用于分选长牡蛎颗粒细胞的AATase单克隆抗体及制备方法与流程

本发明属于分子生物学和细胞生物学技术领域，尤其涉及一种用于分选长牡蛎颗粒细胞的aatase单克隆抗体及制备方法。

背景技术：

血淋巴细胞是贝类固有免疫系统的核心和基础，不同的血淋巴细胞亚群在免疫应答中具有不同的功能。基于血淋巴细胞的物理特征，长牡蛎血淋巴细胞可分为透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞三大类，研究表明，颗粒细胞是发挥主要免疫功能的细胞亚群。但迄今为止，贝类血淋巴细胞的分离鉴定因缺乏相应的标志分子而一直存在困难。虽然密度梯度离心、流式细胞术、免疫磁珠法等分离细胞亚群的方法相继应用于贝类血淋巴细胞的分选，但效果不甚理想。迄今为止，无法进一步研究颗粒细胞生物学特性、生理学特性及免疫学功能。

技术实现要素：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种用于分选长牡蛎颗粒细胞的aatase单克隆抗体及制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种用于分选长牡蛎颗粒细胞的aatase单克隆抗体，其特征在于：所述aatase单克隆抗体是由稳定分泌aatase抗体的杂交瘤细胞株免疫小鼠，得小鼠腹水经纯化而成；所述杂交瘤细胞株按如下方法制备：以氨基酸序列如seqidno.3所示的重组蛋白免疫小鼠，取小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合后接种于hat选择培养基中，形成杂交瘤细胞株；采用间接elisa法筛选出阳性细胞株；用有限稀释法筛选出能稳定分泌aatase抗体的杂交瘤细胞株。

一种上述用于分选长牡蛎颗粒细胞的aatase单克隆抗体的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a.用引物p1和p2对长牡蛎cgaatase基因编码区片段进行pcr扩增，所述引物p1的dna序列如seqidno.2所示，所述引物p2的dna序列如seqidno.3所示；

b.将pcr扩增产物纯化回收，与pmd19-t载体连接，转化后筛选阳性克隆；提取质粒，并使用ndei和xhoi对质粒进行双酶切；回收目的片段，与pet-22b(+)载体经ndei和xhoi酶切后通过t4连接酶连接，转化得到重组子；

c.将所述重组子转入大肠杆菌表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，得到氨基酸序列如序列表seqidno.1所示的重组蛋白；

d.将重组蛋白混合弗氏佐剂充分乳化，经小鼠四次免疫及一次加强免疫后，取其脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合；

e.采用间接elisa法筛选出阳性细胞株；

f.用有限稀释法筛选出能稳定分泌aatase抗体的杂交瘤细胞株；

g.由稳定分泌aatase抗体的杂交瘤细胞株免疫小鼠，得小鼠腹水经纯化而成。

本发明通过对长牡蛎透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞单细胞转录组数据分析发现，cgaatase基因呈现出在颗粒细胞中特异性高表达的特点，从而利用血细胞亚群差异性分子aatase制备单克隆抗体。所得到的aatase单克隆抗体只针对长牡蛎颗粒细胞表面的一种抗原决定簇，具有由于多克隆抗体的特异性，可用于颗粒细胞的高纯度分离，为进一步研究颗粒细胞的免疫功能，探究颗粒细胞的发生、成熟分化机制等提供技术支持。

附图说明

图1为本发明实施例的aatase基因的克隆图。

图2为本发明实施例的aatase基因编码区体外原核重组表达和纯化图。

图3为本发明实施例的单克隆抗体与重组蛋白的westernblot图。

图4为本发明实施例的单克隆抗体与组织蛋白的westernblot图。

图5为本发明实施例的单克隆抗体亚细胞定位图。

图6为本发明实施例的单克隆抗体分离细胞图。

图7为本发明实施例的单克隆抗体流式细胞仪检测图。

具体实施方式

一.aatase基因编码区体外原核重组蛋白表达和纯化

1.重组载体的构建

本发明中采用的重组载体为novagen公司的pet-22b(+)原核表达载体。通过pcr技术，用特定引物p1和p2对长牡蛎aatase基因编码区片段进行扩增。pcr反应条件为：首先95℃预变性5min，然后进入下列循环：95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。用胶回收纯化试剂盒（大连宝生物工程有限公司）将扩增片段纯化回收，与pmd19-t载体连接，转化后筛选阳性克隆；提取质粒，并使用ndei和xhoi对质粒进行双酶切；回收目的片段，并与经ndei和xhoi酶切的表达载体pet-22b(+)通过t4连接酶连接，完成重组质粒的构建。aatase基因编码区扩增片段如图1所示有1431bp。

