蛋白DEPDC1作为诊断三阴乳腺癌的标记物的用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种蛋白质，具体来说是蛋白depdc1作为诊断标记物的用途。

背景技术：

乳腺癌（bc）是一种最普遍的癌症，可以根据基因表达谱分为四种不同的类型：luminala亚型、luminalb亚型、her2过表达型和基底样乳腺癌（blbc）。三阴性乳腺癌（tnbc）的特点是缺乏er、pr和her2表达，属于基底样乳腺癌。tnbc侵袭性高、肿瘤体积和肿瘤负荷较大，相比其他亚型更易发生转移。目前，新发的tnbc诊断率在9%到16%，而年轻女性的发病率明显上升。然而tnbc对目前在临床实践中应用的靶向药物并不敏感，其主要治疗方法仍是化疗。因此，寻找特异性的致癌因素是为实现靶向治疗和改善三阴乳腺癌的临床预后效果而亟待解决的一个问题。

depdc1即含dep（dishevelled和egl-10、pleckstrin）结构域的蛋白质1，是在秀丽隐杆线虫乃至哺乳动物等多个物种中的一种高度保守的蛋白（具体信息和氨基酸序列见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/np_001107592.1）。尽管众多报道表明含有dep结构域的蛋白（散乱和egl-10，pleckstrin）可以调控多种细胞功能，包括大量的信号蛋白，depdc1的病理生理作用并没有得到完善的研究。自从kanehira等首次发现膀胱癌的新基因depdc1，并报道了其在膀胱癌细胞生长的重要作用，depdc1的重要功能及其可能的调控将被进一步阐明。mi等人发现depdc1是一个新的细胞周期相关基因，可调节有丝分裂。他们还发现在其他肿瘤如肝癌、大肠癌和胶质母细胞瘤中，depdc1与细胞的生长和凋亡相关，也许是一种新的诊断标志物或预后预测因子。然而，depdc1在乳腺癌中的功能知之甚微。

三阴乳腺癌的特征是雌激素受体、孕激素受体、her2基因都是阴性的，该类肿瘤恶性程度比其他亚型更高，目前还没有对其敏感的靶向药物。临床上三阴乳腺癌比其他类型乳腺癌预后更差，至今仍无有效治疗策略。所以，找出参与三阴乳腺癌发展过程中的重要调控因子是非常必要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供蛋白depdc1作为诊断标记物的用途，所述的这种蛋白depdc1作为诊断标记物的用途要解决现有技术中对于诊断、治疗三阴乳腺癌的效果不佳的技术问题。

本发明提供了蛋白depdc1作为诊断三阴乳腺癌的标记物的用途。

本发明还提供了蛋白depdc1作为标记物在制备诊断三阴乳腺癌的试剂中的用途。

本发明还提供了mir-26b在制备抑制depdc1mrna表达的药物中的用途。

本发明还提供了mir-26b在制备治疗三阴乳腺癌的药物中的用途。

具体的，所述的mir-26b基因序列如seqidno.1所示。

具体的，所述的蛋白depdc1的氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明通过westernblotting和实时定量pcr检测depdc1和mir-26b的表达情况。本发明还应用了荧光素酶报告基因检测来确定mir-26b和depdc1之间的相互作用，并在体内和体外两个方面都确定了depdc1和mir-26b在细胞增殖和肿瘤成瘤方面的作用。

本发明发现在三阴乳腺癌组织中，depdc1表达明显高于配对的癌旁组织。三阴乳腺癌细胞中过表达depdc1可以通过上调foxm1表达促进细胞生长和肿瘤形成。相反，敲低depdc1后显示相反作用。而且，三阴乳腺癌中mir-26b作为肿瘤抑制因子能够直接抑制depdc1表达并减弱depdc1对细胞生长和克隆形成的促进作用。

