本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种缓释sdf-1的胶原/海藻酸钠复合水凝胶的制备方法。
背景技术：
：：创伤性脑损伤(traumaticbraininjury，tbi)是一种具有高发病率、高致死率的中枢神经系统缺损性疾病，而创伤部位由于缺乏充足的血液和营养输送导致其神经修复和再生十分有限。干细胞移植能有效治疗肝、肾、神经等损伤性疾病，促进损伤区细胞的再生，但由于移植干细胞易流失且成活率低等特点，严重制约了干细胞移植的应用。上世纪80年代以来，组织工程技术不断发展和完善，为人类解决脑损伤这一难题带来了希望。利用组织工程技术，选择具有良好生物相容性的可降解支架材料，并对支架材料进行三维结构的改造，进而改善干细胞生存微环境、增加干细胞的靶向迁移能力，对于提高干细胞的移植效果至关重要。可注射水凝胶(injectablehydrogel）具有高水含量、与ecm的相似性、多孔结构、最小侵入性质等特点，已成为组织工程领域的“明星”材料。常见生物衍生支架材料，如胶原/明胶、海藻酸钠、透明质酸、纤维蛋白肝素等，具有天然自带的活性基团，与人工合成支架相比具有无免疫原性，能促进干细胞的增殖、粘附、迁移和分化等作用。i型胶原（collagen,col）是能够调控细胞功能的一种细胞外基质蛋白，能够以水凝胶的形式研制出神经再生支架，用于构建细胞培养和定向分化的3d微环境。胶原支架可以促进人间充质干细胞在脑损伤部位的迁移和存活，提高干细胞治疗效果。海藻酸钠（sodiumalginate，sa）是从褐藻中提取的水溶性聚醛酸，具有良好的生物相容性，有利于神经轴突的生长和细胞的迁移，能够促进脊髓损伤的功能恢复与神经再生。因此，将sa溶液和col溶液交联构建出新型col/sa神经支架，为干细胞提供生存的微环境，促进tbi的神经修复与再生。基质细胞衍生因子-1(stromalcellderivedfactor1,sdf-1)及其受体cxcr4趋化因子12(cxcl12)是干细胞趋化、活化和归巢的关键因子。有研究发现，在tbi损伤区域周围sdf-1的表达量会增加，因而，增加对损伤诱导的sdf-1的移植敏感性是提高干细胞移植效果的关键。具有局部释放sdf-1的支架治疗效果明显优于无释放sdf-1的对照组支架。目前国内外主要是进行plga、pla、ha/lamini等人工合成材料与sdf-1结合的研究，尚无利用col/sa支架材料包载sdf-1进行tbi神经修复与再生的研究。同时有报道发现，sdf-1对干细胞的趋化效果具有二重性，浓度过高趋化归巢效果减弱，而浓度过低者则达不到明显的趋化效果。因此本发明完善了sdf-1释放系统，利用col/sa复合水凝胶缓慢释放sdf-1，使sdf-1持续稳定的释放，从而达到其趋化效果。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有技术的不足，研发一种缓释sdf-1并且具有良好生物相容性的胶原/海藻酸钠复合水凝胶的制备方法，用以解决sdf-1释放快、降解快、利用率较低，达不到对bmscs趋化作用的缺点；同时本发明利用col、sa等与细胞外基质相似的凝胶材料，将其与sdf-1复合，制备出在一段时间内持续缓慢释放sdf-1因子的sdf-1/col/sa复合水凝胶，而且这种复合水凝胶对骨髓间充质干细胞（bmscs）具有良好的细胞相容性，负载bmscs的sdf-1/col/sa水凝胶移植治疗tbi大鼠，能够改善其学习记忆能力和神经缺损情况，从而更好的修复脑损伤，实现对tbi大鼠的治疗。