一种鉴定水稻耐低磷基因Pup1的分子标记、鉴定方法及应用与流程

本发明涉及基因工程和遗传育种领域，特别涉及一种鉴定水稻耐低磷基因pup1的分子标记、鉴定方法及应用。
背景技术：
：水稻是我国最重要的粮食作物之一，但在长期的育种实践中一味追求高肥水条件下的高产，忽视了养分利用率的问题，致使在生产中需要大量施用肥料。磷是植物正常生长发育所必需营养元素之一，由于磷酸盐的化学特性使其易被固定成为作物难以利用的固定态磷，致使土壤中有效磷含量很低，因此在农业生产中需要依靠施用大量磷肥来维持作物对磷的需求。增施磷肥不仅会造成大量的资源浪费，而且也会带来一系列的环境问题。当前，我国的农业生产正面临从传统的粗放型生产方式向“环境友好型，资源节约型”生产方式的转变。大力推广少投入、多产出的农业生产模式，不仅有利于增加农民收入，更可以保护环境，保障农业的可持续发展。因此，发掘水稻自身磷高效利用的潜力，选育和种植耐低磷品种，通过提高磷肥利用率，减少磷肥施用量正是实现这一目标最有效的途径之一。现有的研究表明，水稻耐低磷的遗传属于复杂的数量性状，受多基因控制，并且与环境紧密互作。迄今为止，已有多个水稻耐低磷基因被鉴定克隆出来，其中pup1来自孟加拉水稻。但在目前的分子标记辅助育种中，利用pup1基因进行分子育种的报道依旧较少，更没有基于pcr技术检测pup1基因的分子标记方面的报道，影响了该基因在水稻耐低磷分子标记育种过程中的推广应用。技术实现要素：为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种鉴定水稻耐低磷基因pup1的分子标记、鉴定方法及应用，可以简便、快速、高效地选育耐低磷的水稻品种，大大提高了水稻耐低磷品种的选育效率。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：本发明提供了一种鉴定水稻耐低磷基因pup1的分子标记，所述分子标记为pup1-m1，所述pup1-m1为引物对，包括核苷酸序列如序列表seqidno.1所示的上游引物pup1-m1-f和序列表seqidno.2所示的下游引物pup1-m1-r。优选的，该鉴定水稻耐低磷基因pup1的分子标记的获取方法，包括以下步骤：通过登录号ab458444从genbank下载pup1基因的核苷酸序列，利用在线引物设计软件primer1进行分子标记设计，获得权利要求1所述的分子标记。本发明还提供了一种利用上述分子标记鉴定水稻耐低磷基因pup1的方法，该方法包括以下步骤：s1、提取待测水稻品种的基因组dna；s2、以s1步骤中获取的基因组dna为模板，以pup1-m1-f和pup1-m1-r为上下游引物进行pcr扩增；s3、通过2％琼脂糖凝胶对s2步骤中获取的pcr产物进行电泳分离，经溴化已锭染色后将凝胶置于凝胶成像系统中成像；s4、结果判定：观察s3步骤中的电泳图像，若能扩增出238bp大小的片段，则表明被检测水稻品种中携带有耐低磷基因pup1；若无扩增片段出现，则表明被检测水稻品种中缺乏耐低磷基因pup1。优选的，所述水稻品种的基因组dna采用ctab法进行提取。更优选的，所述水稻品种基因组dna的ctab提取法，包括以下步骤：z1、将0.5g新鲜水稻叶片剪碎后装入2ml的离心管中，并往离心管内放入一粒钢珠，然后往其中加入600μlctab提取液，盖好管盖后置于打样机上以23～26r/s的速度振动1min；z2、65℃水浴30min，期间每隔10min震荡混匀1次；z3、打开离心管，加入600μl氯仿并充分摇匀，静置5min后以12000rpm的转速离心8min；z4、从z3步骤的2ml离心管中吸取400μl上清液至事先准备好的1.5ml离心管中，然后往1.5ml离心管内加入1ml事先经过-20℃预冷的无水乙醇，摇匀后置于-20℃冰箱中静置20min，最后以12000rpm的转速离心10min；z5、将z4步骤的1.5ml离心管中的液体倒掉，待离心管内的白色絮状沉淀风干后往其中加入200μlddh2o，轻轻摇晃使沉淀溶解得到水稻品种的基因组dna，最后置于-20℃保存备用。优选的，所述pcr扩增的反应体系为：10xpcr反应缓冲液2μl，浓度为5pm的pup1-m1-f引物和pup1-m1-r引物各1μl，10mmdntp0.5μl，25ng/μldna模板2μl，5u/μltaqdna聚合酶0.5μl，加ddh2o补足至20μl。优选的，所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35次循环；72℃再延伸10min，4℃冷却10min。优选的，所述电泳分离的电压为120～130v，电泳时间为30～40min。本发明还提供了一种上述分子标记在水稻耐低磷分子标记辅助育种中的应用。