本发明涉及一种耐热型脱硫菌筛选培养液及其筛选方法，属于微生物、环境工程领域。
背景技术：
我国的电力结构以煤为主，煤炭燃烧成为我国硫污染的主要来源之一。煤炭中所含的硫按赋存形态可分为无机硫和有机硫，其中，无机硫(占总硫分的60％～70％)主要以黄铁矿形式存在，此外还包括少量硫酸盐和微量单质硫。脱硫方式有物理脱硫、化学脱硫和微生物脱硫等方式。
微生物脱硫是通过利用脱硫微生物的代谢过程，在燃烧前将煤炭中的硫转换为其它易脱除形式，从而达到脱硫目的。与传统的物理脱硫和化学脱硫相比，微生物脱硫具有生产成本低，反应条件温和，脱除率高，环境污染小，专一性强等优点。因此，微生物脱硫日益受到人们的关注和重视。
获得脱硫微生物是实现微生物脱硫的前提条件。温度是化学反应的重要影响因素，一般来讲，温度越高反应速度越快。温泉中含有大量的耐热型细菌，其中很多是具有脱硫能力的自养型细菌，这类细菌在脱硫的同时还具有自养型生长的特点，能最终提高煤炭中有机物的含量，提高煤炭热值。自养型细菌一般以不含有机碳源的培养基进行富集培养。自养型细菌一般生长速度较慢，筛选有一定的困难。温泉中的细菌大多附着在砂石等固体表面，泉水中细菌往往含量较低。温泉样品的采集有时有一定困难，有时很难到达温泉源头以取得砂石等细菌含量高的样品，只能采集到自行流出或抽取的泉水，这些水样中细菌含量一般很小，另外，温泉样品采集后往往要经过一段时间才能到达能进行筛选培养的实验室，这个过程中微生物的活力往往会有所下降，以上原因造成在温泉样品中筛选脱硫菌时漏筛的可能性很大。
因此，急需寻找一种筛选效率高的耐热型脱硫菌的方法。
技术实现要素：
为了解决在耐热型脱硫菌筛选时，由于脱硫菌生长速度慢，样品中脱硫菌含量低，容易导致样品中脱硫菌被漏筛的问题，本发明设计了一种成分优化的培养液，这种培养液与黄热厌氧芽孢杆菌anoxybacillusflavithermus配合使用，进行脱硫菌筛选时样品中脱硫菌筛出率大幅度提高。
本发明首先提供了一种耐热型脱硫菌的筛选培养液，所述培养液为：kh2po40.4-0.5g/l，k2hpo40.5-0.6g/l，mgcl20.03-0.05g/l，cacl20.05-0.07g/l，nacl4-6g/l，氮源0.05-0.06g/l，五水硫代硫酸钠0.3-0.4g/l，碳酸氢钠0.1-0.2g/l，微量元素溶液0.1-0.2ml/l；其中，所述培养液中包括黄热厌氧芽孢杆菌，浓度为每毫升培养液(0.8-1.2)×105个细胞。
进一步的，所述氮源包括硝酸钠、氯化铵、硝酸铵三种化合物，其中，硝酸钠、氯化铵或硝酸铵浓度均大于等于0.01g/l。
进一步的，优选的，所述氮源包括硝酸钠0.02g/l、氯化铵0.02g/l、硝酸铵0.02g/l。
进一步的，所述微量元素溶液为edta.na20.5-0.7g/l；(nh4)6mo7o24·4h2o0.01-0.2g/l、cocl·6h2o0.015-0.02g/l、mncl·4h2o0.03-0.04g/l、cuso4·5h2o0.01-0.02g/l、znso4·7h2o0.13-0.14g/l，feso40.3-0.4g/l。
进一步的，所述黄热厌氧芽孢杆菌anoxybacillusflavithermus不限具体的株或亚种。
本发明还提供了一种耐热型脱硫菌的筛选方法，所述方法利用上述耐热型脱硫菌的筛选培养液进行筛选。
进一步的，所述筛选方法具体为：
(1)配制耐热型脱硫菌的筛选培养液；
(2)在培养液中加入体积分数为1-3％的温泉水，在与温泉对应的温度±5℃下进行培养，但最高培养温度不超过65℃，当样品所属温泉温度高于70℃时均采用65℃培养；