本发明的目的是通过以下技术方案来实现：本发明提供了一种缓释sdf-1的胶原/海藻酸钠复合水凝胶的制备方法，它包括以下步骤：（1）、在容量瓶中，称取575μl冰乙酸用双蒸水定容至100ml，得0.1m的乙酸溶液；用吸管吸取50ml的上述乙酸溶液，加入盛有0.5g胶原粉末的瓶中，颠倒使其充分溶解，用ph计调节胶原溶液ph至7.2，获得质量分数1%的胶原溶液a；（2）、将转子加入装有50ml双蒸水的玻璃瓶中，打开磁力搅拌器，分析天平称取1gsa缓缓加入至玻璃瓶中，24h后待sa完全溶解，获得质量分数2%的sa溶液b；（3）、称取0.05gcaco3粉末加入至10ml双蒸水中，获得50mm的caco3溶液c；（4）、称取0.1184g葡萄糖内酯粉末加入至10ml的双蒸水中，获得100mm的gdl溶液d；（5）、将胶原溶液a与sa溶液b等体积混合，制得质量分数0.5%col：1%sa的col/sa的复合溶液e；（6）、将溶液e、溶液c和溶液d依次按体积比2：1：1充分混匀后缓慢滴加sdf-1溶液，以最终sdf-1的浓度150ng/ml，得到缓释sdf-1的胶原/海藻酸钠复合水凝胶。根据上述的缓释sdf-1的胶原/海藻酸钠复合水凝胶的制备方法，所述缓释sdf-1的胶原/海藻酸钠复合水凝胶为0.25%col：0.5%sa的col/sa的复合水凝胶。与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、本发明制备sdf-1/col/sa复合水凝胶是通过sa-caco3-gdl(ca2+与coo-摩尔比0.5)体系所制备的海藻盐水凝胶呈半透明状，内部凝胶法可缓慢释放ca2+，与传统cacl2相比，凝胶时间可以根据需要控制，而col/sa复合凝胶内部更加均一，有天然的网状交联孔隙，有利于种子细胞的黏附、增殖、分化，并且sdf-1/col/sa复合水凝胶具有良好的生物相容性，细胞相容性，是一种适宜于组织工程神经修复的良好支架；sdf-1/col/sa复合水凝胶可以缓释sdf-1，缓释时间能达到18天，大幅度提高了sdf-1的利用率，同时第一天释放量能达到40%，满足了定向趋化的浓度要求，解决了使用了大剂量sdf-1所造成的高成本问题；2、本发明产品对tbi的临床治疗提供了可靠的支架材料，经过动物实验证实，sdf-1/col/sa复合水凝胶对tbi大鼠移植治疗21天至28天学习记忆能力明显改善，神经缺损得到了有效治疗。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为col/sa、sdf-1/col/sa凝胶外观图片；图2为sdf-1/col/sa凝胶扫描电镜形貌特征；图3为col/sa凝胶、sdf-1/col/sa复合水凝胶的凝胶时间的变化；图4为col/sa凝胶、sdf-1/col/sa复合凝胶的含水率、降解率的变化；图5为elisa实验检测sdf-1/col/sa凝胶中sdf-1的缓释；图6为cck-8实验检测bmscs在sdf-1/col/sa凝胶中1、3、5、7天的增殖；图7为吖啶橙（ao）-溴化乙锭(eb)双染法检测col/sa凝胶、sdf-1/col/sa凝胶对bmscs生物活性的影响；图8为transwell小室法检测col/sa凝胶、sdf-1/col/sa凝胶对bmscs的迁移作用的影响；图9为tbi组大鼠与bmscs/sdf-1/col/sa组大鼠术后的体重变化；图10为tbi组大鼠与bmscs/sdf-1/col/sa组大鼠术后的mnss评分；图11为水迷宫实验检测tbi组大鼠与bmscs/sdf-1/col/sa组大鼠术后的空间记忆能力恢复的影响；图12为cv染色检测tbi组大鼠与bmscs/sdf-1/col/sa组大鼠术后的损伤体积的变化。具体实施方式下面将结合具体实例对本发明进一步详细说明。但以下说明只是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非只局限于此实施例。1、col/sa凝胶、sdf-1/col/sa复合凝胶的制备：（1）在容量瓶中，取575μl冰乙酸加双蒸水定溶至100ml，获得0.1m的乙酸溶液。