造血及淋巴组织肿瘤的ctDNA高通量检测的制作方法

本发明属于血液病分子诊断学领域，具体涉及造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序检测。
背景技术：
：造血及淋巴组织肿瘤是一类与造血系统相关肿瘤的总称，在世界卫生组织(who)最新的分类中，造血及淋巴组织肿瘤下分髓系肿瘤及淋系肿瘤两大类，这两类下又可分为多个分支及亚型。who对造血及淋巴组织肿瘤的分类依据分子生物学、细胞遗传学、细胞形态学及免疫学这个4大学科进行，其所分肿瘤亚型多达数十种，不同亚型肿瘤的治疗手段及预后情况也有所不同。因此，造血及淋巴组织肿瘤的精准分类对于其治疗及预后判断有着重要的意义。目前，随着分子生物学的发展，其在造血及淋巴组织的分型及治疗和微小残留病灶监测过程中所发挥的作用日益重要。从最经典的bcr-abl融合基因与慢性粒细胞白血病(cml)，以及后来的jak2、myd88、tp53等等多个基因突变与造血及淋巴组织肿瘤的关系被发现，目前已经有多个基因被不同文献所报道与造血及淋巴组织肿瘤所相关。而基于这些基因的突变位点检测，一大部分患者均需要涉及到组织或者骨髓活检的方法，而这两类方法均属于有创检测，存在取材困难、不利于随时监控等缺点，使得基于组织或骨髓活检的基因检测在临床应用具有一定的局限性。液体活检(liquidbiopsy)是近年来兴起的一种新型技术，该技术通过抽取受检者的外周血并检测外周血中的游离dna(cfdna/ctdna)、肿瘤细胞或者肿瘤细胞释放的外泌体等物质，从而对受检者本身疾病的发生及进展、基因突变等等情况进行检测，达到辅助临床治疗的目的。液体活检主要特点为取材容易，只需抽取患者外周血即可进行检测，基于无创这一特点，该技术问世以来就受到科研界广泛关注。目前较为成熟的检测技术是基于游离肿瘤dna(ctdna)进行检测的二代测序技术以及数字pcr技术，而在实际应用中，基于二代测序技术的ctdna相关检测因其检测范围广而大量应用于液体活检领域相关的科研及临床当中。目前，国内和国际上针对ctdna的二代测序已经有一些成熟的技术，如多重pcr技术以及杂交捕获技术，多重pcr技术具备所需起始dna量低，操作简便等优点，而杂交捕获技术则能够在一定程度上对拷贝数变异(cnv)以及一部分外显子缺失位点进行检测。此外，近年诞生的双端分子标签技术、滚环复制技术以及著名的amp技术，使得目前的ctdna液态活检的检测灵敏度扩展了一个数量级，达到了0.1％。并且在诸如肺癌，弥漫大b淋巴瘤等癌种中的各类数据均表明，ctdna在突变检测上与组织样本存在高度符合性，甚至可以较肿瘤组织活检更早预测肿瘤的复发及反映原发肿瘤基因组全貌。这一系列的技术及研究结果的出现，使得基于ctdna的液态活检得以应用于临床检测。ctdna液态活检技术目前主流的肿瘤临床应用领域仍集中在肺癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌等少数高发癌种上，而造血淋巴组织肿瘤的相关应用仍较为缺乏，且尚未见基于ctdna的造血及淋巴组织肿瘤的测序产品。技术实现要素：本发明的一方面提供髓系肿瘤及淋巴组织肿瘤相关基因组合在构建检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库中的应用，所述基因组合包括选自表1所示的基因的任意一个或更多个基因。表1173个基因及其对应的ncbigenbank编号在一些实施方案中，所述基因组合包括表1所示的全部173个基因。在一些实施方案中，所述基因组合用于制备能够特异性检测所述基因组合的引物组合，所述能够特异性检测所述基因组合的引物组合用于构建检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库。因此，本发明的另一方面提供能够特异性检测所述基因组合的引物组合在构建检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库中的应用。在一些实施方案中，所述引物组合包括选自表2所示的2720个引物对中的任意一个或更多个引物对。表22720对引物序列在一些实施方案中，所述引物组合包括表2所示的全部2720个引物对。