一种茶杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种茶杆菌及其应用。

背景技术：

多相分类的概念最初由colwell于1970年提出，是指利用微生物多种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发育的信息，综合起来研究微生物分类和系统进化的过程。

产芽孢的细菌包含很多有特殊功能的菌株，在工业、农业和医学等领域中成为人们极为关注的一个微生物类群。采用现代分类手段对产芽孢细菌进行分类研究并对其生理生化特性进行探索，可获得一些生产应用或者潜在应用价值的菌株。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种茶杆菌，该芽孢杆菌为seqidno.1所示的碱基序列。

本发明的目的之二在于提供该茶杆菌在液体发酵生产酯酶和胰凝乳蛋白酶中的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种茶杆菌，于2017年3月1日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13438。

上述的茶杆菌的形态为：圆形菌落，边缘粗糙，表面光滑湿润，半透明，中间凸起，乳白色，属革兰氏阳性菌，该菌体的形态为产芽孢的短杆。

上述的茶杆菌的16srdna为seqidno.1所示的碱基序列。

一种上述的茶杆菌在液体发酵生产酯酶及胰凝乳蛋白酶中的应用。

上述的茶杆菌的培养方法为：将茶杆菌t8cgmccno.13438接种于培养基中，在20～60℃，ph6.5～8.0的条件下进行培养。

上述最适培养温度为37-45℃。

上述最适ph为7.0～7.5。

上述的培养的培养基中还包括质量百分比浓度不超过3％的nacl。

上述的培养在需氧条件下进行。

本发明所述的培养可以是各种微生物的培养方式，比如液体培养、固体培养、半固体培养等，可以是摇床培养，也可以是发酵罐深层发酵，优选的摇床培养。

本发明所述的培养的接种量为常规，所述百分比为体积百分比。

本发明所述的培养基为常规培养基，优选是tsb培养基。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供了一个新的分类单元，茶杆菌新属的一个新种，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名为camelliibacillustheaegen.nov.sp.nov.。该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源。本发明的茶杆菌t8，可提取酯及胰凝乳蛋白酶，在食品、医药和化工等行业具有广泛应用。

生物材料保藏信息：本发明的茶杆菌t8，已于2017年3月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：cgmccno.13438。该菌株的分类命名是芽孢杆菌bacillussp.，名称为t8。

附图说明

图1显示本发明茶杆菌新菌株t8的16srrna系统发育进化树。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。

实施例1、本发明新菌株t8的分离制备

取普洱熟茶浸出液，将其稀释涂布于lb固体培养基中，30℃培养2天，挑取单菌落，然后划线纯化得到。

将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其保藏编号为cgmccno.13438。

实施例2、本发明新菌株t8的表观特征

1.菌落特征

取菌株t8的单菌落，转接到tsa固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养48h，观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结果显示，菌株t8在tsa固体培养基上形成边缘粗糙，表面光滑湿润，半透明，中间凸起，乳白色的圆形菌落，直径约1mm。

2.细胞形态学特征

细胞为短杆状；革兰氏染色阳性；周生鞭毛，产芽孢，细胞菌体大小为0.5-0.7μm×1.7-2.5μm，单生。

实施例3、本发明新菌株t8的生长特性

挑取在tsa固体培养基上培养12h的新鲜培养物，接种到lb液体培养基，37℃摇床培养12h，作为种子。

液体tsb培养基的组成(/l)：胰蛋白胨15g，nacl5g，大豆蛋白胨5g，蒸馏水定容至1000ml。

1.生长温度：

将所培养的t8种子按2.5％(v/v)接种量转接新鲜的tsb液体培养基中，混匀。分别置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃的水浴培养，每个温度梯度做三个平行，每12h测定其生长情况。得知菌株t8-1生长温度范围为20～60℃，最适温度37～45℃。

2.生长nacl耐受性

所培养的t8-1种子按2.5％(v/v)接种量转接氯化钠浓度分别为0.0％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％和6.0％的tyb培养基，37℃培养，分别于24h和48h的生长状态做记录。结果显示菌株t8的nacl生长浓度为1％-3％。

3.生长ph范围

在最适生长盐浓度条件下，使用缓冲液分别将灭好菌的培养基调至ph值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，其中ph3.5-6.0使用的是0.2mol/l的na2hpo4和0.1mol/l的柠檬酸；ph6.5-8.0使用的是1/15mol/l的na2hpo4和1/15mol/l的kh2po4；ph8.5-10.0使用的是0.1mol/l的na2co3和0.1mol/l的nahco3。每个ph梯度的培养基为：20ml的ph缓冲液、0.1g胰蛋白胨、0.1g大豆蛋白胨、0.1g酵母粉；分装于5支试管，每支4ml。灭菌后分别接种2.0％的新鲜菌液于37℃摇床培养24小时观察其生长状态，确定菌株t8的生长ph范围为6.5～8.0，最适生长ph为7.0～7.5。

实施例4、本发明新菌株t8的生理生化特性

利用apizym和api20e鉴定系统(生产厂商：biome′rieux)及常规的生理生化测定方法(东秀珠，蔡妙英等，2001)对菌株t8及相关的同属菌株进行生理生化特征鉴定。