用吸管吸取50ml的上述乙酸溶液，加入盛有0.5g胶原粉末的瓶中，轻轻颠倒使其充分溶解，用ph计调节胶原溶液ph至7.2，获得质量分数分数1%的胶原溶液a；（2）将转子加入装有50ml的双蒸水的玻璃瓶中，打开磁力搅拌器，分析天平称取1gsa缓缓加入玻璃瓶中，24h后待sa完全溶解，获得质量分数分数2%的sa溶液b；（3）称取0.05gcaco3粉末加入至10ml的双蒸水中，获得50mm的caco3溶液c；（4）称取0.1184g葡萄糖内酯（dlta-gluconolactone，gdl）粉末加入至10ml的双蒸水中，获得100mm的gdl溶液d;（5）将溶液a与溶液b等体积混合，制得质量分数0.5%col：1%sa的col/sa的复合溶液f；（6）按体积比2：1：1将溶液e，溶液c，溶液d充分混匀后缓慢滴加sdf-1溶液，最终sdf-1的浓度150ng/ml。制得缓释sdf-1质量分数为0.25%col：0.5%sa的col/sa的复合水凝胶。图1：col/sa、sdf-1/col/sa凝胶外观图片，肉眼观察sdf-1/col/sa、col/sa凝胶均呈半透明状，外形可根据所用模具的不同任意塑性。通过针头喷射凝胶而不堵塞（添加蓝墨水以使水凝胶着色仅用于可视化）2、扫描电子显微镜检测水凝胶的内部形态结构-80℃冷冻后，用冷冻干燥器将水凝胶充分干燥，并在金喷涂后通过扫描电子显微镜（sem，feiquanta200，netherlands）观察它们的形态。图2：sem观察水凝胶内部呈三维多孔网络结构，孔隙分布均匀；3、倒置凝胶法检测col/sa、sdf-1/col/sa复合水凝胶的胶凝时间取1ml凝胶前溶液倒入试管中，通过倾斜法测定凝胶完全形成的时间，即胶凝时间。图3：两种凝胶的凝胶时间均在7min左右，满足可注射时间要求。4、冷冻干燥法检测col/sa、sdf-1/col/sa复合水凝胶的的含水率、降解率将制备出的水凝胶取出后，用滤纸吸取周边水分称取湿重w0，待冷冻干燥后称取干重w1，通过公式计算含水率通过公式计算含水率w,w=(w0-w1)/w0]×100%。；将冷冻干燥后的凝胶样品称重，质量记为wi。然后放入双蒸水中浸泡,每隔一天换一次液，1、3、5、7天后取出，冷冻干燥再次记录样品的质量wd，计算质量损失率，通过下面的公式计算质量损失率l：l=[(wi-wd)/wi]×100%。图4：两种凝胶含水率均在97%以上，无明显差异；降解率随着降解时间的持续，降解率变大，但两种凝胶之间的降解率无明显差异。5、elisa实验检测sdf-1/col/sa复合水凝胶中1至18天sdf-1的缓释能力（1）根据试剂说明书要求，将sdf-1溶解在pbs溶液中，配置成终浓度为100μg/ml的sdf-1溶液，分装保存于-80℃冰箱中。取25μl的上述sdf-1溶液滴加至冷冻抽干后的col/sa凝胶中；（2）将上述载有sdf-1的sdf-1/col/sa复合凝胶浸泡于1ml的pbs溶液中，置于37℃的摇床中，分别于1，2，3，6，9，12，15，18天收集pbs溶液，并加入等量的pbs溶液。将收集到的pbs溶液分装储存与-80℃冰箱中备用；（3）根据sdf-1/cxcr12酶联免疫吸附测定试剂盒说明书要求绘制0ng/ml、0.125ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml的浓度标准曲线；（4）将取得的上述pbs浸泡液用试剂检测盒中的样品稀释液稀释10000倍，按照试剂盒操作说明书进行检测，用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（od值），计算所得浓度的平均值乘以稀释倍数后，代入标准曲线后得到sdf-1累计浓度释放曲线。图5：elisa检测缓释结果显示在18天释放过程中，sdf-1/col/sa复合水凝胶能够持续稳定的释放sdf-1,第1天释放量达到40%左右，在第2天至18天维持稳定速度释放，这说明sdf-1可以在col/sa复合水凝胶中缓慢释放并能维持较长时间。