结直肠癌相关环状RNA基因、结直肠癌分子标志物及其应用的制作方法

本发明涉及结直肠癌领域，特别是涉及一种结直肠癌相关环状rna基因、结直肠癌分子标志物及其应用。

背景技术

结直肠癌是常见的恶性肿瘤，包括结肠癌和直肠癌，是近几十年来发病数和死亡数在世界大多数国家和地区上升最快的肿瘤之一。近年的流行病学资料显示，结直肠癌已上升为全球第三位最常见的癌症，2000年全世界有70万人患结直肠癌，其中50万人因此而死亡。在我国，随着人们生活方式及饮食习惯的改变，发病患者数也在增加，尤其是在北京、上海等发达的城市或地区。据北京市肿瘤防治研究所资料显示，目前北京市每年新增癌症患者约2万名，发病率为179/10万，其中结肠癌位居第二位。据上海地区调查显示，我国肠癌发病率的增速是世界平均水平的两倍。

环状rna(circrna)有较强的组织、细胞特异性和高度的保守性，其闭合环状结构使其比线性rna更稳定，不易被rna酶降解，表明circrna有作为疾病分子诊断标志物的潜能。研究发现人外周血中含有大量的circrnas，同时，在外泌体中也有大量的circrnas富集，而人体的外周血血清中即含有大量的外泌体，这样通过对患者的血清进行检测即可完成circrnas的检测。最近有研究发现circrnahsa_circ_0000190在胃癌病人的血浆和组织中表达均降低，且与传统的胃癌标志物cea和ca19-9相比，hsa_circ_0000190具有更好的特异性和敏感性。另一circrnacirs-7的表达水平与肝癌中afp表达水平密切相关。这些均表明环状rnas作为肿瘤早期标志物的筛查是一项切实可行的检测手段。还有研究发现circrnacirs-7在结直肠癌中表达水平增加且与病人的预后生存率相关。但与结直肠癌相关的环状rna还有很多，研究寻找这些环状rna对结直肠癌的防治诊断具有重要的研究价值和临床价值。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种与结直肠癌相关的环状rna基因。

一种与结直肠癌相关的环状rna基因，具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述环状rna基因在制备诊断或检测结直肠癌试剂中的应用。

本发明还提供了上述环状rna基因在制备诊断或检测结直肠癌基因检测芯片中的应用。

本发明还提供了一种结直肠癌分子标志物，所述结直肠癌分子标志物为环状rna，其具有如seqidno.2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述结直肠癌分子标志物在制备诊断或检测结直肠癌试剂中的应用。

本发明还提供了上述结直肠癌分子标志物在制备诊断或检测结直肠癌基因检测芯片中的应用。

本发明还提供了一种pcr引物，包括可特异性扩增上述结直肠癌分子标志物的上游引物和下游引物。

在一个实施例中，所述上游引物具有如seqidno.3所示的核苷酸序列，所述下游引物具有如seqidno.4所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种用于检测结直肠癌的试剂盒，包括上述pcr引物。

在一个实施例中，还包括rna提取试剂。

发明人对结直肠癌患者的癌组织与周围正常肠粘膜组织进行了测序分析，筛选到了23个差异表达显著地环状rna，其中3个表达上调，20个表达下调。进一步地，对其中10个在结直肠癌与癌旁组织中差异最显著的环状rna，通过荧光定量pcr的方式进行了验证，发现荧光定量pcr的结果与测序结果一致，其中上述结直肠癌分子标志物在测序分析和荧光定量pcr结果中组间差异均非常显著。进一步地通过对收集的病人临床资料进行分析，发现该结直肠癌分子标志物与病人的年龄、性别无关，而与肿瘤的大小和tnm分期及远处转移有相关性，能较好地反映结直肠肿瘤的发生发展，可用于监测结直肠肿瘤对治疗措施的反应等，是一种良好的结直肠癌分子标志物。该结直肠癌分子标志物的发现，为进一步研究结直肠癌的发病机理，探索结直肠癌的治疗靶点提供了新的实验理论基础和新的方向，并可应用在制备诊断或检测结直肠癌患者试剂的领域，丰富了结直肠癌的诊断和检测手段。