本发明的另一方面提供引物组合，所述引物组合包括选自表2所示的2720个引物对中的任意一个或更多个引物对。在一些实施方案中，所述引物组合包括表2所示的全部2720个引物对。本发明的另一方面提供构建检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库的方法，包括如下步骤：(1)以从外周血中提取的肿瘤细胞游离dna(ctdna)为模板，使用能够特异性检测上述基因组合的引物组合进行多重pcr反应，得到含有dna片段集合的混合物；(2)向步骤(1)获得的混合物添加ngs测序标签(index)，并在两端连接测序所需的接头，然后纯化获得带测序接头的目标dna片段混合物，即获得高通测量序文库(library)。在一些实施方案中，所述引物组合包括选自表2所示的2720个引物对中的任意一个或更多个引物对。在一些实施方案中，所述引物组合包括表2所示的全部2720个引物对。在一些实施方案中，多重pcr反应的程序是：99℃保持2分钟；23个循环，每个循环99℃15秒，60℃4分钟；10℃保持。本发明的另一方面提供检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库，所述文库是通过上述方法获得的文库。本发明的另一方面提供上述基因组合在制备造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂或造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂盒中的应用。本发明的另一方面提供能特异性检测上述基因组合的引物组合在制备造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂或造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂盒中的应用。本发明的另一方面提供上述引物组合或上述高通量测序文库在制备造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂或造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂盒中的应用。本发明的另一方面提供造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂盒，其包含上述引物组合。本发明的有益效果在于：(1)本发明首次利用ctdna对造血及淋巴组织肿瘤进行全面检测。(2)低起始量的同时能检测广泛位点：本发明采用多重pcr法构建文库，其优点在于，相比于传统的taqman-qpcr法检测突变，多重pcr法能一次性检测几百、上千个片段及相关位点，具有传统pcr及ddpcr无法达到的通量。此外，多重pcr法构建dna文库，仅需要最低1ng的dna起始量，与杂交捕获法构建ngsdna文库相比，该方法大大降低了dna的量的需求。在进行现有的snv、indel检测中该方法尤其适用。(3)灵敏度高：采用超高深度测序(20000×)，结合falsefilter生信算法，可以精确的检测到0.5％以上的真实突变。有效的过滤掉测序本身产生的错误突变。(4)实用性强：相较同类产品，本发明涉及到的173个基因涵盖了造血及淋巴组织肿瘤分型诊断、预后用药等所有领域，可以对造血及淋巴组织肿瘤进行全面检测，包括其对应who下属所有与基因突变相关的亚型的相关基因位点，具有强的临床指导意义。使用本发明的引物组合对本发明的基因组合扩增的效率均一性能达到90％以上，保证了测序数据的高利用率。(5)本发明的2720对引物混合在一个体系中，引物与引物之间、引物与非扩增区域之间的干扰几乎不存在，保证了每个特异性目的片段均能正常扩增。附图说明图1是两步法多重pcr原理示意图：gdna经过由多对pcr引物组合而成的panel的扩增后，得到含有大量目的dna碱基片段的初始文库，通过将测序仪测序所需识别的其实接头序列1、2连接到个片段两端后，进一步通过pcr进行目标dna文库的富集，最终形成最后的文库后，即可进行测序。具体实施方式本发明的基因组合包括但不限于选自表1所示的173个髓系肿瘤及淋巴组织肿瘤相关基因的任意一个或更多个基因。在一些实施方案中，本发明的基因组合由选自表1所示的173个髓系肿瘤及淋巴组织肿瘤相关基因的任意两个或更多个基因组成。