(3)当培养液出现ph下降则初步判定为脱硫菌筛选成功，进一步出现硫磺味及漂浮的硫单质则判断为脱硫菌筛选成功。
进一步的，当培养5-7天后培养液的ph上升，达到ph9以上，则说明温泉水样品中无耐热型脱硫菌。
进一步的，所述温泉水为温度不超过75℃的温泉水。
脱硫菌是否生长情况鉴定方法如下：根据本课题组的经验，如果培养液中没有脱硫菌生长，则在培养5-6天后培养液中会有少量沉淀物产生，这是由培养液中的金属离子与碳酸根等发生化学反应形成的，与此同时，培养液的ph会上升，根据经验，如果培养液的ph达到9以上则不可能再有脱硫菌生长，可以确定为该温泉样品中不存在脱硫菌。因此，本发明以培养液ph上升达到9作为筛选失败的标志。
如果有脱硫菌生长，则在9天以内培养液首先出现ph下降，随后培养液出现明显的硫磺味道，再培养1～2天后培养液表面会出现漂浮的淡黄色单质硫，此时取少量培养液进行显微镜观察可以见到大量活细菌。由于本发明使用的培养基均不含有机物，培养基的碳源为nahco3，由此所筛选得到的细菌均为自养型细菌或菌群，细菌或菌群生长的能量来源是在细菌对硫代硫酸钠进行脱硫过程中获得的。由于脱硫菌可以将硫代硫酸钠中的s2-转化成硫单质，因此如果脱硫菌培养成功则培养液表面上可以见到漂浮的硫单质。脱硫菌对s的代谢首先是将s2-转化成硫单质还可以进一步氧化获得硫酸根并伴随硫酸的产生，引起ph下降，因此，当脱硫菌存在的时候，会在筛选前期出现ph下降的原因，以后随着脱硫菌数量的增加，单质硫积累到一定程度成为肉眼可见的漂浮的硫单质。因此，当培养液出现ph下降则可以初步判定为脱硫菌筛选成功，进一步出现硫磺味及漂浮的硫单质则判断为脱硫菌筛选成功。
上述培养获得的脱硫菌则很容易进行进一步扩大培养、用于其它的脱硫实验，上述培养获得的脱硫菌(也可能是菌群)由于细菌数量大，活性高，其扩大培养可以在普通脱硫培养液中进行。
本发明取得的有益效果：
(1)本发明通过优化了筛选培养液的组成，添加辅助菌黄热厌氧芽孢杆菌anoxybacillusflavithermus，能够筛选出普通脱硫菌培养液无法筛选出的低含量的脱硫菌，有效的避免了样品中脱硫菌被漏筛的问题。
(2)本发明的方法简单易行，筛选效果好，使用本发明方法能够筛选出温度不超过75℃的温泉水中的脱硫菌，而采用其它培养液(包括本发明提及的用普通脱硫菌培养液和优化的脱硫菌筛选培养液)进行培养时只有极少数样品能得到脱硫菌。
具体实施方式
通过实施例对本发明作进一步说明，实施例将不以任何方式限制本发明的范围。
普通脱硫菌培养液：kh2po40.46g/l，k2hpo40.55g/l，mgcl20.05g/l，cacl20.07g/l，nacl5g/l，氮源(硫酸铵0.06g/l)，五水硫代硫酸钠0.33g/l，碳酸氢钠0.16g/l，微量元素溶液0.1ml/l。
优化的脱硫菌筛选培养液：kh2po40.46g/l，k2hpo40.55g/l，mgcl20.05g/l，cacl20.07g/l，nacl5g/l，氮源0.6g/l(硝酸钠0.02g/l+氯化铵0.02g/l+硝酸铵0.02g/l)，五水硫代硫酸钠0.33g/l，碳酸氢钠0.16g/l，微量元素溶液0.1ml/l。
耐热型脱硫菌筛选培养液：kh2po40.46g/l，k2hpo40.55g/l，mgcl20.05g/l，cacl20.07g/l，nacl5g/l，氮源0.6g/l(硝酸钠0.02g/l+氯化铵0.02g/l+硝酸铵0.02g/l)，五水硫代硫酸钠0.33g/l，碳酸氢钠0.16g/l，微量元素溶液0.1ml/l，其中，所述培养液中包括黄热厌氧芽孢杆菌，浓度为每毫升培养液105个细胞。
