核苷酸。

本发明的另一个方面是提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明的特异性结合诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp的抗体或其抗原结合部分。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒还包含与诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp特异性结合的第二抗体。

在上述试剂盒中，所述第二抗体可以为有技术中已知的任意抗gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp的抗体，从而利用双夹心法对样品进行检测。

更优选地，上述第二抗体包含有seqidno.7-9所示的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区域。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述第二抗体包含有如seqidno.14所示的重链可变区氨基酸序列。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述第二抗体包含由seqidno.15所示的重链可变区核苷酸序列编码的氨基酸序列。

更优选地，所述第二抗体是由保藏编号为cgmccno.15694的细胞产生的单克隆抗体，其被保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏日期为2018年04月27日。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述得到二抗的单克隆抗体的编号为101。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述第二抗体采用与本发明所述特异性结合诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp的抗体相同的方法制备。

本发明的另一个方面是提供上述抗体、抗原结合部分、多核苷酸、载体或试剂盒在检测样品中诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp的存在或者水平中的用途。

本发明的有益效果为：

本发明提供的特异性结合诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp的抗体或抗原结合部分与gii.4基因型别无交叉反应，特异性高，具有阻断诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp与hbga结合的特性，且亲和性高。可用于检测样品中诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp的存在或水平试剂盒的研发，以及针对患者的治疗和对易感人群进行被动免疫，具有良好的应用前景。

生物保藏信息：

保藏编号：cgmccno.15693

保藏日期：2018年04月27日

保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

保藏编号：cgmccno.15694

保藏日期：2018年04月27日

保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

附图说明

图1为本发明实施例1中制备的抗原诺如病毒gi.1基因型vp1-vlp的电镜观察结果。

序列说明

seqidno.1-3为本发明抗体或抗原结合部分的重链可变区cdr1-3的氨基酸序列；

seqidno.4-6为本发明抗体或抗原结合部分的轻链可变区cdr1-3的氨基酸序列；

seqidno.7-9为本发明第二抗体的重链可变区cdr1-3的氨基酸序列；

seqidno.10为本发明抗体的重链可变区氨基酸序列；

seqidno.11为本发明抗体的轻链可变区氨基酸序列；

seqidno.12为本发明抗体的重链可变区核苷酸序列；

seqidno.13为本发明抗体的轻链可变区核苷酸序列；

seqidno.14为本发明第二抗体的重链可变区氨基酸序列；

seqidno.15为本发明第二抗体的重链可变区核苷酸序列；

seqidno.16为抗原诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明公开了一种特异性结合诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp的抗体及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

本发明中使用的术语“抗体”，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(l)链和一条“重”(h)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“j”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“d”区。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(cdr))，其间散布有较保守的称为构架区(fr)的区域。各vh和vl由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。各重链/轻链对的可变区(vh和vl)分别形成抗体结合部位。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亚型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗体。

本发明中使用的术语“抗原结合部分”，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合片段”。通常参见，fundamentalimmunology,ch.7(paul,w.,ed.,第2版，ravenpress,n.y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括fab、fab′、f(ab′)2、fd、fv等。

其中，术语“fab片段”意指由vl、vh、cl和ch1结构域组成的抗体片段；术语“f(ab′)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个fab片段的抗体片段。术语“fd片段”意指由vh和ch1结构域组成的抗体片段；术语“fv片段”意指由抗体的单臂的vl和vh结构域组成的抗体片段。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

本发明中使用的术语“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(nature,256:495,1975)，但也可采用重组dna技术获得(如参见u.s.p4,816,567)。

本发明中使用的术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。

本发明中使用的术语“中和抗体”是指，能清楚或显著降低目标病毒或假病毒的毒力的抗体或抗体片段。

本发明中使用的术语“表位”是指，抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位，可以是线性的表位，也可以是构象的表位。

本发明中使用的“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用。

本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示，例如：丙氨酸可用a或ala表示。

本发明中，术语“佐剂”是指，非特异性免疫增强剂，与抗原混合后可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型，包括但不限于铝佐剂如氢氧化铝，弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂等。

