专利名称：Gdu3基因的一种新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及GDU3基因的一种新用途。
背景技术：
双生病毒科(Geminivirida)的病毒是一类植物所特有的病毒，基因组是由单链 环状DNA分子组成。病毒颗粒分子侵入植物细胞后，单链形式的基因组DNA先在细胞核中 转换成双链形式的复制中间体和基因转录模板，中间体通过滚环复制(Rolling Circle)产 生新的单链病毒分子。双生病毒一般存在于热带和亚热带地区，能感染很多经济作物，给农 业生产带来较大损失。《Science》杂志1999年12月3日曾以"双生病毒正在成为作物的 严重威胁"为标题专门报道了这类病毒。近年来，我国广西、云南、广东等地的烟草、番茄和 南瓜等作物上，已先后发现有多种双生病毒。因此，研究双生病毒的致病机理与传播机制进 而制订出相应的防治策略，对保障我国重要经济作物的生产具有重要的意义。双生病毒的 基因组只能编码少数的蛋白，故其在植物宿主中的生命过程及感染途径几乎完全依赖植物 宿主本身的组分。所以，分离植物中参与双生病毒侵染途径的基因，对于了解此类病毒在植 物中的侵染途径，进而在遗传上改良植物以达到抗双生病毒侵染的效果，具有重大的理论 和实践意义。 甜菜严重曲顶病毒(Beet severe curly top virus, BSCTV) (Xee S， StengerDC， Bisaro DM， Davis KR(1994)Identification of loci in Arabidopsis thatconfer resistance to geminivirus infection. Plant J6 (4) :525-535)(ParkSH，Hur J，Park J， Lee S， Lee TK， Chang M， Davi KR， Kim J， Lee S (2002) Identification of a tolerant locus on Arabidopsis thaliana to hypervirulentbeet curly top virus CFH strain. Mol Cells 13(2) :252-258)是双生病毒中的一种，宿主范围很广，包括很多重要的经济作 物，如甜菜，烟草，辣椒，对农业生产造成重大损失。BSCTV基因组示意图见图1。感染BSCTV 的植物见图2。 Glutamine Dumper 3 (GDU3)，是一个尚未被报道的基因。它的命名是源于2004年 Pilot等人报道的一个拟南芥中的同源基因Glutamine Dumper 1 (GDU1) ， Pilot等人将拟 南芥中的其它5个GDU1的同源基因依次命名为GDU2-GDU6 (Pilot G， Stransky H， Bushey DF，Pratelli R，Ludewig U，Wi卿te VP，Fro騰r WB(2004)Overexpression of GLUTAMLNE DUMPER1 leads to hypersecretion of glutaminefrom Hydathodes of Arabidopsis leaves. Plant Cell 16(7) :1827-1840)，它们同属一个植物所特有的家族。
发明内容
本发明的目的是提供一种GDU3基因的一种新用途。 本发明提供的GDU3基因的新用途是GDU3基因在培育抗双生病毒植物中的应用； 所述GDU3是如下(a)或(b)的蛋白质的基因 (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或
添加且与序列1具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。 所述GDU3基因的编码序列为如下1)或2)或3)的DNA分子 1)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子； 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有65X以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA分子；优选与1)或2)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA分子。 所述双生病毒具体可为甜菜曲顶病毒，如甜菜严重曲顶病毒。 本发明还提供了一种培育抗双生病毒植物的方法，是在植物中表达或过量表达编 码如下(a)或(b)的蛋白质的基因，获得抗双生病毒的植物
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或