其中，上述三种培养液中的微量元素溶液为：edta.na20.51g/l；(nh4)6mo7o24·4h2o0.015g/l、cocl·6h2o0.017g/l、mncl·4h2o0.043g/l、cuso4·5h2o0.015g/l、znso4·7h2o0.133g/l，feso40.33g/l。
普通细菌培养基：酵母粉0.5％,蛋白胨1％，葡萄糖0.5％，氯化钠2％。用hcl和naoh调整至与所培养微生物所需ph基本一致。该培养基用于黄热厌氧芽孢杆菌的培养时所用ph为6.5-7.0。
本发明使用的化学试剂均为普通分析纯试剂，购自国药集团上海化学试剂公司。
温泉中脱硫菌的培养：首先按给出的培养液的组成配制，完成后分装在250ml三角瓶中，三角瓶用铝箔封口，培养液需要过滤除菌，三角瓶和铝箔需要高温灭菌，在培养液中加入少量温泉水样品，本发明均采用温泉泉水。将泉水与培养液混合后在与温泉原始温度±5℃的温度下进行培养。泉水的添加量为培养液体积的1-3％，添加泉水体积太小容易漏筛，添加泉水体积太大，则培养液中会产生沉淀导致培养液ph迅速上升，导致筛选失败，泉水中的一些成分可能会与培养液中的成分反应形成沉淀。
实施例1用耐热型脱硫菌筛选培养液从温泉样品中筛选脱硫菌的效果
在已灭菌的250ml三角瓶中加入耐热型脱硫菌筛选培养液200ml，加入温泉泉水水样2ml，在温泉水对应的温度下培养，进行脱硫菌的筛选。
五种温泉水样品均来源于云南省腾冲县热海国家地质公园，具体如下：
01：怀胎井下游水塘热水(取样时为70℃)；
02：硫磺塘(大滚锅上方)温泉水样(50℃)；
03：蛤蟆嘴下游水塘水样(45℃)；
04：黄瓜箐澡堂水样(45℃)；
05：黄瓜箐澡堂外水沟中温水水样(取样时为45℃)
培养情况如表1所示。
表1用耐热型脱硫菌筛选培养液筛选脱硫菌的结果
由表1可见，在耐热型脱硫菌筛选培养液中加入温泉样品后培养3～5天后5个样品均出现培养基ph下降的现象，继续培养则培养液出现明显的硫磺味道，培养液表面出现漂浮的硫单质。进一步镜检可以看到培养液中有大量的细菌，其形态与预先添加的黄热厌氧芽孢杆菌显然不同，可见已筛选出耐热型脱硫菌。
作为对照的是未添加温泉水样品的耐热型脱硫菌筛选培养液在45℃、50℃和65℃的培养结果，结果显示，这种培养液在培养6天后出现ph上升的现象，第9天时培养液ph达到9，取培养液用显微镜观察没有观察到脱硫菌生长的迹象。这些培养液中原有的黄热厌氧芽胞杆菌也无法观察到，可能是这些预先加入的细菌在9天的培养过程中发生了菌体裂解。开始培养时，所使用的培养基中包含黄热厌氧芽孢杆菌，从培养结果可见黄热厌氧芽孢杆菌本身并不能在脱硫培养基中生长，它只能促进温泉中其他脱硫菌的生长，这与黄热厌氧芽孢杆菌是一种异养型芽孢杆菌而脱硫培养基中不含有机物的情况是一致的。
实施例2用其它培养液从温泉样品中筛选脱硫菌的效果
1)用优化的脱硫菌筛选培养液的筛选效果
优化的脱硫菌筛选培养液本质上就是在耐热型脱硫菌高效筛选培养液配制过程中没有加入辅助筛选菌的培养液。
在已灭菌的250ml三角瓶中加入优化的脱硫菌筛选培养液200ml，加入温泉样品2ml，在温泉水对应的温度下培养，进行脱硫菌的筛选，温泉水样品见实施例1。培养结果如表2所示。
表2用优化的脱硫菌筛选培养液筛选脱硫菌的结果
