一种猪圆环病毒3型的聚合酶螺旋扩增检测试剂及检测方法与流程

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒3型的聚合酶螺旋扩增检测试剂及检测方法。

背景技术：

猪圆环病毒(porcinecircovirus，pcv)是一种单链环状dna病毒，无囊膜，成熟的病毒粒子由60个核衣壳蛋白(capsidprotein，cap)亚基组装成一个直径为17～20nm的正二十面体的球形颗粒，编码两个主要的开放阅读框(orfs)：cap和rep(和病毒复制相关的酶)。cap是pcv唯一的结构蛋白和主要抗原，由232～234个氨基酸残基组成，相对分子质量约为27ku。pcv最早是由德国学者从猪肾上皮细胞(pk15)中分离得到的非致病性病毒粒子里pcv1，后来加拿大学者报道了断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome，pmws)的出现，并证实pcv2为主要病原，随后pcv2在全世界广泛分布，给全球养殖业带来了巨大的经济损失。与pcv2相关的疾病包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome，pmws)、猪皮炎肾病综合征(porcinedermatitisandnephropathysyndrome，pdns)、呼吸系统疾病(respiratorydisease)、繁殖障碍(reproductivefailure)和肠道疾病(entericdisease)等。2016年10月，美国学者palinski和phan报道了一种新的pcv基因型，又称pcv3，该病毒从出现病症的母猪或仔猪中分离得到，同时pcv2检测为阴性。

2017年，我国学者deng等采用间接elisa对我国猪群开展了pcv3的血清学调查，结果发现，2015-2017年间，我国猪群pcv3的感染率从22.35％上升到51.88％，表明pcv3已经在我国猪群流行和扩散，防控形势非常严峻。据报道，pcv3可导致母猪厌食、皮炎肾病综合征、繁殖障碍，如流产、产木乃伊胎、死胎、弱仔等症状，鉴于pcv3型和pcv2型所引起的临床症状十分相似，在临床上很难区分，且pcv3呈现多地域感染的现状，因此建立快速、准确的pcv3相关诊断方法是防控和诊断pcv3的基础。

有关pcv3的检测技术的研究主要从免疫学技术和分子生物学两个方面进行探讨。其中palinski等利用pcv3特异性单克隆抗体染色患病猪组织切片，建立了免疫组化方法，利用原核表达的pcv3cap蛋白包被elisa板，建立了检测pcv3抗体的间接elisa方法，针对cap蛋白制备单克隆抗体，建立了免疫荧光检测方法。分子生物学检测技术主要包括pcr、荧光定量pcr、原位杂交等。

目前核酸扩增是基因诊断技术中最常用的方法之一，常用方法有聚合酶链式反应(pcr)、依赖核酸序列扩增(nasba)、自主序列复制(sr)以及链置换技术(sda)等，都能将微量标本进行快速扩增，但在特异性、简便程度、温度和试剂仪器要求等方面各有缺点。本发明所涉及的聚合酶螺旋扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,psr)是2000年由日本notomi等人开发出来的一种体外核酸扩增的新型技术，它能够在90min内，水浴锅环境等温条件下，把拷贝数很低的dna片段扩增到10⁹个拷贝。

聚合酶螺旋扩增技术是当前应用最为广泛的一种核酸快速扩增的新型技术之一，与主流的pcr技术有着根本不同的设计思路，利用bstdnapolymerase在延伸dna的同时对目的片段进行链置换扩增，不需要双链dna模板的预变性、退火及繁琐的循环变温过程，整个反应在恒温条件(61～65℃左右)下几十分钟即可完成核酸扩增，扩增效率一般高达到10⁹-10¹⁰个数量级，大量的核酸产物可使反应结果通过在终产物中加入核酸染料的方法直接用肉眼观察。随着研究人员对psr技术认识的深入，psr技术还在快速地发展与优化，在疾病致病原基因诊断、食品安全分析和环境监测等领域发挥着越来越重要的作用。由于psr检测技术在各项检测上的优越性，人们已经将它广泛应用到病原体检测、动物胚胎性别的鉴定、转基因食品检测以及肿瘤基因检测等各个领域，psr检测技术具有非常高的应用价值。psr检测技术操作简单、用时短、准确率高，相当适合养殖场现场操作，这项技术的应用将大大降低畜牧业的发展成本，减少其经济损失，从而提供相当高的经济效益。因此，建立一种实际应用性强的检测技术在基层推广应用，具有很强的临床意义。