添加且与序列1具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。 所述GDU3基因的编码序列为如下1)或2)或3)的DNA分子 1)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子； 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有65X以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA分子；优选与1)或2)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA分子。 所述双生病毒具体可为甜菜曲顶病毒，如甜菜严重曲顶病毒。 发明人通过一个高效的BSCTV接种系统，从拟南芥突变体库中分离了 lsbl突变 株，其对BSCTV的感病性约下降37% 。通过原生质体瞬时DNA复制实验，发现BSCTV在lsbl 突变株细胞中的复制明显减弱。通过"质粒拯救"(plasmid rescue)实验，定位了 lsbl中 T-DNA的插入位点，并发现该位点处于染色体上的非编码区。Northern blot及DNA芯片实 验的结果表明lsbl中T-DNA插入位点旁侧GDU3基因的表达量均有着明显的上调。通过构 建GDU3基因的高表达植物并对它们接种BSCTV，发现LSBl/GDU3(Glutamine Dumper 3)基 因过量表达的转基因植物能现增强对BSCTV的抗性。该LSB1/GDU3基因的新用途可用于提 高农作物对BSCTV的耐性，从而减少由于BSCTV的侵染所造成的经济损失，具有良好的应用 前景。 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
图1为BSCTV基因组示意图。
图2为感染BSCTV的植物。A :烟草；B :甜菜；C :拟南芥；D :拟南芥花序；各图中左
边为正常的植物，右边为受BSCTV侵染的植物。 图3为幼苗期lsbl突变株(lsbl)和野生型植株(WT)的形态。 图4为感染BSCTV后lsbl突变株和Col_7植株出现症状的植株所占的比率。 图5为lsbl突变株中BSCTV的积累量检测。
图6为EHA105(pCambia1305. 1)接种后，lsbl突变株(lsbl)和野生型植株(WT)的GUS染色结果。 图7为lsbl突变株(lsbl)和野生型植株(WT)叶片单位面积上有GUS基因表达的位置的数目的比较。 图8为原生质体瞬时DNA复制实验中，BSCTV在lsbl突变株(lsbl)和野生型植株(WT)中的复制水平。 图9为lsbl突变株(lsbl)中T-DNA的插入位点。 图10为lsbl突变株(lsbl)和野生型植株(WT)中GDU3基因的表达量比较。 图11为GDU3基因高表达植株和对照植株的表达量鉴定结果。 图12为感染BSCTV后GDU3基因高表达植株和对照植株出现症状的植株所占的比率。 图13为原生质体瞬时DNA复制实验中，BSCTV在GDU3基因高表达植株和对照植株中的复制水平。 图14为幼苗期的GDU3基因高表达植株和对照植株。
具体实施例方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中，所用到的pCambia BSCTV制备过程如下 BSCTV (ATCC PVMC-6)，以前称为BCTV-CFH株。这个菌株将用EcoRI线性化的BSCTV的双链DNA保存在质粒pCFH上。为了将部分重复的BSCTV基因组DNA以头对尾的方式克隆到双元载体pCAMBIA1300 (CAMBIA， Canberra, Australia)，先用BamHI和EcoRI —起从pCFH上切下一个2. 4kb(约为0. 8个拷贝的基因组DNA)的片段，再将这个片段连接到由BamHI和EcoRI酶切的pCAMBIA1300载体中，构成中间质粒pCAMBIA1300-BSCTV0. 8。再用EcoRI从pCFH上切下3. Okb的完整的BSCTV基因组DNA片段，进而将这个片段插入到经过EcoRI酶切的pCAMBIA1300-BSCTV0. 8中，最终获得pCAMBIA1300-BSCTV。这个质粒上含有以头对尾的方式连在一起的1. 8个拷贝的BSCTV基因组DNA。
实施例1、 GDU3基因新用途的发现 从拟南芥资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center)购买带激活标签(Activation tag)的pSKI015系列的T-DNA突变体库(Weigel D，Ahn JH， BlazquezMA，Borevitz J0，Christensen SK，Fankhauser C，Ferrandiz C，Kardailsky I，MalancharuvilEJ， Neff匪，Nguyen JT， Sato S， Wang ZY， Xia Y， Dixon RA， Harrison MJ， Lamb QJ，Yanofsky MF， Chory J(2000)Activation tagging inArabidopsis.Plant Physiol122(4) :1003-1013)。通过高效的表型筛选系统，从突变体库中分离出一个对BSCTV感病性下降约37%的突变体，将其命名为lsbl (less susc印tible to BSCTV 1)。 lsbl突变株有
一个较为明显的形态学表型，即在幼苗期比野生型植物小，但其成体植物与野生型相比差别不大。为幼苗期lsbl突变株(lsbl)和野生型植株(WT)的形态见图3。
对该lsbl突变株进行以下鉴定