6、cck-8实验检测包载bmscs的col/sa、sdf-1/col/sa复合水凝胶的生物相容性（1）称取一定量sdf-1粉末，col粉末，sa粉，caco3粉末，gdl粉末置于紫外线中照射30min，用dmem/f12完全培养基分别配制col与sa浓度比为1:2的混合溶液，使用0.22μm滤膜对caco3溶液，gdl溶液，col/sa混合溶液及gdl溶液过滤除菌。sdf-1/col/sa复合水凝胶的制备过程参照步骤1；（2）选取同一批次长势良好地p3代bmscs，消化离心弃上清后，用相应体积的caco3溶液重悬细胞，按照步骤1中所述比例，加入col/sa混合溶液，之后加入一定量gdl溶液，调整细胞密度为1×106/ml，col/sa复合水凝胶中滴加相应体积的sdf-1溶液，在迅速混匀后分装到24孔板中；（3）待凝胶形成后用移液枪吸去上清，pbs溶液清洗3次，加入新的含10%血清的dmem/f12完全培养基，于37℃、5%co2的细胞培养箱中孵育，每隔24h更换新的培养液；（4）在培养箱中培养1、3、5、7天后吸取24孔板中每孔原有培养基，pbs溶液清洗3次，每孔凝胶中加入1ml新的不含血清的dmem/f12完培养基，在避光条件下每孔加入100μl的cck-8溶液；（5）在37℃、5%co2的细胞培养箱中孵育2h后，将每孔的混合溶液转移至新的96孔板中，用酶标仪于450nm波长条件下检测吸光值。图6：cck-8结果显示，随着培养天数的增加，bmscs在sdf-1/col/sa复合水凝胶中生长状态良好，密度增加，说明sdf-1/col/sa复合水凝胶对细胞没有毒性，有利于bmscs的粘附和增殖。7、ao-eb染色检测col/sa、sdf-1/col/sa复合水凝胶对bmscs生物活性的影响（1）包载bmscs的col/sa、sdf-1/col/sa复合水凝胶制备过程同步骤6；（2）将37℃、5%co2的细胞培养箱中孵育24h后的水凝胶取出后，用移液枪吸取原有培养基，用pbs溶液清洗3次后，将按照dmem/f12:ao:eb=50:1:1配置的染色液加入至每孔凝胶中，37℃恒温箱内避光孵育5min；（3）用预先准备好的载玻片和盖玻片将每孔凝胶压缩均匀，然后用荧光倒置显微镜观察水凝胶中细胞的活死状态状态，选取多个不同视野，计算红、绿细胞个数，统计做图。图7：其中左图是活细胞百分率统计图，右图是ao-eb染色结果图片。结果显示与col/sa复合水凝胶相比，bmscs在sdf-1/col/sa复合水凝胶生长状态更好（p<0.05），活细胞数量更多，说明sdf-1/col/sa复合水凝胶与bmscs具有良好的生物相容性。8、transwell实验检测col/sa、sdf-1/col/sa复合水凝胶对bmscs迁移作用的影响（1）选取同一批次长势良好地p3代细胞，随机分为col/sa复合水凝胶组、sdf-1/col/sa复合水凝胶组；（2）利用transwell小室来检测sdf-1/col/sa复合水凝胶对bmscs迁移能力的影响：待细胞生长至密度为60%左右，用胰蛋白酶消化1-2min，然后用含10%fbs的dmem/f12培养基终止消化，转速离心机500g离心5min，收集细胞；（3）用不含fbs的dmem/f12培养基吹悬细胞，调整细胞密度为1×105/ml，选用孔径为8μm的24孔transwell小室，取300μl的上述细胞悬液添加至上室；（4）col/sa复合水凝胶组下室先加入100μlcol/sa复合水凝胶混合液，待其完全凝结后加入600μl的不含fbs的dmem/f12培养基，sdf-1/col/sa复合水凝胶组下室先加入100μlsdf-1/col/sa复合水凝胶混合液，待其完全凝结后加入600μl的不含fbs的dmem/f12培养基；（5）在培养箱中培养12h后，用移液枪吸取孔中培养液，用pbs溶液清洗3次，用4%多聚甲醛室温固定30min；（6）pbs溶液清洗小室3次，戏曲残留多聚甲醛溶液，然后加入预先配置溶解充分的1%j结晶紫溶液。