包括选自表1所示的173个髓系肿瘤及淋巴组织肿瘤相关基因的任意一个或更多个基因以及其他髓系肿瘤及淋巴组织肿瘤相关基因的基因组合也在本发明的保护范围之内。在一些实施方案中，本发明的基因组合包括表1所示的173个髓系肿瘤及淋巴组织肿瘤相关基因。在一些实施方案中，本发明的基因组合由表1所示的173个髓系肿瘤及淋巴组织肿瘤相关基因组成。本发明中所述的基因组合所包括的基因的名称及其ncbigenbank编号在表1中列出，即本发明中所述的基因组合所包括的基因具有表1所示的基因名称以及表1所示的ncbigenbank编号。本发明的基因组合用于构建检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库时，可以设计能够特异性检测所述基因组合中所包含的基因的外显子区域或热点区域的引物，利用这些引物构建检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库。利用本发明的基因组，可以设计针对所述基因组合所含基因的特异性引物，对从外周血中提取的ctdna进行多重pcr，在pcr产物上添加ngs测序标签和接头，扩增后获得高通量测序文库。所述特异性引物可以是能够特异性扩增所述基因组合所含基因的外显子区域或热点区域的引物。本发明还涉及构建检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库的方法，包括如下步骤：(1)以从外周血中提取的肿瘤细胞游离dna(ctdna)为模板，使用能够特异性检测上述基因组合的引物组合进行多重pcr反应，得到含有dna片段集合的混合物；(2)向步骤(1)获得的混合物添加ngs测序标签(index)，并在两端连接测序所需的接头，然后纯化获得带测序接头的目标dna片段混合物，即获得高通测量序文库(library)。在一些实施方案中，多重pcr反应的程序是：99℃保持2分钟；23个循环，每个循环99℃15秒，60℃4分钟；10℃保持。ctdna的提取方法是本领域技术人员熟知的，可以采用商购的试剂盒，优选qiagen相应的dna提取试剂盒。并可以结合nanodrop、qubit等仪器进行提取后dna浓度及质量监控。所使用的肿瘤细胞游离dna可以是从多种外周血样本中提取的ctdna，例如从不同受试者的外周血样本中提取的ctdna。所使用的肿瘤细胞游离dna是从多种外周血样本中提取的ctdna时，为每种外周血样本的dna片段添加不同的ngs测序标签，以区分不同的样本。本发明中所述的“多重pcr”是指在一个反应体系中将模板dna与多对引物混合，使用相同的反应条件进行pcr扩增反应。多重pcr是本领域技术人员熟知技术，主要的反应组分包括模板dna、dna聚合酶、dntp、缓冲液等。多重pcr反应所使用的设备以及反应参数是本领域技术人员所知晓的或能够容易地确定的。本申请的实施例也提供了示例性的多重pcr方法。多重pcr所使用的试剂，优选采用商业试剂，如lifetech公司的《ampliseqlibrarykit》。本发明中的“ngs测序标签”即index，可以采用illumina通用index序列。本发明中“接头”，可以采用illumina对应接头序列。上述文库构建方法获得的最终文库结构可以是tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag-xxxxxxx-aaaaaaaaaa-ctgtctcttatacacatctccgagcccacgagac，其中，第一部分以及最后一部分碱基序列为illumina测序所需的两端接头碱基序列，“xxxxxxxx”为不同序列的index，用以区分不同样本的dna数据，“aaaaaaa”为pcr产物，其长度在80～120bp左右。接头序列包括并不仅限于上述序列，可以为其它illumina对应接头序列。接头序列可以是illumina的测序通用接头，也可以是lifetech的测序接头，如采用lifetech的接头，后续测序及分析流程与lifetech相应的流程一致。本发明提供特别优选的引物组合以及该引物组合在构建检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库中的应用。