本发明的研究结果表明：depdc1通常在三阴性乳腺癌中表达上调，它可促进细胞生长和集落形成，是tnbc的致癌因子。通过本发明的研究显示，在tnbc中，mir-26b对depdc1的负调控。在foxm1介导下depdc1对细胞增殖具有促进作用。这些结果为提高tnbc的治疗疗效提供新的治疗靶点。

本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明的结果显示，mir-26b负性调节的depdc1通过上调foxm1表达，促进细胞增殖和肿瘤形成，为三阴乳腺癌的发生发展调控指出了一条新的重要机制。

附图说明

图1：depdc1在三阴乳腺癌中作为一个促癌因子上调。a和b分别显示了depdc1在10对三阴乳腺癌癌组织和配对的非肿瘤组织中的表达情况。c和d分别显示了depdc1在33对三阴乳腺癌癌组织和配对的非肿瘤组织中的表达情况。e和f分别显示了在三阴乳腺癌组织中depdc1和细胞生长标志物（pcna和ki67）的相关性。g和h和i分别显示了在三阴乳腺癌组织中depdc1和细胞周期相关基因（ccna2,、ccnb1和ccne2）之间的相关性。

图2：在mda-mb-436细胞中构建depdc1过表达的细胞系。a:在一系列三阴乳腺癌细胞系中depdc1的mrna表达水平。b和c分别显示了在mda-mb-436细胞中通过mrna表达水平（图b）和蛋白表达水平（图c）验证depdc1过表达的效率。

图3：depdc1过表达促进三阴乳腺癌细胞增殖和肿瘤生长。a显示了在mda-mb-436细胞中depdc1过表达导致细胞活力增加。b显示了brdu嵌入合成的dna的能力也被过表达depdc1所增强。c显示了和对照组相比depdc1过表达可以上调pcna蛋白的表达。d显示了过表达depdc1抑制进入g0/g1期细胞的比例，增加进入s期的细胞数目。e显示了depdc1过表达促进mda-mb-436细胞克隆形成。标尺：100微米。f显示了按预定分组从裸鼠分离的代表性肿瘤。g和h分别显示了过表达depdc1增加移植肿瘤的体积（图g）和重量（图h）。

图4：在mda-mb-231细胞中应用实时定量pcr和免疫印迹方法验证depdc1的敲除效率。a和b分别显示了在mda-mb-231细胞中用shrna技术敲除depdc1后对mrna和蛋白表达水平的检测。

图5：在三阴乳腺癌细胞中敲除depdc1抑制细胞增殖和克隆形成。a显示了敲除depdc1显著抑制细胞生长。b显示了在mda-mb-231细胞中敲除depdc1抑制brdu嵌入合成的dna中。c显示了敲除depdc1后下调pcna的表达。d显示了敲除depdc1抑制细胞周期进程，使更多细胞停留在g0/g1期。e显示了在mda-mb-231细胞中克隆形成能力在敲除depdc1后被减弱。标尺：100微米。f显示了按指定分组从裸鼠中分离的代表性肿瘤。g和h分别显示了敲除depdc1后皮下成瘤的体积（图g）和重量（图h）都下降。

图6：在三阴乳腺癌细胞中depdc1被mir-26b直接下调。a显示了候选的depdc1功能调控因子示意图。b显示了三阴乳腺癌组织和配对癌旁组织中mir-26b表达情况。c显示了在相同的三阴乳腺癌组织中mir-26b和depdc1表达的相关性。d显示了depdc1的3’非转录区mir-26b的潜在结合位点。e显示了荧光素酶报告检测显示mir-26b显著降低野生型3’非转录区质粒的荧光素酶活性，然而突变质粒的荧光素酶活性没有变化。f和g分别显示了在mda-mb-231细胞中mir-26b抑制depdc1的mrna（图h）和蛋白（图i）表达水平。h和i分别显示了在mda-mb-436细胞中用anti-mir-26b处理后增加depdc1的表达水平。