从表2可见，将样品接种在优化的脱硫菌筛选培养液中培养，在培养5-6天后样品01-05均出现ph上升的迹象，培养达到8～9天后培养液的ph均达到9，镜检也未发现任何微生物生长的迹象，表明无法筛选得到脱硫菌。可见在优化的脱硫菌筛选培养液中如果不加入辅助筛选菌黄热厌氧芽孢杆菌其筛选脱硫菌的效果不理想。
2)其它不含辅助菌的培养液的筛选效果
在本发明研究工作的前期，首先采用普通脱硫菌培养液，进行脱硫菌的筛选，但未能筛选到脱硫菌。随后又对培养基的成分进行了改变。这些不同配制方法的培养液中，比较典型的是氮源有所不同的培养基，例如下列培养基：
在800ml去离子水中加入：kh2po40.3-0.7g，k2hpo40.4-0.6g，mgcl20.02-0.08g，cacl20.03-0.09g，nacl3-8g，氮源0.05-0.06g(硝酸钠0.05-0.08g或者氯化铵0.05-0.08g或者硝酸铵0.05-0.08g或硫酸铵0.05-0.08g，或使用组合氮源，其中氮源的总量仍然为0.05-0.08g)，五水硫代硫酸钠0.2-0.7g，碳酸氢钠0.1-0.3g，微量元素溶液0.1-0.2ml，加水至1l。配置完毕后过滤除菌。
微量元素溶液：在10l去离子水中加入edta.na23-8g充分溶解后依次加入以下成分：(nh4)6mo7o24·4h2o0.1-0.2g、cocl·6h2o0.1-0.3g、mncl·4h2o0.3-0.6g、cuso4·5h2o0.1-0.3g、znso4·7h2o1-2g，feso42-5g，充分溶解后过滤除菌。
本发明研究过程中使用了多种成分的培养液，这些未加入辅助菌黄热厌氧芽孢杆菌的培养液均无法从上述五个样品中筛选得到脱硫菌。
3)不同培养液与辅助菌配合使用的筛选效果
为了筛选可能对脱硫菌筛选有帮助的微生物，对大量的微生物进行了试验，主要是从江南大学中国高校工业微生物资源数据平台取得各类微生物1000多株菌。这些微生物培养后加入到实施例2所述的各种类型的脱硫培养基中，细菌添加量为控制每毫升培养液中最终含菌量为大约105个细胞。在上述加入了其他细菌的培养液中，接种温泉来源的样品，在与温泉样品来源地温度一致的条件下进行培养(培养不超过65℃)。
结果显示，只有本发明的耐热型脱硫菌筛选培养液的配置组分能够筛选出耐热型脱硫菌。江南大学中国高校工业微生物资源数据平台(http://www.cicim-cu.jiangnan.edu.cn)总计收藏有3株黄热厌氧芽胞杆菌，其编号分别为：cicimb6808、cicimb6809、cicimb6951。这三株菌作为辅助筛选菌加入到优化的脱硫菌筛选培养液进行一起培养时均能够筛选得到耐热型脱硫菌，其余细菌和不同的培养液相组合，均无法筛选得到耐热型脱硫菌。
上述可以筛选得到耐热型脱硫菌的培养液的组成为：kh2po40.4-0.5g/l，k2hpo40.5-0.6g/l，mgcl20.03-0.05g/l，cacl20.05-0.07g/l，nacl4-6g/l，氮源0.05-0.06g/l，五水硫代硫酸钠0.3-0.4g/l，碳酸氢钠0.1-0.2g/l，微量元素溶液0.1-0.2ml/l；其中黄热厌氧芽孢杆菌的添加浓度为每毫升培养液(0.8-1.2)×105个细胞，其中氮源的组成包括但不限于下表4：
表4本发明得到的可筛选得到耐热型脱硫菌的培养液中氮源的组成