附图说明

图1为测序样本文库的检测大小结果图；

图2为差异circrna聚类图；

图3为差异circrna的亲本基因的go功能分类统计图；

图4为差异circrna的亲本基因的kegg富集散点图；

图5为差异circrna的荧光定量pcr结果与测序分析结果的对比图；

图6为fish探针检测circ_0000826在结直肠癌组织中表达的显微照片；

图7为circ_0000826经外扩及内扩引物的扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图；

图8为circ_0000826的sanger测序结果图；

图9为circ_0000826的形成示意图；

图10为circ_0000826的序列比对图；

图11为circ_0000826在30例结直肠癌组织中的倍比关系图；

图12为circ_0000826在配对结直肠正常和癌组织中的平均表达水平图；

图13为circ_0000826在7种结直肠癌细胞和正常结直肠粘膜上皮细胞ncm460中的表达图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下面主要结合具体实施方式和附图对结直肠癌相关环状rna基因、结直肠癌分子标志物及其应用作进一步详细的说明。

一、样品rna-seq测序

1.1rna的抽提与纯化

首先收集3例结直肠癌患者的癌组织和周围正常粘膜组织，并采用mirvanatmmirnaisolation提取试剂盒(cat#am1561,ambion)根据其标准操作流程进行样品的总rna抽提。抽提所得总rna经agilentbioanalyzer2100(agilenttechnologies,santaclara,ca,us)电泳质检合格后，使用rnacleanxpkit(cata63987,beckmancoulter,inc.kraemerboulevardbrea,ca,usa)和rnase-freednaseset(cat#79254,qiagen,gmbh,germany)纯化总rna。

1.2rna质检

测序实验起始样本为总rna，总rna经nanodropnd-2000分光光度计及agilentbioanalyzer2100进行质检，质检合格的rna可进行后续的测序实验。质控标准如表1所示，其中rin即rnaintegritynumber，rna完整性的检测指标，从0-10，分值越高，rna的完整性越好。

表1rna质控标准及说明

1.3文库构建及质检

对纯化后的总rna进行rrna去除、片段化、第一链cdna合成、第二链cdna合成、末端修复、3’末端加a补平、接头连接、扩增富集等步骤，完成测序样本文库构建。其中，所用试剂如表2所示。

表2文库构建和质检所用试剂

所建文库使用2.0fluorometer检测浓度，agilent2100检测文库的大小，结果如表3和图1所示，可见所建文库可以进行上机测序。

表32.0fluorometer定量结果

1.4cluster生成

按照cbotuserguide的相应流程，在illumina测序仪配套的cbot上完成cluster生成和第一向测序引物杂交。

1.5上机测序

按照illuminauserguide准备测序试剂，将携有cluster的flowcell上机。选用paired-end程序，进行双端测序。测序过程由illumina提供的datacollectionsoftware进行控制，并进行实时数据分析。

1.6测序结果质控情况

质控标准：数据量不少于10g/样本，每向碱基质量大于20(q20)的比例不小于90％。质控结果如表4所示(n代表正常组织，t代表癌组织)，经检测所有样品的测序量都满足要求，测序结果符合标准，可以用于数据分析。

表4测序数据质控结果

1.7数据分析

如图2所示，通过对3例结直肠癌患者的癌组织与周围正常肠粘膜组织进行测序分析，筛选到23个差异表达显著的circrna，其中3个表达上调，20个表达下调。进一步对差异circrna的亲本基因的go功能进行分类统计以及kegg富集分析，结果如图3和图4所示。就生物过程而言，差异circrnas表现为对生物学和代谢过程的调节，细胞成分分析显示差异circrna主要在细胞胞浆和细胞核中富集，对于分子功能，差异circrna主要起着结合的功能，通路分析显示差异circrna主要富集nod样受体信号通路。

二、qrt-pcr

选取7种结直肠癌细胞系和正常结肠上皮细胞、30例结直肠癌组织和正常对照的新鲜标本及其石蜡标本、30例结直肠癌病人及正常人血清样本。采用qrt-pcr技术定量检测环状rna在结直肠癌细胞、组织和血清中的表达水平。

使用trizol试剂(takara)提取待测细胞、组织及血清的总rna，利用takara逆转录试剂盒合成基因cdna链。以cdna为模板，加入sybrgreenⅰ(takara)及引物混合后用appliedbiosystems7500(appliedbiosystems)进行real-timepcr实验，以gapdh为内参，所有实验均重复3次，上游引物如seqidno.3所示，下游引物如seqidno.4所示。pcr条件为预变性95℃5min，35个循环：95℃1min，tm60℃30s，72℃30s。荧光定量pcr结果如图5所示，其与测序结果相一致，其中circ_0000826即上述结直肠癌分子标志物，具有如seqidno.2所示的核苷酸序列，其在测序分析与荧光定量pcr结果中组间差异均非常显著。