图7：在三阴乳腺癌细胞中mir-26b抑制的细胞增殖和克隆形成可以被depdc1过表达所减弱。a显示了在mda-mb-436细胞中抑制mir-26b导致细胞活力的增加。b显示了抑制mir-26b促进brdu吸入。c显示了抑制mir-26b可以增加pcna蛋白表达。d：anti-mir-26b可以促进mda-mb-436细胞的克隆形成。标尺：100微米。e显示了重新加入depdc1后mir-26b抑制的细胞生长作用可以被减弱。f和g分别显示了mir-26b在brdu吸入（图f）和pcna蛋白表达（图g）中的抑制作用可以被过表达depdc1所拮抗。h显示了在mda-mb-231细胞中mir-26b处理后可以抑制克隆形成，这一作用可以被depdc1过表达所逆转。标尺：100微米。

图8：在三阴乳腺癌中depdc1通过上调foxm1表达促进细胞生长和增殖。a和b分别显示了和配对的非肿瘤组织相比在三阴乳腺癌组织中foxm1表达明显上调。c显示了在相同的三阴乳腺癌组织中foxm1和depdc1之间的表达具有相关性。d显示了在三阴乳腺癌细胞中过表达depdc1可以促进foxm1表达。e显示了敲除depdc1后foxm1的蛋白水平被抑制。f和g分别显示了foxm1的mrna和蛋白表达水平都用来验证sifoxm1的敲除效率。h显示了depdc1过表达所增加的细胞活力被sifoxm1减弱。i显示了depdc1所促进的brdu嵌入合成dna被sifoxm1拮抗。j显示了过表达depdc1对pcna表达的促进作用被sifoxm1所减弱。

具体实施方式

一、材料和方法

1、细胞培养和临床样本

mda-mb-231、mda-mb-436、mda-mb-468、mda-mb-157、mda-mb-435和bt549细胞（人类tnbc细胞株）从americantissueculturecollection（美国马纳萨斯）。所有细胞株均在5%co2、37℃的含10%胎牛血清（fbs）的dulbecco改良培养基（dmem）中培养。

2、cck-8

细胞接种于96孔培养板，每孔2×10³细胞/孔，在37℃、5%co2条件下孵育。细胞活性检测采用cellcountingkit-8（cck-8；同仁化学研究所），按照制造商程序在不同时间点进行。随后测定450nm处的吸光度。

3、brdu嵌入实验

以5000个/孔的密度将细胞接种在96孔微孔板，允许附加过夜。通过使用细胞增殖elisa试剂盒（罗氏）使5’-溴-2'-脱氧尿嘧啶核苷（brdu）掺入新合成的dna，以评估细胞增殖。使用酶标仪（百特sinergyht）测定595nm处的光密度，并以对照组的百分比表示增殖率。

4、蛋白质免疫印迹

用冷pbs将细胞洗涤三次，使用细胞裂解缓冲液（ripa）和细胞匙收细胞，并通过bca方法定量。同等质量的的蛋白质提取物（50μg）使用聚丙烯酰胺凝胶电泳80mv90分钟，再于室温下100mv60分钟转移至硝酸纤维素膜。于5%脱脂牛奶中封闭，然后与一抗孵育过夜。随后用pbs-t于30分钟内洗涤5次，与抗兔或抗小鼠二抗（santacruzbiotechnology）孵育1小时。再次pbs-t于30分钟内洗涤5次，使用增强化学发光法（ecl）检测免疫复合物。

5、rna抽提与实时荧光定量pcr

按照预先设定的程序，使用trizol（英杰）提取总rna；使用ambionmirnarna抽提试剂盒提取微小rna（mirna）（14）。mirna反转录以及qrt-pcr使用taqmanmirna反转录试剂盒（美国加州卡尔斯巴德，appliedbio-systems）和taqman预混合物（日本滋贺，takara）。mir-26b和snrnau6（内参）的特异性反转录引物和qrt-pcrtaqman探针均从appliedbiosystems购入。进行mrna分析时，总rna使用takara的prime-scriptrt试剂盒以反转录，并使用sybrgreenreal-timepcrmastermix（appliedbio-systems）扩增样本。β-actin作为mrna水平的内参。

