本发明属于生物制药技术领域，特别涉及一种诱导葡萄球菌产生耐药性的方法。
背景技术：
目前，细菌出现耐药的情况越来越多，而在近二十年内，并没有新型抗生素药物的产生，现在生活中，抗生素的使用并没有得到很好的规范，而且现在研究的耐药菌多数从病科或者自然界分离提纯得到，对其进行耐药性分析需要耗费大量资金与试件，而且难以分析清楚其变异过程，故对人工微生物产生耐药性的研究就更加迫切，对耐药菌材料的需求也更加大。
目前做细菌耐药性诱导的方法主要有：1)物理法，如伽马射线诱导、紫外照射，这种诱导方法诱导出来的变异不定向，后续还需要经过进一步的筛选，并且放射剂量不好控制，容易造成细菌死亡，而且对设备、试验条件要求高，对实验人员伤害也大；2)化学法，如药物浓度梯度平板法，这种方法需要制备大量的试样，而且操作误差控制也比较难，空间占用率也高，对材料消耗也比较大，后期材料处理也不够；3)生物法，如基因工程，这种技术能够很大程度的解决变异不定向的问题，但其操作成本高、技术要求高并且操作繁琐。
技术实现要素：
本发明提供一种诱导葡萄球菌产生耐药性的方法，此方法可行性高，效果稳定，并且使用耗材少，操作简单。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案。
一种诱导葡萄球菌产生耐药性的方法，包括以下步骤：
(1)葡萄球菌菌种的选择：从动物病料中分离提纯葡萄球菌或者从实验室中随机选取葡萄球菌菌种作为实验原代菌；
(2)筛选抗生素：纸片扩散法进行实验原代菌的多种抗生素药敏实验，实验重复2～3次，筛选出实验原代菌的敏感抗生素，其敏感抗生素为头孢唑啉；
(3)抗生素标准品的溶液配制：将0.0256g头孢唑啉溶解与普通营养肉汤中，并将此溶液定容至50ml，制得浓度为512ug/ml的头孢唑啉药液；将制得的头孢唑啉药液分装在5ml离心管中，在环境温度为-20℃下保存；
(4)最小抑菌浓度的测定：微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度；
(5)传代诱导；
(6)耐药性测定，采用纸片扩散法测定每一代葡萄球菌对头孢唑啉的耐药性。
进一步地，步骤(4)具体包括如下步骤：
①将普通营养肉汤过夜培养的葡萄球菌菌液稀释10～100倍，制得接种悬液；
②对步骤(3)制得512ug/ml的头孢唑啉药液进行倍比稀释，稀释成浓度分别为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1ug/ml的头孢唑啉稀释药液；
③向灭菌后的多孔聚苯乙烯板中的孔中分别加入步骤②制备的头孢唑啉稀释药液，并将依次进行编号1～10号，并向盛有头孢唑啉稀释药液的孔中加入步骤①制备好的接种悬液，混合均匀；
④向多孔聚苯乙烯板中的空白孔中加入普通肉汤作为阴性对照，并编号11号；
⑤向多孔聚苯乙烯板中的空白孔中加入接种悬液为阳性对照，并编号12号；
⑥将多孔聚苯乙烯板置于37℃恒温培养箱中孵育12～24h，根据nccls标准判断mic值；
⑦将上述步骤重复2～3次，计算头孢唑啉的mic的平均值。
进一步地，步骤(5)具体包括如下步骤：
选取浓度比mic平均值小的菌液，作为第一代菌液，并吸取50～100ul到试管中；再向试管中加入100ul的浓度为1～2ug/ml的药液到试管中，然后再加入800ul～900ul普通营养肉汤，混合均匀，置于37℃恒温培养箱中孵育24小时，制得第二代菌悬液；重复上述步骤至55代。
本发明的有益效果为：本发明中实验操作需要的仪器设备少，并且后期材料处理难度也大大地降低了，因此本发明能够较好的解决操作难度和资金成本的问题，并且本发明提高了诱导效率、准确率和成功率；本发明中所述方法的操作也较其他方法更加便捷方法通俗易懂。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种诱导葡萄球菌产生耐药性的方法，包括以下步骤：
(1)葡萄球菌菌种的选择：从动物病料中分离提纯葡萄球菌或者从实验室中随机选取葡萄球菌菌种作为实验原代菌；
(2)筛选抗生素：纸片扩散法进行实验原代菌的多种抗生素药敏实验，实验重复2～3次，筛选出实验原代菌的敏感抗生素，其敏感抗生素为头孢唑啉；
(3)抗生素标准品的溶液配制：将0.0256g头孢唑啉溶解与普通营养肉汤中，并将此溶液定容至50ml，制得浓度为512ug/ml的头孢唑啉药液；将制得的头孢唑啉药液分装在5ml离心管中，在环境温度为-20℃下保存；
(4)最小抑菌浓度的测定：微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度；
(5)传代诱导；
(6)耐药性测定，采用纸片扩散法测定每一代葡萄球菌对头孢唑啉的耐药性。
进一步地，步骤(4)具体包括如下步骤：
①将普通营养肉汤过夜培养的葡萄球菌菌液稀释10～100倍，制得接种悬液；
②对步骤(3)制得512ug/ml的头孢唑林药液进行倍比稀释，稀释成浓度分别为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1ug/ml的头孢唑啉稀释药液；
③向灭菌后的多孔聚苯乙烯板中的孔中分别加入步骤②制备的头孢唑啉稀释药液，并将依次进行编号1～10号，并向盛有头孢唑啉稀释药液的孔中加入步骤①制备好的接种悬液，混合均匀；
④向多孔聚苯乙烯板中的空白孔中加入普通肉汤作为阴性对照，并编号11号；
⑤向多孔聚苯乙烯板中的空白孔中加入接种悬液为阳性对照，并编号12号；
⑥将多孔聚苯乙烯板置于37℃恒温培养箱中孵育24h，根据nccls标准判断mic值；
⑦将上述步骤重复2～3次，测得头孢唑啉的mic平均值为0.2ug/ml；
进一步地，步骤(5)具体包括如下步骤：
根据测得mic的平均值选取药液浓度值为0.1ug/ml的菌液，作为第一代菌液，并吸取100ul到试管中；再向试管中加入100ul的浓度为2ug/ml的药液到试管中，然后再加入800ul普通营养肉汤，混合均匀，置于37℃恒温培养箱中孵育24小时，制得第二代菌悬液；重复上述步骤至55代。
注意，在传代诱导的过程中，每代都均需划板，并且需要进行革兰氏染色镜检。
表1为实施例中细菌传代过程中抑菌圈数据记录数据，从表1中可以看出第一代菌、第十六代、第四十代及第五十五带菌的诱导情况都是有较大改变的，而诱导1代需要的时间是24h，从表1可以看出诱导葡萄球菌产生耐药性的整个过程一般不会超过60天，甚至少于55天，而传统诱导方法一般需要100天左右，因此可以看出本发明的诱导效率明显提高。
表1细菌传代过程中抑菌圈数据记录以及头孢唑啉抑菌圈解释标准
注：抗生素抑菌圈解释标准来源nccls-2017
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。