所述引物组合可用于检测，特别是特异性检测本发明的基因组合。所述引物组合包括但不限于选自表2所示2720个引物对中的任意一对或更多对引物。在一些实施方案中，所述引物组合由选自表2所示2720个引物对中的任意两对或更多对引物组成。所述引物组合能够扩增表1的173个基因中的任意一个或更多个基因的外显子区域或热点区域，每对引物对应的产物长度均在80-120bp之间。在一些实施方案中，所述引物组合包括但不限于表2所示的2720对引物。在一些实施方案中，本发明的引物组合由表2所示的2720对引物组成。表2所述的2720对引物中的任意一对或更多对引物混合在一个体系中时，引物与引物之间、引物与非扩增区域之间的干扰几乎不存在，保证了每个特异性目的片段均能正常扩增。除了选自表2所述的2720对引物中的任意一对或更多对引物之外，本发明的引物组合还可以包含其他引物，所述其他引物可以是针对其他髓系肿瘤及淋巴组织肿瘤相关基因的引物，也可以是针对表1所述的173个髓系肿瘤及淋巴组织肿瘤相关基因中的任一个或任几个的引物。当所述其他引物与表2所述的2720对引物中的任意一对或更多对引物混合在一个体系中时，应当满足以下条件：引物与引物之间、引物与非扩增区域之间的干扰几乎不存在，保证每个特异性目的片段均能正常扩增。本发明还涉及通过上述方法构建获得的高通量测序文库。通过对构建的高通量测序文库进行测序以及数据分析，寻找到致病突变，明确疾病分型、用药或预后情况，为临床诊断和精准用药提供依据。对文库进行测序，测序仪采用lifetech平台配套仪器(ionpgm)。测序过程中将对各个dna片段的核苷酸序列进行读取并记录，生成fastq/bam等数据文件。测序深度平均在20000×左右，保证低比例突变能被有效地检测到。针对测序，本发明可以兼容多种illumina测序仪，包括从miseq、hiseq到novaseq等等。同时，针对life公司的测序仪，本发明可适用于pgm、proton、s5三个不同平台的life公司测序仪。对得到的数据进行分析的具体过程为：a)原始数据经过index拆分后，得到不同样本的原始测序数据，接着利用bwa软件对数据进行比对，比对到人类基因组数据库hg19参考序列上，同时筛除低于q30质量的数据；b)利用samtools及gatk等软件，对上述处理完毕后的数据进行进一步分析得到所需的snp及indel信息。c)利用falsefilter生信软件进行假阳性位点筛除，得到一份含有真实突变信息的文件(vcf文件)。d)利用上述获得目标片段中的基因突变(snv)及微小插入/缺失突变(indel)数据，通过annovar、clinvar、dbsnp、cosmic、hgmd等软件及数据库进行突变的解读。对数据进行分析，包括但不仅限于不同样本数据拆分、数据质量控制(q20)、snpcall、coverageanalysis等等部分，使用可以是商业化的软件或自主开发的相关软件进行分析。本发明的基因组合、引物组合或高通量测序文库可用于制备造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂。所述造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂优选是造血及淋巴组织肿瘤高通量测序诊断试剂，即通过高通量测序诊断造血及淋巴组织肿瘤的试剂，例如所述试剂可以是用于通过高通量测序和数据分析获得髓系肿瘤及淋巴组织肿瘤相关基因的外显子区域和/或热点区域的突变情况，从而诊断造血及淋巴组织肿瘤的试剂。本发明的基因组合、引物组合或高通量测序文库可用于制备造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂盒。所述造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂盒优选是造血及淋巴组织肿瘤高通量测序诊断试剂盒，其中包含通过高通量测序诊断造血及淋巴组织肿瘤的试剂，例如所述试剂可以包括用于通过高通量测序和数据分析获得髓系肿瘤及淋巴组织肿瘤相关基因的外显子区域和/或热点区域的突变情况，从而诊断造血及淋巴组织肿瘤。例如，所述试剂盒中可以包含能够特异性检测本发明的基因组合的引物组合。在一些实施方案中，所述引物组合包括但不限于选自表2所示的2720个引物对中的任意一对或更多对引物。