6、细胞周期分析

收集细胞（1×10⁶），通过胰酶消化后重新悬浮于pbs。70%冷乙醇-20℃固定至少1.5小时后，用pi染色体系（40μg/mlpi，100μg/ml核糖核酸酶a以及0.1%tritonx-100）37℃1小时染色，随后使用流式细胞仪对细胞周期分布进行分析。通过epicsaltra流式细胞仪进行流式分析，并通过expo32multicomp和expo32v1.2analysis软件（beckmancoulter）分析结果。

7、克隆形成实验

通过软琼脂克隆形成实验检测细胞生长能力。在铺有0.8%琼脂糖（下层）、0.4%琼脂糖（上层）的24孔板中加入20%fbsdmem培养基，每孔接种3×10³个悬浮细胞。21天后观察形成的克隆，并在40倍放大镜下计数，只计入清晰可见的克隆（直径>50µm）。

8、荧光素酶报告基因检测

于24孔培养板接种hek-293t细胞，大约1×10⁵个/孔。过夜，使用lipofectamine2000（英杰）将细胞与200ng报告基因载体、5ngprl-cmv（美国promega，内部标准）和5nmmir-26b类似物或对照（美国ambion）共转染。24小时后使用双荧光素酶报告基因系统（promega）测量荧光素酶活性。报告基因的荧光素酶活性应在所有样本中按照内参renilla荧光素酶活性标准化。

9、裸鼠移植瘤模型

用六至八周龄的雌性balb/c裸鼠（斯坦福直线加速器中心，中国上海）建立乳腺癌移植瘤模型。所有实验动物相关程序由上海交通大学实验动物护理和使用委员会（iacuc）批准。将小鼠随机分组（n=6），分别将100μlpbs中悬浮的5 × 10⁶个depdc1过表达和载体mda-mb-436细胞或shdepdc1和shcontrolmda-mb-231细胞于小鼠腹部皮下注射，30天后处死小鼠，测量肿瘤的质量和体积。所有动物研究均在仁济医院动物护理指南下进行，尽量减少动物的痛苦。

10、统计分析

通过windowsgraphpadprismv5.0进行统计学分析（graphpad软件有限公司，美国加州圣地亚哥）。所有数据均通过至少三次独立实验，表示为均值±均值标准差（s.e.m.）。统计分析采用两组样本的t检验或多组样本的单因素方差分析dunnett检验，p＜0.05被认为具有统计学意义。

实施例1depdc1在三阴乳腺癌中上调

为明确三阴乳腺癌中depdc1的作用，本发明分析了geneexpressionomnibus(网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)上面的两套芯片（gse76250和gse81838）的数据，明确了三阴乳腺癌和配对癌旁组织中depdc1的表达情况。正如图1a和1b所示，与配对的癌旁组织相比，在三阴乳腺癌的组织中depdc1表达明显增加。其他数据库中也可以得到相类似的结果。

在33对三阴乳腺癌和癌旁组织中，本发明发现大多数三阴乳腺癌组织中depdc1表达都高于癌旁组织（见图1c和1d）。而且，在165例三阴乳腺癌组织中pcna（细胞核增殖抗原）的表达和ki67（一种增殖的标志物，表示肿瘤细胞生长的重要指标）的表达都与depdc1的表达正相关（见图1e和1f）。并且在三阴乳腺癌组织中depdc1表达水平和其他细胞周期相关基因（ccna2、ccnb1和ccne2）表达水平也显著相关（见图1g-1i）。这些结果说明depdc1似乎可以作为一个促癌因子调控三阴乳腺癌进展过程。