本发明中：术语“诺如病毒vlp”是指，有体外表达的诺如病毒vp1蛋白组装而成的病毒样颗粒，如诺如病毒gi.1vp1-vlp就是指，体外表达的诺如病毒gi.1vp1蛋白组装而成的病毒样颗粒。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

本具体实施方式中使用的主要仪器及试剂：

1.主要试剂、试剂盒及耗材

弗氏完全佐剂(cfa)、弗氏不完全佐剂(ifa)及peg4000购于sigma公司。

dmem培养基(含2％hat)及胎牛血清(fbs)购自美国hyclone公司。

hrp偶联的羊抗鼠iggfc购自美国jacksonimmun公司。

hrp底物a和b液购自北京勤邦生物技术有限公司。

proteing亲和柱柱料购自通用电气(中国)医疗集团。

sepharosecl-4b凝胶过滤自通用电气(中国)医疗集团。

10％二甲基亚砜保护液：含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％rpmi—1640液。

20％fcs—1640培养液：含青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml。

hbga购自glycotech公司。

其余试剂均为国产分析纯产品。

2.主要仪器

co2培养箱购自sanyo公司。

生物安全柜购自baker公司。

倒置荧光显微镜购自olympus公司。

流式细胞仪购自bd公司。

酶标仪购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

immage800购自美国贝克曼库尔特有限公司。

紫外分光光度计购自莱伯泰科有限公司。

3.实验动物及细胞株

实验动物为spf级balb/c雌性小鼠，8-12周龄，体重28g左右，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，屏障条件下饲养。

sp2/0细胞购自北京勤邦生物技术有限公司。

实施例1杂交瘤细胞的制备及筛选

1.免疫原的制备

制备诺如病毒gi.1vp1蛋白的单克隆抗体所使用的免疫原为诺如病毒gi.1vp1-vlp蛋白，是利用汉逊酵母细胞经体外重组表达如seqidno.16所示的氨基酸，其可自动组装成vlp，经透射电镜观察可见图1所示的病毒样颗粒，直径在20-40nm之间，呈球形。将诺如病毒gi.1vp1-vlp蛋白与等体积的福氏完全佐剂(cfa)或福氏不完全佐剂(ifa)混合，利用超声充分乳化，制备相应的免疫原。

2.动物免疫

第0天用与cfa混合的免疫原，经背部皮下多点注射小鼠，免疫3只小鼠，0.2mg次/只，共免疫4次，每次间隔1周，第3次免疫后采集小鼠血清，利用以下所示的间接elisa方法检测抗体效价，小鼠血清抗体效价均在1万倍以上，可用于细胞融合。

3.间接elisa法

gi.1vp1蛋白包被96孔板，100ng/孔。阴性对照(nc)孔加入含5％脱脂奶粉的pbs溶液100μl，4℃过夜；弃去孔中液体，pbs洗板3次，加入含5％脱脂奶粉的pbs溶液，200μl/孔，室温封闭1小时；弃去孔中液体，pbst洗板1次，加入一抗(尾血按照1：10000比例稀释；杂交瘤细胞培养上清从1：10比例，按照2倍梯度稀释；小鼠腹水从1：10000比例起始，按照3倍梯度稀释。)，室温孵育1小时；弃去孔中液体，pbst洗板3次，加入hrp偶联的羊抗鼠iggfc(1：10000比例稀释)，室温孵育1小时；pbst洗板3次，加入底物a和b液，50μl/孔，室温避光反应15min；加入1mol/l硫酸终止反应，上酶标仪测定a450/630值，以a450/630(阳性)>2倍a450/630(nc)作为判断标准。

4.杂交瘤细胞的制备及筛选

取抗体效价最高的小鼠用于融合。融合前3天用与ifa混合的免疫原进行加强免疫，0.08ml/只，取脾脏分离脾细胞进行细胞融合。首先分离单个脾细胞，经peg4000(500g/l)与鼠骨髓瘤sp2/0细胞按4:1比例融合，用含20％fbs和2％hat的dmem培养基，在96孔板中37℃恒温培养14天；收集上清，筛选阳性克隆细胞，进一步用含20％fbs的dmem培养基扩大培养，收集上清，进行复筛，复筛出的阳性克隆细胞扩大培养，收集上清，经冻存和复苏获得阳性克隆，收集上清。按间接elisa法检测培养上清，筛选上清阳性的细胞株。结果如表1所示。从400株细胞株中筛选到42株阳性细胞株，最终从中挑选能够稳定分泌抗gi.1vp1蛋白抗体的细胞株共计14株，nc为阴性对照。