技术实现要素：

为克服普通检测效率低、难操作、成本高的缺陷，本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒3型的聚合酶螺旋扩增检测试剂，应用该试剂进行检测时，检测时间短，特异性和敏感性高，操作方便且成本低。

本发明的第一个目的是提供用于检测猪圆环病毒3型的聚合酶螺旋扩增引物组，所述引物组由以下引物组成：

上游引物s1：acgaattcgtacatagaagtataggtcttggagccaagtgtttgtg；

下游引物s2：gatatgaagatacatgcttaagcacttcattacccgcctaaacgag。

本发明的第二个目的是提供一种猪圆环病毒3型病毒的聚合酶螺旋扩增检测试剂，所述试剂包括权利要求1所述的引物组。

作为优选，所述试剂还包括如下组分：10×bstbuffer反应缓冲液、dntps、mg²⁺、bstdna聚合酶、去离子水、模板dna和显色试剂。

作为优选，所述试剂中mg²⁺的浓度为6mm。

作为优选，所述试剂中dntps的浓度为1.5mm；

作为优选，所述试剂中显色试剂为0.025mm酚红和0.08mm甲酚红混合指示剂。

作为优选，所述试剂还包括阳性对照。

本发明的第三个目的是提供一种猪圆环病毒3型的聚合酶螺旋扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求2-6任一项所述的聚合酶螺旋扩增检测试剂。

本发明的第四个目的是提供上述检测试剂或检测试剂盒在如下任一中的应用：

(1)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测猪圆环病毒3型病毒；

(2)制备用于检测或辅助检测猪圆环病毒3型的产品；

(3)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测待测动物样品是否感染猪圆环病毒3型；

(4)制备用于检测或辅助检测待测动物样品是否感染猪圆环病毒3型的产品；

(5)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测待测病毒是否为猪圆环病毒3型；

(6)制备用于检测或辅助检测待测病毒是否为猪圆环病毒3型的产品。

本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测待测动物样品是否感染猪圆环病毒3型的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：

(1)从待测动物样品中提取基因组dna作为模板，采用权利要求2-6任一项所述的检测试剂或权利要求7所述的检测试剂盒进行聚合酶螺旋扩增，得到扩增产物；作为优选，所述聚合酶螺旋扩增的反应条件为恒温62℃作用50min；

(2)按照下述任一方法确定待测动物样品是否感染猪圆环病毒3型：

a、扩增产物呈现橙黄色则待测动物样品感染猪圆环病毒3型；扩增产物呈现紫红色则待测动物样品未感染猪圆环病毒3型；

b、将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带呈梯状分布，则待测动物样品感染猪圆环病毒3型；仅有一条引物条带，则待测动物样品未感染猪圆环病毒3型。

本发明的第六个目的是提供一种检测或辅助检测待测病毒为猪圆环病毒3型的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：

(1)从待测病毒中提取基因组dna作为模板，采用权利要求2-6任一项所述的检测试剂或权利要求7所述的检测试剂盒进行聚合酶螺旋扩增，得到扩增产物；作为优选，所述聚合酶螺旋扩增的反应条件为恒温62℃作用50min；

(2)按照下述任一方法确定待测病毒是否为猪圆环病毒3型：

a、扩增产物呈现橙黄色则待测病毒是猪圆环病毒3型病毒；扩增产物呈现紫红色则待测病毒不是猪圆环病毒3型；

b、将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带呈梯状分布，则待测动物病毒是猪圆环病毒3型；仅有一条引物条带，则待测病毒不是猪圆环病毒3型。

本发明的有益效果如下：

本发明检测猪圆环病毒3型的聚合酶螺旋试剂盒具有高灵敏性：将pcv3的orf质粒标准dna进行10倍梯度稀释后作为psr反应模板，以同样的模板浓度用pcr方法进行检测，结果表明：psr方法比常规pcr扩增的方法至少高100倍。由此可见，本发明psr方法具有更高的灵敏度。

本发明检测猪圆环病毒3型的聚合酶螺旋试剂盒具有高特异性：将临床上常见的猪类病毒性疾病：伪狂犬病病毒(prv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪圆环病毒2型(pcv2)、猪瘟(csfv)、猪流行性腹泻病毒(pedv)分别作为检测对象，用本发明的方法进行检测，仅pcv3为阳性，表明该方法具有高特异性。