三、荧光原位分子杂交(fluorescenceinsituhybridization,fish)

用原位分子杂交技术进一步检测circ_0000826的表达及结直肠癌细胞的定位，以增强检测的可靠性，分析circ_0000826的表达及其临床病理参数之间的关系，初步确定circ_0000826在人结直肠癌中的作用。

将30例结直肠癌标本的石蜡切片经脱石蜡、梯度脱水后，将载玻片浸入0.2n的hcl内5min，洗涤后用40μg/ml的蛋白酶k在37℃消化10min，pbs洗涤后用乙醇脱水，依次用70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇和无水乙醇分别浸泡5min。从乙醇中取出的组织迅速滴加1×杂交buffer，室温放置5分钟后，轻轻倾去buffer，并加入由1×杂交buffer稀释的绿色荧光标记的circ_0000826探针(50nm)，盖上盖玻片于56℃处理1小时。ssc梯度洗杂，5×ssc于56℃洗5min，1×ssc于56℃洗杂5min并重复2次，0.2×ssc于56℃洗杂5min并重复2次，0.2×ssc于常温洗杂5min，pbs冲洗5min并重复3次。滴加dapi工作液(1：1000)，室温孵育10min，pbs冲洗5min并重复3次。滴加适量抗荧光衰减封片剂封片，然后使用荧光显微镜进行观察照相。fish探针检测结果如图6所示，亦表明了circ_0000826在结直肠癌组织中表达降低，且主要定位于胞浆。

通过内扩和外扩引物对circ_0000826进行扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图7所示。然后通过sanger测序确认了circ_0000826由亲本基因ankrd12的第2到第8外显子翻译并反向剪切形成，如图8和图9所示，ankrd12的第2到第8外显子具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。通过序列比对，如图10所示，说明circ_0000826序列具有高度保守性。然后对circ_0000826在30例结直肠癌组织中的倍比关系(t/n，n代表正常结直肠组织，t代表结直肠癌组织)进行了分析，结果如图11所示，进一步说明circ_0000826在结直肠癌组织中表达降低。对circ_0000826在配对结直肠正常和癌组织中的平均表达水平进行分析，结果如图12所示，用δct值来比较circ_0000826在结直肠癌和配对正常组织之间表达的差异，两配对样本t-检验比较结果显示circ_0000826的平均表达水平在结直肠癌组织中显著低于配对正常组织。如图13所示，为circ_0000826在7种结直肠癌细胞和正常结直肠粘膜上皮细胞ncm460中的相对表达量。以ncm460细胞为参照，两两比较结果显示circ_0000826在7种结直肠癌细胞中的表达均低于在ncm460细胞中的表达，其中在5株细胞中的表达与ncm460细胞相比有统计学意义(**p<0.01，***p<0.001)。

进一步地，如表5所示为结直肠癌病人的临床数据统计，表6所示为circ_0000826的临床病理资料分析。circ_0000826在结直肠癌组织中表达水平与临床病理参数之间的关系。可见，circ_0000826的表达与病人的年龄、性别无关，而是与肿瘤的大小和tnm分期及远处转移有相关性。

表5结直肠癌病人的临床数据统计

表6circ_0000826的临床病理参数分析

综上可知，环状rnacirc_0000826与病人的年龄、性别无关，而与肿瘤的大小和tnm分期及远处转移有相关性，能较好地反映结直肠肿瘤的发生发展，可用于监测结直肠肿瘤对治疗措施的反应等，是一种良好的结直肠癌分子标志物。该结直肠癌分子标志物的发现，为进一步研究结直肠癌的发病机理，探索结直肠癌的治疗靶点提供了新的实验理论基础和新的方向，并可应用在制备诊断或检测结直肠癌患者试剂的领域，丰富了结直肠癌的诊断和检测手段，例如用于制备诊断或检测结直肠癌试剂、基因检测芯片和试剂盒等。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>新乡医学院

<120>结直肠癌相关环状rna基因、结直肠癌分子标志物及其应用

<150>2018109800782

<151>2018-08-27

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>994

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

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