表1稳定分泌抗gi.1vp1蛋白抗体的细胞株上清液elisa检测结果

5.杂交瘤细胞分泌上清液的特异性抗体检测

利用间接elisa法，包被原分别为gi.1vp1蛋白和gii.4vp1蛋白，100ng/孔。对该14株杂交瘤细胞分泌在细胞上清液的抗体进行检测，结果显示这14株杂交瘤细胞分泌在细胞上清液的抗体仅对gi.1vp1蛋白反应为阳性(如表1所示)，对gi.1vp1蛋白检测结果均为阴性，确定该15株杂交瘤细胞为型别特异性抗体。

6.中和抗体活性检测(hbga-vlp阻断试验)

通过synthetichbga-vlps阻断试验检测抗体的中和活性及其抗体滴度。具体方法如下：

1)将hbga加入亲和素包被微孔板中，2.5μg/ml，每孔100μl，置于25℃孵育1小时后弃掉板内溶液，磷酸盐缓冲液洗板3次，备用。

2)用稀释板将待测血清或抗体2倍梯度稀释，与等体积的诺如病毒gi.1vp1-vlp溶液充分混合(3.2μg/ml)，同时设立质控血清对照、阳性对照(无血清最大结合vlps孔)及空白对照(稀释液孔)，37℃孵育1小时，

3)吸取100μl的vlp和血清、抗体或稀释液混合物贴壁缓慢加入封闭后的微孔板中，4℃孵育2小时，磷酸盐缓冲液洗板3次。

4)将hrp标记的gi.1vp1兔多克隆抗体稀释至工作浓度(1：8000)，加入微孔板中，每孔100μl，于4℃孵育1小时，磷酸盐缓冲液洗板3次。

5)显色：每孔依次加入50μl显色剂a，50μl显色剂b，混匀，室温5分钟，每孔加入50μl终止液终止反应，于酶标仪进行双波长读数(a450nm/630nm)双。

6)结果计算：以bt50反应中和抗体滴度。bt50即能够阻断50％诺如病毒gi.1vp1-vlps与hbga受体结合的血清的最高稀释度。

表2杂交瘤细胞分泌上清液的中和抗体活性检测结果

7.中和抗体活性检测(pgm-vlp阻断试验)

用5μg/ml的猪胃粘液素ⅲ(pgm)(上海远慕生物科技有限公司)(100μl/孔)室温(25℃)包被96孔酶标板，经含5％脱脂牛奶的pbst在4℃封闭过夜后备用。将gi.1vlp特异性单抗10μg/ml始起，2倍比例稀释16个梯度，与等体积0.5μg/ml的gi.1vlp37℃孵育1个小时后加到包被有pgm的96孔酶标板上，室温(25℃)孵育1个小时，然后加入hrp标记的兔抗gi.1病毒样颗粒多克隆抗体(1:1000稀释液)，室温(25℃)孵育1小时，最后读取吸光值od450。

8.腹水制备、抗体纯化及抗体效价检测

选择中和活性较高的8株杂交瘤细胞制备腹水，每株阳性克隆细胞接种2只小鼠，10-14天后收集腹水，并对腹水中的抗体进行elisa检测，结果如表3所示。然后利用proteina亲和柱纯化腹水，获得纯化抗体，紫外分光光度计测定a280值，计算抗体浓度。

表3小鼠腹水中抗体elisa检测结果

9.杂交瘤细胞的传代培养及保存

将上述杂交瘤细胞在含有10％胎牛血清的dmem培养基中继续进行培养、传代，培养到10代后，4g2-d1-b10(101)和4h4-e6(401)两株能够稳定的分泌抗gi.1vp1蛋白的单克隆抗体，生长良好。