本发明还提供了一种利用上述分子标记鉴定水稻耐低磷基因pup1的方法在水稻耐低磷分子标记辅助育种中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过多个已测序的水稻品种分析耐低磷基因pup1的携带情况，发现并非每个品种均包含有pup1基因，在此基础上，针对pup1基因的特性设计了一种基于pcr技术的分子标记-pup1-m1，并建立了基于该分子标记的pup1鉴定方法，该分子标记可以用于鉴定不同水稻品种是否存在耐低磷基因pup1，应用于水稻耐低磷分子辅助育种过程中，不仅操作方法简单，耗费低，而且不受环境条件的影响，可以简便、快速、高效地选育出耐低磷的水稻品种，大大提高了水稻耐低磷品种的选育效率；同时，也促进了耐低磷基因pup1在水稻分子育种方面的应用，值得推广。附图说明图1为本发明实施例中的分子标记pup1-m1在基因pup1序列中的位置；图2为本发明实施例中的23个供试水稻材料基因组dna的电泳图。注：在图1中，带下划线的字母表示pup1-m1的设计位置；在图2中，泳道1-23分别表示：kasalath、中早35、湘早籼45、浙733、江农早b、金23b、ir58025b、珍汕97b、五丰b、天丰b、93-11、黄华占、五山丝苗、九香粘、蜀恢498、成恢727、明恢63、双抗明占、华占、越光、龙粳31、沈农265和日本晴。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例：本发明提供了一种鉴定水稻耐低磷基因pup1的分子标记，所述分子标记为pup1-m1，所述pup1-m1为引物对，包括核苷酸序列如序列表seqidno.1所示的上游引物pup1-m1-f和序列表seqidno.2所示的下游引物pup1-m1-r，其序列信息详见表1。该分子标记具体按照以下方法获取：利用ncbi数据库通过登录号ab458444从genbank下载pup1基因的核苷酸序列，该核苷酸序列如序列表seqidno.3所示，利用在线引物设计软件primer1进行分子标记设计，获得权利要求1所述的分子标记-pup1-m1，pup1-m1在pup1序列中的位置如图1所示，带下划线的字母表示pup1-m1的设计位置。以上述分子标记对供试水稻材料进行耐低盐品种鉴定，一共选择23个不同的水稻品种作为供试水稻材料，分别是：kasalath、中早35、湘早籼45、浙733、江农早b、金23b、ir58025b、珍汕97b、五丰b、天丰b、93-11、黄华占、五山丝苗、九香粘、蜀恢498、成恢727、明恢63、双抗明占、华占、越光、龙粳31、沈农265和日本晴；其中，已知品种kasalath(gamuyaor,chinjh,pariasca-tanakaj,etal.theproteinkinasepstol1fromtraditionalriceconferstoleranceofphosphorusdeficiency[j].nature,2012,488(7412):535-539；chinjh,gamuyaorl,dalidc,etal.developingricewithhighyieldunderphosphorusdeficiency:pup1sequencetoapplication[j].plantphysiology,2011,156:1202–1216.)和蜀恢498(duh,yuy,may,etal.sequencinganddenovoassemblyofanearcompleteindicaricegenome[j].naturecommunications,2017,8:15324.)中含有纯合型或杂合型的耐低磷基因pup1，日本晴中不含有耐低磷基因pup1(gamuyaor,chinjh,pariasca-tanakaj,etal.theproteinkinasepstol1fromtraditionalriceconferstoleranceofphosphorusdeficiency[j].nature,2012,488(7412):535-539.)，其余水稻品种中携带耐低磷基因pup1的情况未知。具体的鉴定步骤如下:s1、采用ctab法分别提取上述23个供试水稻材料的基因组dna，具体的提取过程包括以下步骤：z1、将0.5g新鲜水稻叶片剪碎后装入2ml的离心管中，并往离心管内放入一粒钢珠，然后往其中加入600μlctab提取液，盖好管盖后置于打样机上以23r/s的速度振动1min；z2、65℃水浴30min，期间每隔10min震荡混匀1次；z3、打开离心管，加入600μl氯仿并充分摇匀，静置5min后以12000rpm的转速离心8min；z4、从z3步骤的2ml离心管中吸取400μl上清液至事先准备好的1.5ml离心管中，然后往1.5ml离心管内加入1ml事先经过-20℃预冷的无水乙醇，摇匀后置于-20℃冰箱中静置20min，最后以12000rpm的转速离心10min，这时离心管中会形成白色絮状沉淀，即dna；z5、将z4步骤的1.5ml离心管中的液体倒掉，待离心管内的白色絮状沉淀风干后往其中加入200μlddh2o，轻轻摇晃使沉淀溶解得到水稻品种的基因组dna，最后置于-20℃保存备用。