—、 lsbl突变株BSCTV感染率的鉴定 分别用BSCTV(美国典型培养物保藏中心，ATCC， American TypeCultureCollection获得，收藏号PVMC-6) (Lee S， Stenger DC， Bisaro DM， DavisKRQ994) Identification of loci in Arabidopsis that confer resistance togeminivirusinfection. Plant J6 (4) :525-535) (Park SH， Hur J， Park J， Lee S， LeeTK， Chang M， Davi KR， Kim J， Lee S (2002) Identification of a tolerant locusonArabidopsis thaliana to hypervirulent beet curly top virus CFH strain. Mol Cells13(2) :252-258)感染lsbl突变株(lsbl)和Col_7拟南芥植株(Col_7)各200株，每天观察植株的形态学表型，统计两组植株中，出现病毒感染症状的植株所占的比率。试验设置3次重复，结果取平均值。结果见图4。由图4可见，接种BSCTV之后，lsbl突变株出现病毒感染症状的比率远远低于Col-7植株。 在lsbl突变株接种了 BSCTV 3周后，随机选1株出现病毒感染症状的植株和14株没有出现病毒感染症状的植株，提取植株(含接种部位)的总DNA，通过Southernblot实验检测BSCTV的积累。结果见图5。图5中，1 :出现病毒感染症状的植株；2-15 :没有出现病毒感染症状的植株。由图5可见，大多数没有出现病毒感染症状的植株检测不到病毒DNA的积累，只有两株植株(泳道9和泳道15)中可以检测得到少量开环双链病毒DNA (opencircular dsDNA)。 将pCambia1305. 1质粒(CAMBIA公司)转入EHA105，用与接种BSCTV —样的方式接种lsbl突变株(lsbl)和Col-7拟南芥植株(WT)各50株，培养植株。pCambia1305. 1质粒含有一个带内含子的GUS基因，由于含有内含子，农杆菌由于无法对其进行正确剪接而不能表达GUS基因，所以该GUS基因只能在植物细胞中表达。每天检测植株中是否有GUS基因的表达。lsbl突变株和Col-7拟南芥植株接种EHA105(pCambia1305. 1)后均可于第三天在叶片上检测到大量GUS基因的表达(见图6)。用ImageJ的图像软件(美国国立卫生研究院(NIH， National Institute of Health))对lsbl突变株和Col_7拟南芥植株叶片单位面积上有GUS基因表达的位置的数目进行统计和比较，发现两种植株没有明显的区别(见图7)。这表明农杆菌将T-DNA转运到lsbl突变株细胞核内的过程没有被明显地削弱。
以上结果表明BSCTV对lsbl突变株的感染率确实降低了 。
二、 BSCTV原生质体瞬时DNA复制实验 用pCambia BSCTV质粒转染lsbl突变株(lsbl)和Col_7拟南芥植株(WT)的叶肉细胞的原生质体，使BSCTV在细胞内进行瞬时的DNA复制(transient DNAr印lication)。接着通过Southern blot分析BSCTV在lsbl突变株和Col_7拟南芥植株细胞中复制水平
是否存在差异。结果见图8。图8中，1 :WT转染0天；2 :WT转染2天；3 :WT转染4天；4 :
lsbl转染O天；5 :lsbl转染2天；6 :lsbl转染4天。结果表明，与对照相比，BSCTV在1 sb 1
中的复制明显减少。三、T-DNA插入位点的确定及插入位点旁侧基因表达量的分析
由于插入到lsbl突变株中的双元载体pSKI015的T-DNA区域含有pUC19的序列，所以可以通过酶切把PUC19从插入的基因组DNA中"拯救"出来，并可带出部分插入位点旁侧的基因组DNA，通过测序即可确定插入位点，这称为"plasmid rescue"。用位于T-DNA内部靠近其右边界的Spel及靠近其左边界的HindIII分别成功地把pUC19从lsbl的基因组
6DNA中"拯救"出来，确定T-DNA的插入位置的左右两端。根据美国J. Craig Venter研究所 (JCVI，即以前的TIGR， The Institute for GenomicResearch)对拟南芥基因组序列的预 测，这个T-DNA插入位点不在任何基因内部，在插入位点前后10kb的区域里共有三个基因 (见图9)，其中，At5g57685(又名Glutamine Dumper 3， GDU3)在位点的上游，靠近T-DNA 的左边界。 采用Northern blot鉴定lsbl突变株(lsbl)和Col_7拟南芥植株(WT)中GDU3 基因的表达量，发现lsbl突变株中GDU3基因的表达量有明显的上调(见图10)。
实施例2、抗双生病毒植物的培育
—、GDU3基因的克隆 根据GDU3基因的序列(GenBank Accession Number :BT014818设计一对引物如 下 上游引物5' -ATCGGATCC(BamHI)ATGGAAGGAAGACAATATTAC 3';