获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性；另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭，因此有必要对细胞株进行保存。保存方法如下：去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％fcs—1640液，使细胞悬浮。1000rpm/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×10⁷细胞/ml。取样，用台盼兰染色，计数活细胞数量应在95％以上。最终用无菌注射器将细胞分装至安瓶中，每瓶0.5ml-1.0ml，熔封安瓶。4℃静置2小时后转移入-70℃冰箱中15小时，最后转入液氮中冻存。

实施例24h4-e6(401)抗体的鉴定

1.抗体的获得

选择成年balb/c小鼠，腹腔接种降植烷，每只小鼠0.5ml。7-10天后腹腔接种第16代4h4-e6(401)杂交瘤细胞，每只小鼠1×10⁶-2×10⁶个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，用9号针头采集腹水。

2.抗体的纯化

将腹水13000rpm/min离心30分钟，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用proteina亲和层析进行纯化，最终得到gi.1vp1蛋白的单克隆抗体4h4-e6(401)，浓度在5mg/ml以上。

3.抗体纯度检测

将纯化后的抗体进行12％sds-page电泳，得到结果，纯度在95％以上。

4.抗体轻链及重链可变区基因序列测定

提取4h4-e6(401)杂交瘤细胞的mrna，反转录为cdna，使用可变区通用引物进行高保真pcr扩增，将pcr产物片段插入到t载体内进行dna序列测定，4h4-e6(401)的可变区基因序列：重链如seqidno.12所示，轻链如seqidno.13所示。将获得的核苷酸序列翻译成氨基酸序列。4h4-e6(401)的可变区氨基酸序列：重链如seqidno.10所示，轻链如seqidno.11所示。

5.抗体型别特异性的检测

如实施例1中5杂交瘤细胞分泌上清液中特异性抗体检测结果显示，

4h4-e6(401)抗体仅对gi.1vp1蛋白反应为阳性，对gi.1vp1蛋白检测结果均为阴性，证明4h4-e6(401)抗体为型别特异性单克隆抗体。

6.抗体中和活性鉴定(hbga-vlp阻断试验)

如实施例1中6的抗体中和活性检测结果显示，4h4-e6(401)抗体为具有中和活性的单克隆抗体。将纯化后的4h4-e6(401)抗体稀释至25μg/ml，然后2倍梯度系列稀释，按照实施例1中6.中和抗体活性检测方法进行抗体中和活性检测，4h4-e6(401)抗体对gi.1和hbga结合的bt50所对应的抗体浓度为3.125μg/ml。

7.中和抗体活性检测(pgm-vlp阻断试验)

如实施例1中7的抗体中和活性检测结果显示，4h4-e6(401)抗体为具有中和活性的单克隆抗体。将纯化后的4h4-e6(401)抗体稀释至10μg/ml，然后2倍梯度系列稀释，按照实施例1中7.中和抗体活性检测方法进行抗体中和活性检测，4h4-e6(401)抗体对gi.1和pgm结合的bt50所对应的抗体浓度为0.3125μg/ml。

实施例34g2-d1-b10(101)抗体的鉴定

1.抗体的获得

除了接种4g2-d1-b10(101)杂交瘤细胞以外，利用与实施例2-1中相同的方法进行。

2.抗体的纯化

利用与实施例2-1中相同的方法进行，最终得到gi.1vp1蛋白的单克隆抗体4g2-d1-b10(101)，浓度在5mg/ml以上。

3.抗体纯度的检测

利用与实施例2-1中相同的方法进行，结果得出，纯度在95％以上。

4.抗体重链可变区基因序列的测定

提取4g2-d1-b10(101)杂交瘤细胞的mrna，反转录为cdna，使用可变区通用引物进行高保真pcr扩增，将pcr产物片段插入到t载体内进行dna序列测定，4g2-d1-b10(101)的可变区基因序列：重链如seqidno.15所示。将获得的核苷酸序列翻译成氨基酸序列。4g2-d1-b10(101)的可变区氨基酸序列：重链如seqidno.14所示。