本发明检测猪圆环病毒3型的聚合酶螺旋试剂具有快速性：相对普通pcr反应数小时的反应时间和检测时间，本发明检测方法仅需50min即可完成整个反应和结果判定。

本发明检测猪圆环病毒3型的聚合酶螺旋试剂具有可操作性：相对于常规pcr，猪圆环病毒3型聚合酶螺旋扩检测试剂不需要昂贵的pcr仪，只需要一个简单的恒温水浴锅即可完成反应；且结果检测可以直接肉眼判定，无需凝胶电泳等特殊仪器，因此本发明试剂盒具有较强的可操作性。

本发明检测方法容易操作，成本低廉，可广泛应用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为pcv3基因保守区psr扩增图。

图2为pcv3psr反应特异性试验图。

图3为pcv3psr反应产物的酶切鉴定结果图。

图4为pcv3psr反应灵敏度试验图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

1、试剂相关材料

猪圆环病毒3型为实验室分离保存毒株。病毒基因组dna/rna提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，betaine(sigma公司)，bstdna聚合酶及10×bstbuffer反应缓冲液(biolabsinc公司)，dntp(clontech公司)，mg²⁺及dl2000(takara公司)。显色试剂为0.025mm酚红和0.08mm甲酚红混合染色液，均购自solarbio公司。

2、psr引物的设计与合成

参考目前已发表的猪圆环病毒3型病毒序列，针对pcv3病毒属的orf2基因特异性保守区域，利用引物设计软件oligo7分别设计2条引物，引物包括上游引物s1、下游内引物s2，序列分别如下：

s1：acgaattcgtacatagaagtataggtcttggagccaagtgtttgtg

s2：gatatgaagatacatgcttaagcacttcattacccgcctaaacgag

设计完成的引物由北京奥科生物工程公司合成，合成后的引物用超纯水稀释成10mm溶液，-20℃保存。

3、病毒基因组提取

利用北京全式金生物技术有限公司的病毒基因组dna/rna提取试剂盒，提取细胞培养猪圆环病毒3型病毒液、疑似有猪圆环病毒3型病毒感染的患病猪只肺脏脾脏等组织样品、特异性对照病毒样品的病毒基因组dna。

4、猪圆环病毒3型psr反应体系的建立

猪圆环病毒3型检测试剂包括如下组分：

其中，阳性对照为猪圆环病毒3型样品的基因组dna。

显色试剂为0.025mm酚红和0.08mm甲酚红混合指示剂。

将上述组分混匀后放置于pcr仪内或者水浴锅中恒温62℃作用50min；反应结束后，可以将扩增产物用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml的溴化乙锭)电泳检测，电泳条件为80v、30min；也可直接肉眼观察其颜色变色，两者判定结果一致。肉眼观察时，阳性结果显示为橙黄色，阴性结果显示为紫红色。

电泳检测结果如图1所示，电泳条带呈梯状分布，与理论结果相符，阴性对照的扩增结果只有引物二聚体出现。

图1为pcv3基因保守区psr扩增图。其中m：dna分子量标准dl2000；1：pcv3毒株扩增结果；2：阴性对照。

5、pcv3psr检测方法条件的优化

5.1反应时间优化

配置反应体系，在恒温水浴锅中，在恒温62℃下，分别反应20min、30min、40min、50min、60min后取出，待反应产物全部取出后，各取5μl产物，用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml的溴化乙锭)电泳对反应产物进行检测。

5.2反应温度的优化

配置反应体系，分别在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃五个反应温度中恒温反应1小时，反应结束后各取5μl产物进行2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml的溴化乙锭)电泳检测。

5.3反应中各重要组分浓度的优化

在25μl反应体系中，引物浓度、反应所需酶单位与所用模板浓度不变，改变组分mgso4的浓度，摸索mgso4浓度对扩增效率的影响，加入量依次为7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0mm，每个浓度梯度设置3个重复。待所有浓度梯度反应结束后，进行2％琼脂糖凝胶电泳检测；设置不同dntps浓度的反应体系优化，其梯度设置为1.8mm、1.5mm、1.2mm、0.9mm、0.6mm，所有分组反应都以去离子水作为模板设阴性对照，每个浓度梯度设置3个重复。待所有浓度梯度反应结束后，进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。