实施例2在三阴乳腺癌细胞中depdc1过表达可以促进细胞增殖和克隆形成。

然后本发明在一组三阴乳腺癌细胞系中检测depdc1的mrna表达。在这些细胞中，mda-mb-231中内源性depdc1的表达明显高于其他细胞系，而在mda-mb-436细胞中depdc1的表达是最低的（见图2a）。所以，在mda-mb-436细胞中构建了depdc1稳定过表达细胞系。

实时定量pcr和westernblot方法分别检测depdc1的mrna和蛋白表达水平以确认转染效率（图2b和2c）。正如图3a所示，cck-8检测的结果表明depdc1过表达后细胞活力明显增加。brdu嵌入实验和pcna表达用来检测细胞增殖能力。

本发明发现depdc1过表达后可以增加嵌入新和成dna中brdu的量并且能诱导pcna的表达（图3b和3c）。而且，本发明还通过流式细胞仪研究了细胞周期的分布情况，结果显示过表达depdc1使g0/g1相细胞数目从70.21下降到49.82，而depdc1过表达使s期细胞比例从20.44%增加到36.55%（图3d）。

体外实验发现，在mda-mb-436细胞中depdc1过表达能促进克隆形成（图3e）。并且本发明还构建了裸鼠皮下成瘤模型，应用体内实验检测depdc1在肿瘤生长中的作用（图3f）。

本发明的结果表明depdc1过表达可以明显增加mda-mb-436细胞的成瘤能力，与对照组相比，肿瘤体积（图3g）和重量（图3h）都有所增加。总之，这些结果提示depdc1过表达可以通过加速三阴乳腺癌细胞的细胞周期进程促进细胞生长和肿瘤形成。

实施例3三阴乳腺癌中敲除depdc1可以减弱细胞增殖

为了确定再三阴乳腺癌中depdc1的生理功能，本发明还在mda-mb-231细胞中敲低了depdc的表达。敲除的效率也通过实时定量pcr和westernblot确定（图4a和图4b）。如图5a所示，敲低depdc1可以抑制mda-mb-231细胞的生长。而且brdu吸入和pcna蛋白表达水平都被敲除depdc1所减弱（图5b和5c）。细胞周期分布的结果显示敲低depdc1表达使处于g0/g1期生长停滞的肿瘤细胞比例增加（从56.31%到78.52%），同时伴随着s期细胞从32.41%下降到16.31%（图5d）。

如图5e所示，在mda-mb-231细胞中敲除depdc1克隆形成被抑制（图5e）。而且，裸鼠皮下成瘤的结果显示敲除depdc1明显抑制mda-mb-231细胞的肿瘤源性（图5f）。相一致的是，敲除depdc1后肿瘤体积和重量也都显著降低（图5g和5h）。这些结果提示在三阴乳腺癌细胞中敲除depdc1抑制细胞增殖和成瘤能力。

实施例4在三阴乳腺癌中depdc1表达被microrna-26b负性调控

microrna是它们靶基因的负向调控因子，通过结合靶基因的3’utr区发挥作用。为了确定depdc1在三阴乳腺癌中的上游调控因子，本发明应用了targetscan(http://www.targetscan.org/)和miranda(http://www.microrna.org)来预测能够与depdc1潜在结合的microrna。结合这些microrna在三阴乳腺癌组织中的表达（组织选取自数据库gse76250），本发明发现microrna26b的表达明显下调，并且在相同的三阴乳腺癌组织中其表达与depdc1的表达负相关，进而说明mir-26b很可能是depdc1的一个功能调节因子（图6a-6c）。