室温染色20min；（7）弃去结晶紫，用pbs溶液清洗多次用以洗去残留染料，直至背景清晰为止；（8）用脱脂棉签轻轻拭去小室上方层没有迁移的的bmscs；（9）在倒置显微镜下随机选择5个不同的视野观察拍照，并统计细胞迁移数量。图8：其中左图是迁移率的统计结果，右图是结晶紫染色后的bmscs图片。结果表明加入两种复合凝胶12h后，与col/sa复合水凝胶相比，sdf-1/col/sa复合水凝胶能明显促进bmscs的迁移（p<0.05），bmscs对sdf-1/col/sa复合水凝胶具有明显的趋向性。9、包载bmscs的sdf-1/col/sa复合水凝胶对tbi大鼠体重变化和神经功能缺损的评估（1）sd大鼠脑损伤模型的建立本专利采用自由落体撞击构建脑损伤模型，具体步骤如下：①动物麻醉：生理盐水注射液配置10%的水合氯醛，称取大鼠体重，按照（3.5ml/kg）对大鼠进行麻醉，用剃毛器进行备皮；②头部固定：将大鼠以俯卧位固定在脑立体固定仪上，调整定位仪各轴读数，使大鼠头部水平；③暴露骨窗：使用75%酒精进行消毒，之后用手术刀沿头皮中线矢状正中切口处纵行切开头皮，分离筋膜及皮下组织，暴露右侧颅骨，前囟后约3mm，中线旁开约2mm，使用环形钻钻开一个直径5mm骨窗，确保硬脑膜完整，大脑充分暴露；④立体打击：调整颅脑打击器，使撞针正对骨窗中心，缓慢下降打击器，待撞针与硬脑膜接触后，继续下降2.5mm，将40g撞击锤从20cm高处自由下落，致中度脑损伤，打击完成后迅速上升打击器；⑤伤口缝合：手术完成后，清理创面并及时止血，使用骨蜡封闭骨窗，缝合头皮；⑥术后护理：手术后监测大鼠呼吸，心跳，给予保暖处理，直至大鼠完全苏醒，生命体征平稳后放回笼内，按照体重通过腹腔注射20万单位青霉素，连续三天，每天一次。（2）动物分组及移植治疗①动物分组：造模成功后，将大鼠根据预先设计好的分组，随机分为tbi组、bmscs/sdf-1/col/sa治疗组，每组8只大鼠tbi组：单纯注射100μl生理盐水；bmscs/sdf-1/col/sa治疗组：将3×106bmscs同100μlsdf-1/col/sa复合水凝胶充分混合后移植；②移植治疗：在tbi造模一周后，使用水合氯醛重新麻醉大鼠，将大鼠固定于脑立体定位仪上，重暴露原骨窗后使用250μl微量注射器于病变腔中心原位移植，针尖位于硬脑膜下1.0mm，5min内将移植物缓慢注入损伤部位，继续留针5min，缓慢拔出针尖。最后用骨蜡封闭缺损骨，止血后缝合头皮。给予保暖处理，直至大鼠完全苏醒，生命体征平稳后放回笼内。及时添加饮用水，每隔两天更换一次垫料。（3）两组大鼠tbi大鼠体重变化移植治疗后在1、3、7、14、21、28天固定时间内称量每组大鼠的体重并记录。图9：体重结果表明：移植治疗后，随着治疗时间的延长bmscs/sdf-1/col/sa治疗组大鼠体重增加明显（p<0.05）。（4）两组大鼠神经功能缺损情况的评估移植手术后，tbi大鼠在1、3、7、14、21、28天固定时间内根据modifiedneurologicseverityscore（mnss）评分量表对两组大鼠的运动、感觉、平衡能力以及反射情况等方面予以评估，采用双盲法评判并记录分值。从0分（正常）-18分（最严重），记录每只大鼠的评分。