6、猪圆环病毒3型psr检测方法的优化结果

6.1反应时间优化结果：当反应时间不同时，会随着时间延伸电泳条带越来越明显，在恒温水浴锅中反应50min时，结果最佳。

6.2反应温度优化结果：当反应温度不同时，会出现电泳条带亮度差异，在62℃下反应时，效果最佳。

6.3反应中各重要组分浓度的优化结果：

当mgso4浓度不同时，会出现电泳条带亮度差异，当mgso4浓度为6mm时，效果最佳。

当dntps浓度不同时，会出现电泳条带亮度差异，当dntps浓度为1.5mm时，效果最佳。

6.4优化体系和条件

通过上述条件的优化，猪圆环病毒3型病毒聚合酶螺旋扩增检测试剂包括以下组分：

聚合酶螺旋扩增的反应条件为恒温62℃作用50min。

7、psr的特异性试验

以临床上常见的猪类病毒性疾病：伪狂犬病病毒(prv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪圆环病毒2型(pcv2)、猪瘟(csfv)、猪流行性腹泻病毒(pedv)为检测对象，用pcv3的psr引物进行psr检测，来验证其反应的特异性，并设置阳性对照，结果参见图2。

psr检测的反应体系包括如下组分：

其中，阳性对照为猪圆环病毒3型病毒模板dna，其为使用病毒dna/rna提取试剂盒提取的猪圆环病毒3型病毒基因组dna。

扩增结果显示只有阳性对照出现弥散状条带，其他5种病毒均未出现，说明以其它病毒作为模板时没有阳性扩增，本发明设计的pcv3psr引物具有高度的特异性。

图2为pcv3psr反应特异性试验图。其中m：dna分子标准量标准dl2000；泳道1～6分别为应用pcv3psr特异性引物检测阳性对照和伪狂犬病病毒(prv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪圆环病毒2型(pcv2)、猪瘟(csfv)、猪流行性腹泻病毒(pedv)的结果，泳道7为阴性对照。

7.1扩增产物的酶切鉴定

为进一步验证扩增反应的特异性，将psr反应后产物进行酶切鉴定，在20μl反应体系中加入以下组分，用ecorⅰ对阳性psr产物进行消化。

将上述反应产物混匀后，37℃反应1.5h，反应后取出5μl产物，用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml的溴化乙锭)对酶切产物进行检测。

结果：理论计算中，pcv3扩增产物经内切酶ecorⅰ消化后，应成为三条大小分别为220bp，182bp和42bp的主带。图3中结果与理论值完全相符，说明本发明建立的检测方法具有很好的特异性。

图3为pcv3psr反应产物的酶切鉴定结果图。其中m：dna分子标准量标准dl2000；泳道1：pcv3psr终产物；泳道2：内切酶ecorⅰ消化后的结果。

8、psr的敏感性试验

取含有pcv3-orf2序列的pmd-18t载体质粒进行10倍递进稀释至10¹个拷贝，并分成两部分，一部分用本发明的优化后的psr方法检测，测定该方法的敏感性；另一部分用常规pcr方法检测，将两者检测结果进行比较，参见图4的a和b图，以验证其反应的敏感性。c图为psr添加显色剂的变色结果(此显色剂为反应前加入)图。

结果表明：psr方法比常规pcr扩增的方法至少高100倍。由此可见，本发明psr方法具有更高的敏感性。

图4为pcv3psr反应灵敏度试验图，其中m：dna分子标准量标准dl2000；a、b图中1～7泳道分别为模板稀释至10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10³、10¹个拷贝，泳道8为阴性对照；c图中1～7泳道分别为模板稀释至10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10³、10¹个拷贝，8为阴性对照。

9、psr实际应用的符合性

临床采集疑似猪圆环病毒3型的组织病样，提取样品基因组，利用建立的的psr检测方法和常规的pcr以及荧光定量pcr方法进行检测，通过对三种方法实际应用中检测结果比较，验证psr的符合性。

结果表明：利用猪圆环病毒3型聚合酶螺旋扩检测试剂盒和常规pcr以及荧光定量pcr对获得的样品进行检测，发现psr的检出率显著高于传统的pcr方法，与荧光定量pcr方法出率较为相近，且传统的pcr和荧光定量pcr检出的阳性样品都可以被本发明的psr方法所检出。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。