在一些实施方案中，所述引物组合由选自表2所示的2720个引物对中的任意两对或更多对引物组成。在一些实施方案中，所述引物组合包括表2所示的2720对引物。在一些实施方案中，所述引物组合由表2所示的2720对引物组成。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含进行多重pcr反应所需的一种多种其它试剂。多重pcr是本领域中已知的技术，主要的反应组分包括模板dna、dna聚合酶、dntp、缓冲液等。多重pcr反应所使用的设备以及反应参数是本领域技术人员所知晓的或能够容易地确定的。本申请的实施例也提供了示例性的多重pcr方法。在一些实施方案中，试剂盒还可以包含用于处理多重pcr扩增产物以使得该扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂。多重pcr扩增产物通常需要进行处理，例如，末端修复，连接接头和标签、纯化、修复缺口等。对于掌握高通量测序的普通技术人员而言，上述处理步骤和所需要的试剂是容易理解的。本申请的实施例也提供了示例性的处理方法。本发明中，术语“诊断”包括鉴定、确认和/或表征造血及淋巴组织肿瘤的存在或不存在，及其发展阶段。本发明利用多重pcr方法进行所述基因组合的文库构建，但不仅限于该方法，例如杂交捕获等其它方法进行该基因组合的文库构建同样在本发明的保护范围内。下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明不限于下面的实施例。实施例1通过检索国内外各大权威数据库(包括cosmic、ncbi等等数据库)，并结合权威期刊杂志进行基因组合信息的第一步收集。同时，对自主检测得到的数据进行深度分析，通过精准临床分型以及基因通路分型进行基因归类，通过检出率以及q20等质控数据进行突变位点的数据过滤，得到一批过滤剩后的基因组合，并与第一步的基因组合进行并集处理，最终整理得到173个基因的基因组合。该基因组合除涵盖目前权威杂志上几乎所有造血及淋巴组织肿瘤相关基因，还涵盖了造血及淋巴组织肿瘤分型到预后所有层面的相关基因位点(其中包含多个目前未报道的发明人新发现的位点)，具有非常强的临床指导意义。所涉及的173个基因的信息见表1。针对这173个基因的外显子区域或热点区域，以及含新发现的与造血及淋巴组织肿瘤分型、预后相关的位点的区域，进行多重pcr引物设计，通过进行引物与引物、引物与模板之间的非特异性结合概率计算来选取非特异性最低的引物组合，着重避免引物末端出现的非特异性结合情况的出现。同时，设计引物时需要考虑每对引物对应扩增产物的长度在80～120bp之间，保证了设计的引物所扩增得到的最终产物能有效的进行后续的测序反应。经过实验验证和大量筛选，得到2720对引物(其序列信息见表2)。并将所设计的引物合成后，混合成引物库。实施例2一、样本dna的提取采用商业化的ctdna提取试剂盒(qiagen公司《qiaampcirculatingnucleicacidkit》，货号55114)，将外周血提取成dna溶液，采用nonodrop测定dna1730/230质量，利用qubit仪器检测dna浓度。二、dna多重pcr文库制备利用步骤一中得到的dna样本和实施例1中获得的引物库进行建库，使用lifetech公司的《ampliseqlibrarykit》，按说明书进行操作，具体步骤如下：1)将dna按照如下体系配制：组分反应体系(20μl)高保真pcr缓冲液45倍浓度的引物库4ctdna，10ngy去离子水(12-y)总体积20备注：y为15ngdna所需加入的液体体积。2)将上述加入dna的反应液放入到热循环仪中按照如下程序进行反应：3)将2μlfupa溶液加入到上述得到的pcr反应液，混匀后放置于热循环仪中进行如下反应：温度时间50℃10min55℃10min60℃20min10℃保持(最多1小时)4)上述反应结束后，按照如下配方进行下一步反应液配制：组分体积switch溶液4μl稀释特异性标签混合液2μldna连接酶2μl总体积(包含22μl消化的扩增子)30μl5)将上述反应液放置于热循环仪中进行如下反应：温度时间22℃30min72℃10min10℃保持(最多1小时)6)上述反应结束后，按如下步骤进行纯化：a.