本发明进一步检测了depdc1是否能够直接被mir-26b所调节，正如图6d所示，在depdc1的3’utr区存在mir-26b的潜在结合位点，luciferase报告基因结果显示mir-26b能够显著的抑制携带野生型depdc13’utr的质粒的荧光素酶活性，而突变型质粒的活性并没有被明显改变，说明mir-26b能够直接结合在预测的depdc1的3’utr区（图6e）。而且，mir-26b能够明显的抑制depdc1mrna和蛋白的表达，而应用一个mir-26b的抑制剂（anti-mir-26b）能够导致乳腺癌细胞内depdc1的表达增加（图6f-6i）。这些结果表明在三阴乳腺癌中mir-26b能够作为depdc1的一个负向调控因子抑制其表达。

实施例5mir-26b通过靶向depdc1抑制三阴乳腺癌细胞增殖

本发明进一步研究了mir-26b在三阴乳腺癌细胞增殖中的作用。正如图7a所示，在mda-mb-436细胞中抑制mir-26b能够导致细胞活力的增加（图7a）。并且brdu嵌入合成的dna和pcna的蛋白表达在抑制mir-26b以后明显增加（图7b和7c）。而且，经anti-mir-26b处理的mda-mb-436细胞克隆形成能力被明显增强（图7d）。相反的是，mir-26b能够抑制mda-mb-231细胞活力，但是这一抑制作用在给予depdc1后被去除（图7e）。而且，mir-26b能够抑制brdu嵌入、减弱pcna蛋白表达和抑制细胞克隆形成，而mir-26b对细胞增殖和克隆形成的抑制作用在恢复depdc1表达后被明显逆转（图7f-7h）。这些结果说明mir-26b能够通过降低depdc1的表达抑制三阴乳腺癌细胞的增殖和进展。

实施例6在三阴乳腺癌细胞中depdc1能促进foxm1的表达

前期有结果表明depdc1与foxm1之间存在相互作用，并且foxm1作为重要的介导分子调控细胞周期的进展。为了阐述depdc1促进细胞增殖和细胞周期前进的潜在机制，本发明然后检测了是否在三阴乳腺癌细胞中depdc1和foxm1存在着联系。正如图8a和8b所示，foxm1在三阴乳腺癌组织中的表达相对于正常的癌旁组织明显增加。并且在相同的三阴乳腺癌组织中foxm1的表达与depdc1的表达呈正相关（图8c）。而且在三阴乳腺癌细胞中过表达depdc1能够增强foxm1的表达，而敲低depdc1能抑制其表达（图8d和8e）。以上结果说明在三阴乳腺癌中depdc1能够正向调控foxm1的表达。

实施例7depdc1对细胞增殖的促进作用在敲减foxm1后被明显减弱

为了探究foxm1在depdc1促进细胞增殖过程中的作用，本发明应用了foxm1的sirna来抑制其表达，real-timepcr和westernblot用来确定敲减的效率（图8f和8g）。本发明发现，过表达depdc1所引起的细胞活力增加在干扰掉foxm1后被明显减弱（图8h）。并且敲减foxm1能够抵消过表达depdc1所促进的细胞增殖（图8i和8j）。这些结果说明depdc1对细胞增殖的促进作用至少是部分由foxm1所介导的。

结论

总之，本发明的研究表明在三阴乳腺癌组织中上调的depdc1能够增加foxm1的表达来促进肿瘤细胞的生长和增殖，并且depdc1能够被mir-26b所负向调控。这些结果证实了depdc1在调节三阴乳腺癌细胞生长的作用，并且阐述了相关的分子机制，进而可能为将来三阴乳腺癌的分子治疗提供新的潜在治疗靶点。

序列表

<110>上海交通大学医学院附属仁济医院

<120>蛋白depdc1作为诊断三阴乳腺癌的标记物的用途

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>rna

<213>智人(homosapiens)

<400>1

uucaaguaauucaggauaggu21

<210>2

<211>811

<212>prt

<213>智人(homosapiens)