5.抗体型别特异性的检测

如实施例1中5.杂交瘤细胞分泌上清液中特异性抗体检测结果显示，4g2-d1-b10(101)抗体仅对gi.1vp1蛋白反应为阳性，对gii.4vp1蛋白检测结果均为阴性，证明4g2-d1-b10(101)抗体为型别特异性单克隆抗体。

6.抗体中和活性的鉴定

如实施例1中7.的抗体中和活性检测结果显示，4g2-d1-b10(101)抗体为具有中和活性的单克隆抗体。将纯化后的4g2-d1-b10(101)抗体稀释至25μg/ml，然后2倍梯度系列稀释，按照实施例1中6.中和抗体活性检测方法进行抗体中和活性检测，4g2-d1-b10(101)抗体对gi.1和hbga结合的bt50所对应的抗体浓度为3.125μg/ml。

7.中和抗体活性检测(pgm-vlp阻断试验)

如实施例1中7的抗体中和活性检测结果显示，4g2-d1-b10(101)抗体为具有中和活性的单克隆抗体。将纯化后的4g2-d1-b10(101)抗体稀释至10μg/ml，然后2倍梯度系列稀释，按照实施例1中7.中和抗体活性检测方法进行抗体中和活性检测，4g2-d1-b10(101)抗体对gi.1和pgm结合的bt50所对应的抗体浓度为0.3125μg/ml。

实施例4gi.1vp1抗原检测试剂盒

利用实施例1得到的单克隆抗体4h4-e6(401)和4g2-d1-b10(101)进行gi.1vp1双抗夹心elisa试剂盒的研制，用以检测gi.1vp1抗原水平。

1.双抗体夹心elisa法的建立

a.试剂盒原理：

4h4-e6(401)和4g2-d1-b10(101)两株抗体均为gi.1vp1型别特异性且具有中和活性的单克隆抗体。以4h4-e6(401)作为包被抗体，以4g2-d1-b10(101)作为酶标抗体，建立双抗夹心elisa检测试剂盒，当将待检样品溶液或标准品溶液加入已经预包被有4h4-e6(401)抗体的酶标板，再加入4g2-d1-b10(101)酶标二抗，用显色液显色，样品吸收值与样品中gi.1vp1蛋白的含量在线性范围内成正相关，与标准曲线比较即可得出样品中gi.1vp1蛋白的含量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，通过与系列浓度的gi.1vp1蛋白标准品溶液颜色的比较，粗略判断样品中gi.1vp1蛋白的浓度范围。

b.试剂盒的组成为：

(1)包被有包被抗体的酶标板：包被抗体为4h4-e6(401)型特异性单抗，由保藏号为cgmccno.15693的杂交瘤细胞株clone4h4-e6(401)株分泌产生。用包被缓冲液将包被抗体稀释成3μg/ml，包被于96孔酶标板上，每孔加入100μl，置于4℃环境孵育8小时。弃去包被液，洗涤液洗涤3次，拍干。然后在酶标板中加入封闭液，每孔100μl，37℃环境孵育2小时。倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。其中，所用的包被缓冲液是ph值为9.5、0.1mol/l碳酸盐缓冲液；所用封闭液是含有在封闭液中终浓度为8％(质量百分含量)的牛血清白蛋白、ph值为8.6、0.1mol/l的巴比妥钠-盐酸缓冲液。

(2)酶标抗体：标记酶为辣根过氧化物酶，标记方法为过碘酸钠法，酶标抗体为4g2-d1-b10(101)型特异性中和单抗，由保藏号为cgmccno.15694的杂交瘤细胞株clone4g2-d1-b10(101)株分泌产生，酶标抗体的工作浓度为0.1μg/ml。

(3)标准品溶液：gi.1vp1蛋白标准品溶液，7瓶，浓度分别为1μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.125μg/ml，0.0625μg/ml，0.03125μg/ml和0.015625μg/ml。配制标准品溶液为含有在配制标准品的溶液中终浓度为5-10％(质量百分含量)的dmso、ph为6.5-6.7、0.1-0.2mol/l的磷酸盐缓冲液。