表1：大鼠mnss评分标准项目评分运动实验6提尾实验3前肢屈曲1后肢屈曲1头部在30s内偏离垂直轴>100o1将大鼠放置于地板上（正常值=0；最大值=3）3正常行走0不能直线行走1向轻瘫侧转圈2向轻瘫侧倾倒3感觉实验2放置实验（视觉和触觉测试）1本体感觉实验（深感觉，向桌子边缘压鼠爪刺激肢体肌肉）1平衡能力测试6稳定平衡姿势0紧抓平衡木边缘1紧抱平衡木，一侧肢体从平衡木垂落2试图从平衡木上平衡但跌落（40秒-60秒）4试图从平衡木上平衡但跌落（20秒-40秒）5试图从平衡木上平衡但跌落（0秒-20秒）6反射丧失和不正常运动4耳廓反射（接触外耳道时摇头）1角膜反射（用棉线轻触角膜时眨眼）1惊恐反射（对快弹硬纸板的噪音有运动反应）1癫病、肌阵挛、肌张力障碍1图10：mnss评分结果显示：移植治疗1天,tbi组和bmscs/sdf-1/col/sa治疗组评分均在（10.8±0.5）和（11.3±0.2）分，说明造模均一性良好，治疗21后sdf-1/col/sa复合水凝胶治疗组评分明显降低（p<0.05）,说明sdf-1/col/sa复合水凝胶治疗组能明显改善tbi大鼠的神经缺损情况。10、包载bmscs的sdf-1/col/sa复合水凝胶对tbi大鼠空间记忆恢复情况、大鼠脑损伤体积的影响（1）水迷宫实验检测大鼠空间记忆能力的恢复情况①移植后第23d-27d时，对四组大鼠（每组8只）进行morris水迷宫实验检测两组大鼠的空间定位的学习记忆能力；②每次实验前清洗大鼠训练的水池（直径1.2m、水深为0.6m、平台直径为10cm），排除上次实验的气味干扰；③轨迹记录系统将水池分为四个象限（i、ii、iii、iv），其中平台所在象限为第i象限。在桶壁固定位置上分别设置标记“△”、“○”、“□”，以利于大鼠判断定位。每次训练时开始前，在水池中注入19-21℃的温水，没过平台上端2cm为止，调节好摄像头及程序参数，开始对大鼠进行训练。实验结束后，及时擦干擦干大鼠，并放回鼠笼；④定位巡航实验：每天上午、下午各训练1次，连续训练6天。实验开始时，先将大鼠放在平台上，让其自主观察周围环境10s后，将其头部面壁放入水中，寻找平台，若在60秒内找到平台，则进行下一象限的实验，若60秒内未能找到平台，则将其引导至平台，并让其在平台上停留10s，再进行下一象限实验。⑤空间探索实验：在定位巡航实验结束24h后，将平台撤去。任意选择相同的象限将两组大鼠放于水中，记录其在60s内的游泳轨迹。实验结束后，及时擦干擦干大鼠，并放回鼠笼。图11：水迷宫结果显示：移植治疗后23天~27天，大鼠巡航轨迹图结果表明bmscs/sdf-1/col/sa复合水凝胶治疗组大鼠逃避潜伏期时间明显缩短，说明其学习记忆能力随着治疗天数的延长明显提高。（2）cv染色检测两组大鼠脑损伤体积变化情况①取材：大鼠移植治疗术后28天，麻醉大鼠，将大鼠仰卧位固定在解剖台上，沿腹部中线和胸骨中线剪开皮肤，剪开膈膜后，完全暴露心脏。剪开右心耳，用头皮针由左心室向声主动脉方向插入。先后灌注40ml的生理盐水和40ml的4%多聚甲醛，当肝脏变白，并且四肢僵硬后，剪断颈部，小心剥离取出脑部。将脑组织转移至预先准备好的4%多聚甲醛中固定24h，备用；②脑切片制备：将上述固定后的大鼠脑组织先后放入配置好的10%、20%、30%的蔗糖溶液中各进行梯度脱水24h，72h后脑组织沉底，经过oct包埋后，使用冰冻切片机制作厚度为20μm的切片；③cv染色：按照paxions编写的《theratbraininstereotaxiccoordinates----compactthirdedition》，在大鼠病灶部位前后2mm处，从头至尾连续冠状切片，每连续10张切片中随机一张，进行cv染色。使用imagej软件，结合比例尺，计算每个脑片中的缺损面积，应用公式得出大脑损伤面积：大脑损伤体积（mm3）=平均损伤面积×脑片数×10×0.03。图12：cv染色结果显示：通过颅脑打击器建立的脑外伤组织皮层损伤面积约15%~30%，造成顶叶、蛛网膜下腔出血，但未伤及海马部位，属于中度脑损伤模型，满足实验要求。移植治疗28后，与tbi组相比，bmscs/sdf-1/col/sa复合水凝胶治疗组大鼠病灶区的损伤面积明显减少，恢复效果更为明显。本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12