s2、分别以s1步骤中获取的基因组dna为模板，以pup1-m1-f和pup1-m1-r为上下游引物进行pcr扩增；pcr扩增的反应体系为：10xpcr反应缓冲液2μl，浓度为5pm的pup1-m1-f引物和pup1-m1-r引物各1μl，10mmdntp0.5μl，25ng/μldna模板2μl，5u/μltaqdna聚合酶0.5μl，加ddh2o补足至20μl；pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35次循环；72℃再延伸10min，4℃冷却10min；s3、通过2％琼脂糖凝胶以120v的恒定电压对s2步骤中获取的pcr产物进行30min的电泳分离，经溴化已锭染色后将凝胶置于凝胶成像系统中拍照成像，并将电泳的图像保存备用；s4、结果判定：通过观察s3步骤中的电泳图像发现(图2)，品种kasalath和蜀恢498能扩增出238bp大小的片段，日本晴则无扩增片段出现，扩增结果与kasalath、蜀恢498、日本晴的实际情况相符，证明了分子标记pup1-m1在鉴定耐低磷水稻品种应用中的准确性；同时，通过检测结果发现，中早35、湘早籼45、浙733、江农早b、金23b、ir58025b、珍汕97b、五丰b、天丰b、93-11、黄华占、五山丝苗、九香粘、成恢727、明恢63、双抗明占、华占、越光、龙粳31和沈农265这20个水稻品种中除江农早b扩增出238bp大小的片段外，其余的水稻品种均无扩增片段出现，表明在这些供试水稻品种中除品种kasalath、江农早b和蜀恢498外，其余水稻品种中均缺乏耐低磷基因pup1，为水稻耐低盐品种的选育提供了理论指导，同时印证了分子标记pup1-m1以及基于该分子标记的pup1鉴定方法可以应用于水稻耐低磷分子辅助育种过程中，可以简便、快速、高效地选育出耐低磷的水稻品种，进而大大提高水稻耐低磷品种的选育效率。表1水稻耐低磷基因pup1的分子标记基因分子标记序列(5’-3’)pup1pup1-m1-fcgaagccagtttgttatccacpup1pup1-m1-rcagaaatgcctgctatcacatc以上对本发明的实施方式作了详细说明，需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。序列表<110>江西省农业科学院<120>一种鉴定水稻耐低磷基因pup1的分子标记、鉴定方法及应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cgaagccagtttgttatccac21<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cagaaatgcctgctatcacatc22<210>3<211>2975<212>dna<213>水稻耐低磷基因(pup1)<400>3gcagcttccttgtaattaaagaaagagattaaggataaggcaatcaatcttatcccatgt60acataggtatccggattataagggataccgtacaatatccaatcgttcggcctggctcta120tataaagggcatcggaggaaacccaaggggcttagactttcaaccatactccacttacgc180cccatcggatattctactgctgatttttggccgatctttgatttctattgggccctactg240ataaacagtaattttggatatatgggtcaaaatatcagcgaaattgcaatcctttaggat300catccgtcgacttttagggcttaataaaaacttcctttactttaaaaaaacaaatcacgt360actccatccatcaaaaagaaaactagaactccacgcgacatattctagtataccgaattt420ggacagagatatatccaaattcattgtgctatttggttttttaggatggagggagtatat480atactaactctattacctgacttgcttctcaatggccagatgcatggacatggaaaggtc540gcttatcgcggaagaagaggataacgatatgtaagtttttacatttcttcttccacgcac600cgtcgttcgtgttttttttttctttctattgtgtgcgaaaagtgaatgtaacaagtagtg660actggcccgtacgttcaaatttgagaaatgtaaaacacaacagaaacaactctgatttta720tacgccctgtttttactcacaatgacttgtttggcaaatccaaatccccacctatcctca780gggatgggaagccacttggccttgccaaacgaagcctagaggagcaaataatgttgcagt840atgcaaaagatgccctccaaagtcctgatggcagctggcatgtagtgatcaataaagaag900gctgaaacttgctagcccggttggttcgaactaatgaactaaactgagtcaagacaatgt960tggatgtaattgacgggtaataagaggaagatatatatagaagcaaacatatcctatata1020tgcatatgagtgttcacgtgtacactctacacatgccaactaacaaatatcaacagaagt1080tatagaaaataatggatatgtatttttaatagtattatatgtacttgttacgtatcatct1140tcaaattcatcatgtgtggagagcaataaaaagacaaaattctgataggcttataacctt1200aaaattgttggaatttctcttattttttaggcaaaaacctaatgaatttgaggttaagac1260tttacgcatacatatgtaatactatacatagtttttttctaatttttttctaaattggta1320agtatgaagtgtgcatgcgaaacttttgtgcacatgacatatttacatataaagagtaat1380catgaggcataatacatctatcaaatcgagaggtttgcacgttctggtcaacactatgaa1440tataacgttgggagaagaagagctcttattctcgaacagtcgtactccgctgtatatgtc1500gtgattagtgatagatttatagccaatattttaatttgatgattttattgtgttgcatat1560atgatatataatttggatgttattttcttaacaatctaggtcaagctatgtcgcagaacc1620gagttaggcaaccacacttttacttgttagcgagccaaaagataaaatgatcaccgtttc1680ccaatgggtctaaagcgaaccgaagccagtttgttatccacggttactagcgtggtttcg1740tagcaaactagcaatcttgccttcatttgaaaagtaaaagttctttataaaggccttcct1800acttgagtggaaaaaaagtagataaattagcagaaacagttcttcaatatgatcgacatg1860ttaccgtacatcattgactcatgtagattatttttgtctcctggtatttttttccagatg1920tgatagcaggcatttctggctcatttgggttattcatagttctcatattcttcatatggc1980acaagaaacgttacggattaatgctgctctgtcaaagggcatcaaagaatgcaccaagga2040tagaatctttcctacaaaagcaagaaacttcaaacccaaaaagatacactctctctgaag2100tgaaaagaatgactaaatcttttgctcacaagcttggcagaggtggctttggtactgttt2160ataaaggtagcctgcctgatggccgtgagatagccgtcaagatgctaaaggataccaagg2220gtgatggggaggaattcataaatgaggttgctggcattagtaaaacttctcatatcaatg2280ttgttaaccttctaggtttttcccttcaagggtcaaaaagagctctgatctatgagtaca2340tgcccaatggttcacttgatagatattcttttggcgatagctctgtccaaggagataaca2400ccctgagctgggatagactgttcaatattattgtcgggattgctcgagggctggagtatc2460tccactgtcattgcaacattcgcattgtgcattttgatatcaaacctcaaaacattctac2520tggctcaagatttctgtccaaagatctctgattttggcctgtcaaaattgtgccatctaa2580aggagagcagaatttcgatcaacggactaagaggaacacctggctacattgcacctgaag2640tgttttccaggcagtatggatctgccagcagcaaatctgatgtctacagctatggaatgg2700tggtccttgagatggctggtgcaaagaaaaacatcaacgttagtacaggtagtagcagca2760aatattttccccaatggttatacgataatttggaccagttttgttgccccacgggcgaga2820ttagtagccagaccaccgatcttgtaaggaagatggttgtcgttggtttgtggtgcatac2880aactcgtacctacagatcgaccgtccatgagagaagtccttgagatgttggaaagcaacg2940gtagggacttaccgttgccaccaaaagggctttga2975当前第1页12