<400>2

metgluserglnglyvalproproglyprotyrargalathrlysleu

151015

trpasngluvalthrthrserpheargalaglymetproleuarglys

202530

hisargglnhisphelyslystyrglyasncysphethralaglyglu

354045

alavalasptrpleutyraspleuleuargasnasnserasnphegly

505560

progluvalthrargglnglnthrileglnleuleuarglyspheleu

65707580

lysasnhisvalilegluaspilelysglyargtrpglysergluasn

859095

valaspaspasnasnglnleupheargpheproalathrserproleu

100105110

lysthrleuproargargtyrprogluleuarglysasnasnileglu

115120125

asnpheserlysasplysaspserilephelysleuargasnleuser

130135140

argargthrprolysarghisglyleuhisleuserglngluasngly

145150155160

glulysilelyshisgluileileasngluaspglngluasnalaile

165170175

aspasnarggluleuserglngluaspvalglugluvaltrpargtyr

180185190

valileleuiletyrleuglnthrileleuglyvalproserleuglu

195200205

gluvalileasnprolysglnvalileproglntyrilemettyrasn

210215220

metalaasnthrserlysargglyvalvalileleuglnasnlysser

225230235240

aspaspleuprohistrpvalleuseralametlyscysleualaasn

245250255

trpproargserasnaspmetasnasnprothrtyrvalglypheglu

260265270

argaspvalpheargthrilealaasptyrpheleuaspleuproglu

275280285

proleuleuthrpheglutyrtyrgluleuphevalasnileleuval

290295300

valcysglytyrilethrvalseraspargserserglyilehislys

305310315320

ileglnaspaspproglnserserlyspheleuhisleuasnasnleu

325330335

asnserphelysserthrglucysleuleuleuserleuleuhisarg

340345350

glulysasnlysglugluseraspserthrgluargleuglnileser

355360365

asnproglypheglngluargcysalalyslysmetglnleuvalasn

370375380

leuargasnargargvalseralaasnaspilemetglyglysercys

385390395400

hisasnleuileglyleuserasnmethisaspleuserserasnser

405410415

lysproargcyscysserleugluglyilevalaspvalproglyasn

420425430

serserlysglualaserservalphehisglnserpheproasnile

435440445

gluglyglnasnasnlysleupheleugluserlysprolysglnglu

450455460

pheleuleuasnleuhisserglugluasnileglnlyspropheser

465470475480

alaglyphelysargthrserthrleuthrvalglnaspglngluglu

485490495

leucysasnglylyscyslysserlysglnleucysargserglnser

500505510

leuleuleuargserserthrargargasnsertyrileasnthrpro

515520525

valalagluileilemetlysproasnvalglyglnglyserthrser

530535540

valglnthralametglusergluleuglygluserseralathrile

545550555560

asnlysargleucyslysserthrilegluleusergluasnserleu

565570575

leuproalasersermetleuthrglythrglnserleuleuglnpro

580585590

hisleugluargvalalaileaspalaleuglnleucyscysleuleu

595600605

leuproproproasnargarglysleuglnleuleumetargmetile

610615620

serargmetserglnasnvalaspmetprolysleuhisaspalamet

625630635640

glythrargserleumetilehisthrpheserargcysvalleucys

645650655

cysalaglugluvalaspleuaspgluleuleualaglyargleuval

660665670

serpheleumetasphishisglngluileleuglnvalprosertyr

675680685

leuglnthralavalglulyshisleuasptyrleulyslysglyhis

690695700

ilegluasnproglyaspglyleuphealaproleuprothrtyrser

705710715720

tyrcyslysglnileseralaglnglupheaspgluglnlysvalser

725730735

thrserglnalaalailealagluleuleugluasnileilelysasn

740745750

argserleuproleulysglulysarglyslysleulysglnphegln

755760765

lysglutyrproleuiletyrglnlysargpheprothrthrgluser

770775780

glualaalaleupheglyasplysprothrilelysglnprometleu

785790795800

ileleuarglysprolyspheargserleuarg

805810