其中apizym是一个半定量的微量方法系统，专为研究酶活所设计的。该技术对各种标本(组织、细胞、生物体液、洗涤水、土、油，等)都适用。它可系统和快速地研究19种酶的活性。用样量极少。实验步骤如下：

1)样品准备：在最小体积稀释标本：可用2ml无菌蒸馏水或其它如普通的生理盐水不需要缓冲液。制备一个菌悬液，其混浊度在mcfarlandno5和no6之间。从斜面或离心肉汤培养物的纯菌种都能用来制备菌悬液。

2)试验条的准备：准备一个培养盘和盖子。记标本号于盘的侧面。可使用一个塑料洗瓶，分装约5ml蒸馏水于培养盘内，为了培养时能保持一定的湿度。从密封的包装中取出apizym试验条，置培养盘内。

3)试验条的接种：用吸管接种，于试验条的每个杯中接入2滴标本(65μl)。

4)试验条培养：接种后，托盘上放塑料盖子，37℃培养4小时。所有的测定条件(时间、温度、培养基、悬液浓度)要保持一致。接种的试验条避光保存。

5)试验条的结果观察：培养后，加1滴zyma试剂和1滴zymb试剂。5分钟后生色，如果是阳性，将试验条置于一个强光源(1000瓦灯泡)下10秒，把灯泡放在杯上4秒。这是为消除杯中多余坚牢兰的黄色。暴光后阴性反应变为无色。再置试验条于日光下几分钟后，就可产生比较的结果。

6)记录反应：0-5标记相应的颜色深度。0相当于阴性反应，5为最强反应。2-4是二者之间的强度。从颜色深度可知近似的微毫克分子浓度(nm)：1相当释放5微毫克分子浓度(5nm)，2相当于10nm，3为20nm，4为30nm，5为40nm或更高。

菌株t8的主要生理生化特征：好氧生长；触酶阳性，氧化酶阴性；β-糖醛酸糖苷酶阴性，精氨酸双水解酶阳性，赖氨酸脱羧酶阴性，脲酶阴性，鸟氨酸脱羧酶阴性，酯酶(c4)阳性，类脂酯酶(c8)阳性，胰凝乳蛋白酶阳性，α-半乳糖苷酶阴性，产生吲哚，vp反应阴性，不液化明胶；不水解酪蛋白；不水解淀粉；不还原硝酸盐；能利用果糖、柠檬酸、乙酸和乳酸等作为碳源；不利用葡萄糖、麦芽糖、纤维二糖等底物。

菌株t8在盐的耐受、生长温度及是否厌氧生长等方面与同源性相近的菌有明显的差异。比如，与菌株t8相比，virgibacillus,oceanobacillus,ornithinibacillus和aeribacillus属的模式菌均呈现嗜盐性。菌株t8的最高生长温度远远高于virgibacillus,oceanobacillusandornithinibacillu。另外，菌株t8以周身鞭毛运动且好氧生长，而bacilluscomposti不运动，且能厌氧生长。

实施例5、本发明新菌株t8(cgmccno.13438)的16srrna基因的pcr扩增和序列测定及16srrna系统发育特征。

1.提取基因组dna

将茶杆菌camelliibacillustheaesp.t8(cgmccno.13438)接种于tsb液体培养基，将生长至对数晚期的发酵液，12000转/分钟离心1分钟，去除上清液；用tes(50mmtris，50mmedta-na2，50mmnacl，ph8.0～8.2)溶液洗3遍；用0.4mltes溶液将菌体混匀，加入适量溶菌酶，37℃保温1h；加入0.04ml20％sds，60℃保温30min；加入0.18ml5mnaclo4，混匀；加入等体积氯仿-异戊醇(24:1，v/v)，轻轻摇匀，离心(12000转/分钟，10分钟)，吸取上清液；上清液加入20μl0.2％rna酶37℃保温30分钟，氯仿-异戊醇(24:1，v/v)处理一遍；上清液加入20μl蛋白酶k(50-70μg/ml)，37℃保温1h，氯仿-异戊醇(24:1，v/v)处理一遍；上清液用2倍体积冰乙醇沉淀，70％冰乙醇溶液浸泡5分钟，12000/分钟离心5分钟。晾干后溶于无菌水中作为模板dna。

2.16srrna基因的pcr扩增及测序

用于pcr扩增的正向引物为5’-agagtttgatcctggctcag-3’(nt8-27)，反向引物为5’-aaggaggtgatccagcc-3’(nt1541-1557)，分别对应于大肠杆菌的16srrna基因的8-27和1541-1557碱基。pcr反应体系(20μl)为：10×buffer2μl、25mmol/lmgcl22μl、10mmol/ldntps1.5μl、30pmol/l引物各1μl、ddh2o13.4μl、taqdna酶1μl、模板1μl。pcr反应条件为：95℃10min，95℃1min，55℃1min，72℃90s，30个循环；72℃10min，4℃保存。

pcr产物的测序采用abibigdye3.1测序试剂盒(appliedbiosystems)和dna自动测序仪(modelabi3730；appliedbiosystems)。