用含有上述氮源组成的耐热型脱硫菌筛选培养液加入实施例1中的5种温泉水样品进行培养，培养4-8天后5个样品均出现培养基ph下降的现象，继续培养则培养液出现明显的硫磺味道，培养液表面出现漂浮的硫单质，进一步镜检可以看到培养液中有大量的细菌，其形态与预先添加的黄热厌氧芽孢杆菌显然不同，可见已筛选出耐热型脱硫菌。可见实施例2.3中得到的培养液均能够用于筛选温泉中的耐热型脱硫菌，但其筛选效果较实施例1中的优化的耐热型脱硫菌筛选培养液与黄热厌氧芽孢杆菌配合的筛选效果相比较差。
实施例3脱硫菌培养基添加不同黄热厌氧芽孢杆菌的筛选结果
在实施例2中，课题组从江南大学中国高校工业微生物资源数据平台取得的能明显促进脱硫菌生长的三株菌在分类上均属于黄热厌氧芽孢杆菌，但三者在菌落形态上有明显不同，三者的16srdna序列也有明显的不同。由此推测黄热厌氧芽孢杆菌可能普遍可以促进脱硫菌生长。据此发明人从无锡先秦生物科技有限公司购买了另外两株黄热厌氧芽孢杆菌(编号为：xq03734和xq03738)进行进一步的试验，结果显示，在优化的脱硫菌筛选培养液中添加了上述两株菌获得的培养基在加入温泉样品后在培养4天后均出现ph下降的现象，培养液再培养一天后出现了明显的硫磺味道，取培养液镜检可以见到大量的细菌，菌体形态与黄热厌氧芽孢杆菌显然不同，可见已筛选出耐热型脱硫菌。综上所示，在优化的脱硫菌筛选培养液的基础上，黄热厌氧芽孢杆菌普遍具有提高温泉中脱硫菌筛选效率的功效，与所使用的具体的菌株没有明显的关系。
实施例4耐热型脱硫菌高效筛选培养液使用效果
为了进一步检验本发明的耐热型脱硫菌筛选培养液的使用效果，我们采集更多不同地方的温泉样品进行试验，结果如表5所示。
表5用耐热型脱硫菌筛选培养液从其他样品中筛选脱硫菌的结果
表6用优化的耐热型脱硫菌筛选培养液从其他样品中筛选脱硫菌的结果
样品说明：
a河南省商城县汤泉池温泉澡堂源头水。温泉温度约55℃，筛选脱硫菌的培养温度为50℃。
b云南省龙陵县邦腊掌温泉群大滚锅温泉(采样时温泉没有沸腾)。所取温泉温度约80℃，筛选脱硫菌的培养温度为65℃。
c江苏省东海县温泉镇小松源温泉饭店后温泉源头水。源头在深井中，水温不可测，估计在70℃，筛选脱硫菌的培养温度为65℃。
d云南省腾冲县胆扎村部队澡堂泉水出水口，温度为45℃，筛选脱硫菌的培养温度为45℃。
e南京市汤泉镇汤泉老澡堂泉水出水口(在洗澡池上方)水样，水温估计在50℃，培养温度为45℃。
对比表5、表6可见，采用耐热型脱硫菌筛选培养液筛选脱硫菌时，上述5个样品有4个可以筛选到脱硫菌。用不含黄热厌氧芽孢杆菌的脱硫培养基筛选时只有商城汤泉池中筛选得到了脱硫菌，说明该温泉水样品中的脱硫菌的含量比较高，因而不需要添加辅助菌也可以筛选得到脱硫菌，但筛选时间明显延长。不管用哪一种培养基，样品b均未能筛选到耐热型脱硫菌。样品b的温泉温度为80℃，这种温度特别高的温泉中的细菌比较特殊，不适合用本专利的方法进行筛选。
综上所述采用本发明的耐热型脱硫菌高效筛选培养液筛选耐热型脱硫菌具有明显较高的效率。
实施例5耐热型脱硫菌传代培养效果
实施例4，表5中a、c、d、e，4个样品经本发明方法筛选得到的菌液，进一步按1％的接种量分别接种耐热型脱硫菌筛选培养液、优化的耐热型脱硫菌筛选培养液和普通脱硫菌培养液，进行传代培养。结果显示，这4种培养物在上述三种培养液中培养后都在培养3天后培养液ph下降，第4天时出现明显的硫磺味道、培养液表面有明显的漂浮的硫单质，镜检可以见到大量活菌。这些菌液都可以连续稳定的传代。可见用本发明从温泉中得到的脱硫菌在再培养时并不依赖于本发明的方法，这可能是因为培养液中活菌数量大活性高的原因。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。