一种水产用乳酸菌制剂及其制备方法与流程

本发明公开了一种水产用乳酸菌制剂及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术：

随着我国水产养殖行业的迅猛发展，集约化、规模化的生产模式导致养殖环境日趋恶化，疾病的暴发日渐频繁，影响了水产养殖产量的增长和水产行业的可持续性发展。抗生素作为传统的饲料添加剂，在抑制病原微生物的繁殖，减少细菌代谢毒素等方面均起到了重要作用。但是，抗生素的长期使用和滥用导致动物胃肠道正常菌群失调、对动物机体免疫力产生不良影响、产生耐药性和药物残留等副作用，给养殖业和人类健康带来了安全隐患。开发安全、优质、营养的无公害绿色水产品已成为当今社会的共识。微生态制剂目前实现水产养殖可持续发展，保障绿色产业，促进水产养殖业发展的安全有效途径。微生态制剂能够刺激机体的免疫系统，调节机体内微生态平衡，拮抗致病微生物，降解养殖过程中有机废物等来达到提高免疫力、抗病、促生长和净化水质等作用。

乳酸菌是常见的微生态制剂菌种，研究表明人体摄入补充乳酸菌能够治疗肠道功能紊乱，维持肠道菌体平衡等。在家禽养殖中，乳酸菌作为饲料添加剂可促进动物的生长发育，防控疾病以及改善禽产品的品质；在食品行业。乳酸菌可作为食品添加剂，提高酸度改善风味，增加养分提高营养价值，延长食品保质期，防止腐败的作用。在水产集约化养殖过程中大量使用，能调控藻相、净化水质，提高了养殖的成活率。乳酸菌能够产生的各种代谢产物，包括酸性物质、乳酸菌素、二氧化碳和过氧化氢等，抑制病原菌的定植和繁殖，甚至杀死细菌。乳酸菌微生态制剂具有无毒副作用、无耐药性、无残留、成本低、效果显著、不污染环境等优点，是一种能够代替抗生素使用的绿色饲料添加剂。目前国内应用的乳酸菌制剂多为液体制剂，由于乳酸菌在液体中很容易死亡，其保存问题难以解决，所以一直没能得到推广使用。本发明以水产养殖环境及动物体内分离的乳酸菌为出发菌种，通过冻干技术所得乳酸菌冻干制剂具有乳香味，细菌活性强，菌含量高，保质期长等特点，能够增强机体免疫功能，促进饲料转化率，增强动物的抗病能力。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种水产用乳酸菌制剂，同时提供其相应的制备方法是本发明的另一目的。

基于上述目的，本发明采取如下技术方案：一种水产用乳酸菌制剂，每1g制剂中含乳酸乳球菌≥5×10⁸cfu，水生乳杆菌≥5×10⁸cfu，嗜酸乳杆菌≥5×10⁸cfu，冻干保护剂0.1-0.2g。

所述冻干保护剂的质量比为：10-20％脱脂奶粉、5-10％蔗糖，5-10％海藻糖，5-10％低聚糖。所述低聚糖包括低聚果糖，低聚麦芽糖，低聚木糖。

一种混合型水产用乳酸菌制剂的制备方法，包括以下步骤：

(a)制备复合菌菌液：

将乳酸乳球菌、水生乳杆菌和嗜酸乳杆菌接种到mrs培养基中发酵18-36小时，发酵温度30-40℃，所得各菌含量≥5×10⁹cfu/ml，然后按比例混合搅拌均匀后得混合菌液；

(b)将(a)所获得的菌液加入冻干保护剂，将准备好的菌液分装到冻干瓶中，然后进行预冷；

(c)真空冷冻干燥，得成品。

所述的一种水产用乳酸菌制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中所用菌株为乳酸乳球菌cect539，水生乳杆菌dsm21051，嗜酸乳杆菌ncim2285；混合液中各菌占总体积比例为10-50％v/v。

所述的一种水产用乳酸菌制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，以质量百分比计，所述冻干保护剂的配方包括：10-20％脱脂奶粉、5-10％蔗糖，5-10％海藻糖，5-10％低聚糖。

所述的一种水产用乳酸菌制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，在-40～-50℃下预冻2-4小时。

所述的一种水产用乳酸菌制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)中，真空冷冻干燥36小时。

所述的一种水产用乳酸菌制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，低聚糖包括低聚果糖，低聚麦芽糖，低聚木糖。

本发明的优点是：将多株从水生动物生长环境和肠道中分离出来的具有益生作用的乳酸菌在适宜的培养基中进行单独发酵，然后按照一定的比例进行混合，配以冻干保护剂和低聚糖等益生元，然后进行真空冷冻干燥，提高了细菌在自然状态下的存活率。该复合微生态制剂能以休眠状态的菌体被水生动物摄入、定植到胃肠道中并消耗氧气，创造厌氧环境，低聚糖等益生元能促进肠道内有益菌的生长，该复合微生态制剂还能净化养殖水体，改善水生动物养殖环境。因此，该复合微生态制剂能有效抑制有害菌的定植和有害物质的产生，调节胃肠道内正常菌群的平衡，提高水生动物的免疫力，调节水质，保证机体健康。