下游引物5' -CTGACTAGT (Sail) TCAATGTGTCTCACCGTTAC-3，。 以Col-7拟南芥(购自美国拟南芥资源中心，Arabidopsis Biological ResourceCenter)的cDNA为模板，通过RT-PCR扩增GDU3基因的编码序列(CDS, codingsequence)，并在片段两端加上适当的酶切位点。对PCR产物进行0. 8%琼脂糖凝胶 电泳检测，得到分子量约为0.45kb的条带，与预期结果相符。用溶液回收试剂盒(Axygen) 回收该片段，并用两端的酶切位点(BamHI和SalI)对DNA片段进行酶切并连接到经过 相同酶切处理的双元载体pCanHA (将CAMBIA公司的pCambia1300上的植物抗性基因 hygromycin基因替换为kanamycin基因，并将植物中常用的35S花椰菜花叶病毒启动子序 列克隆到载体的多克隆位点区)上，用35S启动子驱动GDU3基因的过量表达。对其进行核 苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的基因与数椐库中的数据相符，即由447个脱氧核糖 核苷酸组成，其开放阅读框(0RF)为序列表中序列2的自5'末端第1至447位脱氧核糖核 苷酸，编码氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质。
二、 GDU3基因高表达植物的培育 将上述构建好的质粒转入农杆菌EHA105中，通过花转化的方法转化Col-7拟南 芥，具体步骤如下 挑单克隆菌落接入5ml含抗生素(10 P g/ml利福平和50 y g/ml卡那霉素)的LB 培养基，28t:摇菌过夜。培养得到的菌液倒入500ml含抗生素(10 y g/ml利福平和50 y g/ ml卡那霉素)的LB培养基，28。C摇菌过夜。将菌液倒入400ml离心管，4000rpm离心20min， 收集菌体。用转化液(5%蔗糖、0.05% Silwet L-77)悬浮菌体，花浸泡法转化Col_7拟南 芥，每组植物浸泡约20秒。用塑料膜覆盖转化后的植物ld，保持湿润。转化后的植物在土 壤中继续生长，待成熟后收集种子。在含有50 i！ g/ml卡那霉素的MS固体培养基上筛选转 基因植物，并通过Northern blot进行鉴定，得到若干GDU3基因高表达植株，从中挑选了 6 株进行具体的分析。 同样，用空载体转化Col-7拟南芥，随机选取2株转空载体植株作为对照植株。
GDU3基因高表达植株和转空载体对照植株的表达量鉴定结果见图11。
三、高表达植株抗双生病毒能力的鉴定 用GDU3基因高表达植株和转空载体对照植株的T2代植株进行以下鉴定试验
1 、 BSCTV感染率的鉴定 分别用BSCTV接种6个株系的GDU3基因高表达植株的T2代植株和2个株系的转 空载体对照植株的T2代植株(每个株系40株)。每天观察植株的形态学表型，统计两组植 株中，出现病毒感染症状的植株所占的比率。试验设置3次重复，结果取平均值。结果见图 12。可见，接种BSCTV后GDU3基因高表达植株出现病症的比例明显低于对照植株。
2、 BSCTV原生质体瞬时DNA复制实验 用pCambia BSCTV转染GDU3基因高表达植株的T2代植株和转空载体对照植株的 T2代植株的叶肉细胞的原生质体，使BSCTV在细胞内进行瞬时的DNA复制(transientDNA implication)。接着通过Southern blot分析BSCTV在GDU3基因高表达植株和对照植株 细胞中复制水平是否存在差异。结果表明，与对照相比，BSCTV在GDU3基因高表达植株中 的复制明显减少。其中一个株系的GDU3基因高表达植株的T2代植株和一个株系的转空载
体对照植株的鉴定结果见图13。图13中，1 :对照植株转染0天；2 :对照植株转染2天；3 : 对照植株转染4天；4 :GDU3基因高表达植株转染0天；5 :GDU3基因高表达植株转染2天；
6 :GDU3基因高表达植株转染4天。
3、形态鉴定 GDU3基因高表达植株的T2代植株的幼苗小于转空载体对照植株的T2代植株的幼 苗。图14为一个株系的GDU3基因高表达植株的T2代植株的幼苗和一个株系的转空载体 对照植株的T2代植株的幼苗的照片。图14中，A为对照植株；B为GDU3基因高表达植株。 表明正是GDU3基因表达量的上调导致了 lsbl的表型。基于上述发现，将GDU3基因重新命
名为LSB1/GDU3。序列表〈110〉中国科学院遗传与发育生物学研究所〈120>GDU3基因的一种新用途〈130〉CGGNARY92027〈160>2〈210>1〈211>148〈212>PRT〈213〉鼠耳芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)〈400>1Met GluGly Arg Gin Tyr Tyr Pro Pro ArgGluAsnValGluGlyAsn15 1015Arg ThrThr Met Gly Gly Gly Pro His SerProTrpHisSerProVal20 2530Pro TyrLeu Phe Gly Gly Leu Ala Ala MetLeuGlyLeulieAlaPhe35 4045Ala LeuLeu lie Leu Ala Cys Ser Tyr TrpArgLeuSerGlyTyrLeu505560Asp GlyGlu Glu Asn Gin Ser Arg Glu ArgAspLeuGluValGlyAsp0092]65707580