打开pcr管或96孔板薄膜，每孔加60μl(2×样本体积)ampurexp磁珠，移液器上下吹打5次，将dna和磁珠充分混匀。b.混合液室温孵育5分钟。c.将混合液放到磁力架上，静置2分钟，直到混合液变清澈。小心去除上清，不要扰动磁珠。d.每管加150μl新配制70％乙醇，转动管壁，使磁珠从管壁的一侧转到另一侧，重复几次，吸弃上清，不要扰动磁珠。e.重复步骤d一次。f.确保所有乙醇被除尽，pcr管或96孔板放在磁力架上，室温空气干燥5分钟。7)待酒精完全干燥后，打开pcr管或96孔板薄膜，每孔加25μl高保真platinumpcr超级混合液，1μl文库扩增引物。高保真platinumpcr超级混合液和文库扩增引物可以提前混匀。8)将混合液放置于热循环仪上，进行如下反应：9)每管加12.5μl(0.5×样本体积)ampurexp磁珠，每管大约25μl样本。盖上pcr管或96孔板薄膜。涡旋混匀或移液器上下吹打5次混匀。10)室温孵育5分钟。11)将pcr管或96孔板放到磁力架上，至少5分钟，直到溶液澄清。12)紧接着上面步骤，每管加30μl(1.2×样本体积)ampurexp磁珠，每管大约25μl样本。盖上pcr管或96孔板薄膜。涡旋混匀或移液器上下吹打5次混匀。13)混合液室温孵育5分钟。14)将混合液放到磁力架上，静置2分钟，直到混合液变清澈。小心去除上清，不要扰动磁珠。15)每管加150μl新配制70％乙醇，转动管壁，使磁珠从管壁的一侧转到另一侧，重复几次，吸弃上清，不要扰动磁珠。16)重复步骤15)一次。17)确保所有乙醇被除尽，pcr管或96孔板放在磁力架上，室温空气干燥5分钟。18)各pcr管或96孔板每孔加25μl去核酸水溶解ampurexp磁珠，盖上pcr管或96孔板薄膜。涡旋混匀或移液器上下吹打5次混匀。19)将pcr管或96孔板放到磁力架上，至少2分钟，直到溶液澄清。小心吸取上清20μl，上清即文库，做好标记。20)将上述文库进行qubit仪器质控检测，并记录浓度。浓度低于0.2ng/μl的文库视为不合格文库。三、文库测序将上述文库按lifetech公司的pgm测序准备流程操作并进行测序。四、数据分析1)原始总数据经过机器拆分后，得到不同样本的原始测序数据。2)利用bwa软件对数据进行比对，比对到人类基因组数据库hg19参考序列上，同时筛除低于q30质量的数据。3)利用samtools对上述处理完毕后的数据进行进一步分析得到所需的snp及indel信息。4)利用falsefliter进行假阳性突变的过滤，生成最终的vcf文件。5)通过annovar软件对上述snp及indel进行注释，并结合clinvar、cosmic、pubmed等数据库整理突变意义信息。测序结果如下：样本编号q>20数据量测序reads数靶标区域覆盖度测序深度(×)均一性样本158993495856394786586％2351096％样本262461420455354777584％1968595％样本358290611505816966585％2138597％样本466378277205220061089％1919097％其中，平均深度在20000×左右，靶区域覆盖度在85％左右，文库测序均一性在96％左右。该覆盖度和均一性表示该发明所涉及的基因组合在ctdna中能良好进行检测。本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。序列表<110>珠海铂华生物工程有限公司<120>造血及淋巴组织肿瘤的ctdna高通量检测<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gctcaccagcctcaagacgtcggtt25<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gaactccagcagaggaactcagcgc25<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3actggcacagggtcacacaatctgg25<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gaagatgaagagcatgaacagggag25当前第1页12