测序结果表明，菌株t8(cgmccno.13438)16srrna基因序列长度为1542bp。其16srrna基因的核苷酸序列如序列表1所示。

如上所述的使用软件megaversion6.0.softwarepackage绘制进化关系树。采用neighbor-joining计算，并以maximum-parsimony和maximum-likelihood进行验证计算，bootstrap设置为1000个循环。结果如图1所示。从图1可见，通过对16srrna基因的系统发育树分析，菌株t8属于芽孢杆菌科，与芽孢杆菌科的bacillus,virgibacillus,oceanobacillus和ornithinibacillus等属相对比，形成一个相对独立的分支。菌株t8与芽孢杆菌科的相似性均低于94％，亲缘关系最近的是bacilluscompostisgz-9^t，16srrna同源性93.3％。根据细菌分类学原则，菌株t8应为bacillaceae科的一个新属。

实施例6：本发明新微生物的脂肪酸含量特征

菌株t8的总脂肪酸含量的测定。

配置如下溶液：i，45g氢氧化钠溶于150ml甲醇及150ml蒸馏水；ii，190ml浓盐酸，275ml甲醇溶于135ml蒸馏水；iii，200ml正己烷与200ml乙醚混合均匀；iv，10.8克氢氧化钠溶于900ml蒸馏水；v，饱和氯化钠溶液。

1)取适量细菌培养物，置于8ml螺口玻璃管中，加入1ml溶液i，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出振荡5-10秒，再度拧紧螺盖，继续沸水浴25min；

2)待样品管冷却后，加入2ml溶液ii，盖严振荡，随后精确控制80±1℃水浴10min，冰浴冷却；此步骤需严格控制温度和时间，以免羟基酸和环式脂肪酸受到破坏；

3)在冷却的样品管中加入1.25ml溶液iii，快速振荡10min左右，弃去下层水相；

4)在剩余有机相中加入3ml溶液iv及几滴溶液v，快速振荡5min左右，取三分之二上层有机相置气相色谱样品瓶中备用。

hp6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器(fid)及hp气相色谱化学工作站(hpchemstationvera5.01)；色谱柱为ultra-2柱，长25m，内径0.2mm，液膜厚度0.33μm；炉温为二阶程序升温：起始温度170℃，每min5℃升至260℃，随后以40℃/min升至310℃，维持1.5min；进样口温度250℃，载气为氢气，流速0.5ml/min，分流进样模式，分流比100:1，进样量2μl；检测器温度300℃，氢气流速30ml/min，空气流速216ml/min，补充气(氮气)流速30ml/min。

结果显示，菌株t8的主要细胞脂肪酸为支链脂肪酸iso-c15:0和iso-c16:0，百分含量分别为65.5％和10.1％。芽孢杆菌科的许多成员属中，anteiso-c15:0一般为主要的脂肪酸组成成分。而在菌株t8中，其为次要的少量成分，由此也可推测菌株t8应代表一个不同的属。

实施例7：本发明新微生物的g+cmol％含量特征

菌株t8-1基因组dna的g+cmol％含量测定。

使用熔解温度(tm)法，以大肠埃希氏(e.colik12，as1.365)为参比对照，所用仪器为agilenttechnologies公司caryseriesuv-visspectrophotometer，用ptp-1数字温度控制仪控温。步骤如下:

1)将待测dna样品用0.1×ssc稀释至od260nm值于0.3～0.4之间；

2)在波长260nm首先记录25℃的od值，然后设定升温程序，从30℃开始到95℃,其间每分钟升高1℃；

3)od值上升表示变性开始,记录比色皿温度和od值，直至od值不变表示变性完毕；

4)根据热变性曲线，得出熔链温度(tm)，计算g+cmol％含量。

在0.1×ssc溶液中计算公式为:

g+cmol％＝g+cmol％(as1.365)+2.08(tm未知-tmas1.365)

试验测定的e.colik12as1.365的tm为79.1℃，待测菌株t8tm是73.0℃，已知标准菌株e.colik12as1.365的gc含量为51.6mol％，通过上述公式可推算出测菌株t8的g+c含量是39.1mol％。

结合实例2，3，4，5，6的数据，由此判定，菌株t8为bacillaceae科的一个新属，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名camelliibacillustheae，并选菌株t8为该种的模式菌株。

实施例8：本发明新微生物的用途

经apizym鉴定系统(生产厂商：biome′rieux)测定，菌株t8具有酯酶及胰凝乳蛋白酶活性。

作为微生物来源的酯酶酶及胰凝乳蛋白酶在食品、医药和化工等行业具有有广泛应用。

序列表

<110>上海大学

<120>一种茶杆菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1542

<212>dna

<213>camelliibacillustheae

<400>1

agagtttgatcatggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagc60

ggacagaaggagagcttgctctctggaagttagcggcggacgggtgagtaacacgtaggc120

aacctgcctgtaagatggggataactccgggaaaccggggctaataccgaataggcaatc180

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