附图说明

图1鲫鱼感染嗜水气单胞菌感染后乳酸菌组和对照组死亡率

具体实施方式

以下实施例只为进一步说明本发明，不以任何形式限制本发明，本实施例中所涉及的菌株乳酸乳球菌cect539，水生乳杆菌dsm21051，嗜酸乳杆菌ncim2285分别购自西班牙菌种保藏中心(cect)、德国微生物菌种保藏中心(dsm)以及英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心(ncim)。

实施例1

将乳酸乳球菌cect539，水生乳杆菌dsm21051，嗜酸乳杆菌ncim2285三种菌株按照斜面、液体种子、液体发酵的顺序进行培养，斜面和液体发酵培养基为mrs培养基，其组成为(w/v)：蛋白胨1％，牛肉粉0.5％，酵母粉0.4％，葡萄糖2％，吐温800.1％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸三铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，固体培养基加入琼脂粉1.5-2％，ph6.2左右。将种子液按照5％的接种量接种到发酵培养基中，在37℃通气培养24-48h，使得每种菌的菌含量≥10⁹cfu/ml。

将三种菌发酵液按体积百分比20％∶20％∶30％∶30％混合，得复合菌液，加入冻干保护剂该冻干保护剂的配方包括：脱脂乳、蔗糖和低聚果糖，其中，在冻干保护剂中，脱脂乳为10％，蔗糖5％、低聚果糖10％，分装，接下来以-80℃进行预冻4小时，最后冷冻干燥36小时即可。

实施例2：

将乳酸乳球菌cect539，水生乳杆菌dsm21051，嗜酸乳杆菌ncim2285三种菌株按照斜面、液体种子、液体发酵的顺序进行培养，斜面和液体发酵培养基为mrs培养基，其组成为(w/v)：蛋白胨1％，牛肉粉0.5％，酵母粉0.4％，葡萄糖2％，吐温800.1％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸三铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，固体培养基加入琼脂粉1.5-2％，ph6.2左右。将种子液按照5％的接种量接种到发酵培养基中，在37℃通气培养24-48h，使得每种菌的菌含量≥10⁹cfu/ml。

将三种菌发酵液按体积百分比40％∶30％∶20％∶10％混合，得复合菌液，加入冻干保护剂该冻干保护剂的配方包括：脱脂乳、蔗糖和低聚果糖，其中，在冻干保护剂中，脱脂乳为10％，蔗糖5％、低聚果糖10％，分装，接下来以-80℃进行预冻4小时，最后冷冻干燥36小时即可。

实施例3：

将乳酸乳球菌cect539，水生乳杆菌dsm21051，嗜酸乳杆菌ncim2285四种菌株按照斜面、液体种子、液体发酵的顺序进行培养，斜面和液体发酵培养基为mrs培养基，其组成为(w/v)：蛋白胨1％，牛肉粉0.5％，酵母粉0.4％，葡萄糖2％，吐温800.1％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸三铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，固体培养基加入琼脂粉1.5-2％，ph6.2左右。将种子液按照5％的接种量接种到发酵培养基中，在37℃通气培养24-48h，使得每种菌的菌含量≥10⁹cfu/ml。

将三种菌发酵液按体积百分比25％∶25％∶25％∶25％混合，得复合菌液，加入冻干保护剂该冻干保护剂的配方包括：脱脂乳、蔗糖和低聚果糖，其中，在冻干保护剂中，脱脂乳为10％，蔗糖5％、低聚果糖10％，分装，接下来以-80℃进行预冻4小时，最后冷冻干燥36小时即可。

实施例4

水产用乳酸菌制剂安全性评价：微生态制剂应用于水产养殖中，对水产动物的首要条件是安全、无毒害作用，为了确保应用安全，本发明从溶血性试验、小鼠毒性试验和鲫鱼毒性试验三个方面，探讨评价该制剂的安全性，为其进一步开发应用提供安全实验数据。

溶血性试验结果表明，各菌株及微生态制剂的无溶血性，表明各菌株及微生态制剂不会引起红细胞的明显凝集和溶血，安全性较好。小鼠毒性试验结果表明微生态制剂的口服半数致死剂量(7d-ld50)大于5×10¹⁰cfu。鲫鱼毒性试验结果表明微生态制剂对鲫鱼的7d-ld50大于5×10¹⁰cfu。以上试验结果表明该微生态制剂安全无毒，可以用于养殖动物及水体。

实施例5

实验组添加该水产用乳酸菌制剂，对照组为正常养殖，适应性养殖一周后，30只/组的健康银鲫鱼体腹腔注射0.1ml含有2×10⁵cfu(ld50)的嗜水气单胞菌进行感染，持续养殖14天，记录每组的死亡率如见图1所示，由表可见使用冻干乳酸菌制剂能有效降低鲫鱼嗜水气单胞菌感染。