0093]ValLysProAsp Lys Thr Ala ValLys Pro ValAla Leu Pro Glu Lys
0094]859095
0095]PheLeuVallie Met Ala Gly AsnVal Lys ProThr Tyr Leu Ala Thr
0096]100105110
0097]ProSerValLys Thr Cys Thr CysAsp Asp AspAsp Asp Glu Asp Asp
0098]115120125
0099]AspValGluGly Ser Asp Gin ValVal Pro ArgSer Ser Glu Ser Asn
0100]130135140
0101]GlyGluThrHis
0102]145
0103]〈210>2
0104]〈211>447
0105]〈212>DNA
0106]〈213〉鼠耳芥属拟南芥(Arabidopsisthaliana)
0107]〈400>2
0108]3tgg朋gg朋gacaatetta ccctccgagag朋33Cgttg朋gg朋3C3g朋CC3CC3tg60
0109]gg￡lgg￡lgg￡lCctcactcacc gtggcattcaccggttccttatctctttgg tggtttagca120
0110]gcgatgcttggtctcatagc ttttgctcttctaatcctcgcttgctctta ctggcgtctc180
0111 ]tccggttetctegacggcga gg朋朋cc3ggagatcttga agtcggagat240
0112]gtga朋cctg3C3333CggC ggtg朋gcctgtagctttgccggagaagtt cttggtgatt300
0113]atggccggaaatgtcaaacc tecttacttagcaacgccgtcggte朋朋c gtgtecttgt360
0114]g￡lCg￡ltg￡ltg3Cg3tg朋g3 tgatgacgtggagggaagtg atcaggtggt gccgcggagt420
0115]3gtga朋gte 3cggtgagac 3cattg344权利要求
编码如下(a)或(b)的蛋白质的基因在培育抗双生病毒植物中的应用(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述基因的编码序列为如下1)或2)或3)的DNA分子1) 其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2) 在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3) 与l)或2)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述双生病毒为甜菜曲顶病毒。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述双生病毒为甜菜严重曲顶病毒。
5. —种培育抗双生病毒植物的方法，是在植物中表达或过量表达编码如下(a)或(b) 的蛋白质的基因，获得抗双生病毒的植物(a) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b) 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且与序列1具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述基因的编码序列为如下1)或2)或 3)的DNA分子1) 其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2) 在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3) 与l)或2)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述双生病毒为甜菜曲顶病毒。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述双生病毒为甜菜严重曲顶病毒。
全文摘要
本发明公开了GDU3基因的一种新用途。本发明提供的GDU3基因的新用途是其在培育抗双生病毒植物中的应用；所述GDU3基因是编码如下(a)或(b)的蛋白质的基因(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。双生病毒的宿主范围很广，包括很多重要的经济作物，如甜菜、烟草、辣椒，对农业生产造成重大损失。应用本发明的方法，可提高农作物对双生病毒的耐性，从而减少由于双生病毒的侵染所造成的经济损失。本发明具有重大的经济价值和社会意义。
文档编号C12N15/82GK101775397SQ20091007690
公开日2010年7月14日 申请日期2009年1月13日 优先权日2009年1月13日
发明者吴耀荣, 谢旗, 陈浩 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所