(4)底物显色液：由显色液a液和显色液b液组成，显色液a液为过氧化氢，显色液b液为邻苯二胺。

(5)终止液为1-2mol/l硫酸溶液。

(6)浓缩洗涤液：ph值为8.5、含有在浓缩洗涤液中的终浓度为0.05％(质量百分含量)叠氮化钠、在浓缩洗涤液中的终浓度为2.0％(质量百分含量)吐温-20、0.3mol/l的磷酸盐缓冲液；40ml/瓶，1瓶。

(7)浓缩复溶液：含有在复溶液中的终浓度为5-10％(质量百分含量)的dmso、ph为6.5-6.7、0.1-0.2mol/l的磷酸盐缓冲液；200ml/瓶，1瓶。

(8)试剂盒说明书。

2.试剂盒特异性验证

将gi.1vp1和gii.4vp1蛋白配置成50μg/ml的供试品，分别稀释到2μg/ml，1μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.125μg/ml，0.0625μg/ml和0.03125μg/ml的稀释液，利用gi.1vp1抗原检测试剂盒对gi.1vp1和gii.4vp1两种蛋白进行elisa检测，结果如表4所示，可见gi.1vp1抗原检测试剂盒对gi.1vp1检测为阳性，对gii.4vp1蛋白检测为阴性，试剂盒特异性良好。

表4试剂盒特异性验证检测结果

注：阴性对照(样品稀释液)od450＜0.05

3.试剂盒灵敏度验证

试剂盒检测的最低抗原浓度是确定试剂盒灵敏度的关键。将gi.1vp1蛋白配置成50μg/ml的供试品，分别稀释到1μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.125μg/ml，0.0625μg/ml，0.03125μg/ml和0.015625μg/ml。利用试剂盒对稀释后的样品重复测定6次，将6次标准曲线检测下限取均值，最终确定试剂盒灵敏度为7.81ng/ml。

4.试剂盒精密度验证

a.精密度验证—板内差异

将gi.1vp1蛋白稀释至1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml和0.0625μg/ml共计5个不同抗原浓度，每个抗原浓度做5个复孔(n＝6)，以样品稀释液作为阴性对照。计算酶标板内相同浓度的各孔间od值变异系数(coefficientofvariation,cv)，结果如表5显示，板内cv(％)值均小于15％，表明该试剂盒板内精密度良好。

表5试剂盒板内差异验证结果

b.精密度验证—板间差异

将gi.1vp1蛋白稀释至1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml和0.0625μg/ml共计5个不同抗原浓度，每个抗原浓度做5个复孔(n＝6)，以样品稀释液作为阴性对照。计算不同酶标板间相同浓度的各孔od值变异系数(coefficientofvariation,cv)，结果如表6显示，板间cv(％)值均小于15％，表明该试剂盒板间精密度良好。

表6试剂盒板间差异验证结果

5.试剂盒准确度验证

将gi.1vp1蛋白稀释至50ng/ml、60ng/ml和70ng/ml，作为加标溶液，加入到供试品溶液中(240μg/ml)，以vp1蛋白含量对应其吸光度值做标准曲线，计算加标前后供试品溶液中gi.1vp1蛋白浓度，计算样品回收率，分析该试剂盒的准确度。结果如表7所示，结果显示加标回收率(95％ci)在71.21～125.73％之间，试剂盒回收率良好。

表7试剂盒准确度验证结果

6.试剂盒重复性验证

将gi.1vp1蛋白稀释至1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml、0.03125μg/ml和0.015625μg/ml共7个浓度，以样品稀释液作为阴性对照，以供试品中gi.1vp1蛋白含量对应其吸光度值做标准曲线，每个型别检测6次，标准曲线的线性相关系数r²结果如表8所示，相关系数r2均不低于0.99，表明该检测方法线性相关性及重复性较好。

表8试剂盒重复性验证结果

7.试剂盒保存期试验

试剂盒保存条件为2-8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)，gi.1vp1蛋白实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存6个月以上。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>国药中生生物技术研究院有限公司；北京生物制品研究所有限责任公司

<120>特异性结合诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp的抗体及其制备方法和应用

<130>none

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>12

<212>prt

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1510

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