2.重组蛋白的表达

将构建好的重组质粒转化表达宿主菌大肠杆菌transetta(de3)中，并筛选阳性克隆，测序确认表达框的正确性。挑取单克隆，接种于500ml的lb液体培养基中，220rpm，37℃培养至od600=0.4~0.6。加入iptg（终浓度1mmoll^-1），继续培养4小时后于4℃，5000rpm，离心10min，收集菌体，于-80℃冻存备用。取1ml菌液离心，弃去上清后，加入80μltbs和20μl的5×蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10分钟，稍离心，sds-page检测表达产物。

3.重组蛋白的纯化

重组蛋白在变性条件下采用镍琼脂糖凝胶ff柱纯化，即获得aatase基因的重组蛋白。具体操作步骤如下：

（1）镍琼脂糖凝胶ff装柱（1.6×20cm），柱床体积为5ml；

（2）用缓冲液i（50mmoll^-1tris-hcl，0.5moll^-1nacl，8moll^-1尿素，ph7.4）平衡2~5个床体积，流速为2mlmin^-1；

（3）经iptg诱导表达的细胞，用缓冲液i重悬，150瓦超声破碎30min，12000rpm，4℃离心30min，上清液用0.45μm滤膜过滤后，过柱，流速为1mlmin^-1；

（4）用缓冲液i再洗2-5个床体积，流速为2mlmin^-1；

（5）用含有50mmoll^-1咪唑的缓冲液i再洗2-5个柱床体积，流速为2mlmin^-1；

（6）依次用含有100mmoll^-1、200mmoll^-1咪唑的缓冲液i洗脱杂蛋白，流速为2mlmin^-1；

（7）用400mmoll^-1咪唑的缓冲液i洗脱目的蛋白，流速为2mlmin^-1，收集；

（8）用sds-page检测获得蛋白的纯度；

（9）用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2mlmin^-1，柱子置于4℃环境中保存变性状态下提纯的重组蛋白需要在复性缓冲液中通过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠，恢复正确构象。变性纯化产物经2mm的还原谷胱甘肽、0.4mm氧化谷胱甘肽、1mmedta、50mmtris-hcl、100mmnacl、10%甘油、1%甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度从起始的6m逐渐替换到4m、3m、2m、1m、0m，最后一次透析至无尿素的透析液时不加甘油，每次在4℃透析12h。分装，存于-80℃冰箱。

sds-page结果如图2所示。结果表明，含有重组质粒的大肠杆菌在iptg诱导后可产生分子量约54.46kda的特异条带,大小与aatase基因分子量相一致，在变性条件下经纯化得到单一条带，即为重组蛋白。

二.aatase基因杂交瘤细胞的制备

利用上述原核表达获得的重组蛋白免疫3只balb/c小鼠，第一次免疫用重组蛋白与完全弗氏佐剂1:1混合，充分乳化，腹腔注射小鼠，2周后，不完全佐剂代替完全佐剂，同法进行第二次免疫小鼠，第三次和第四次每隔一周，直接用重组蛋白腹腔免疫小鼠，四次免疫后，尾部取血，elisa实验检测是否生成抗体及3只小鼠所生成抗体的效价，选取最佳反应小鼠，在细胞融合的前3天，加强免疫最佳反应小鼠，取小鼠的脾脏细胞和来源于同种系小鼠的sp2/0骨髓瘤细胞（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型和胸腺核苷激酶缺陷型）采用peg介导的融合方式进行细胞融合实验，融合的细胞用hat培养基重悬，均匀地滴到96孔板中，每孔100µl。通过hat培养基对融合细胞进行初步筛选，进而通过elisa实验对所获得杂交瘤细胞进行抗体表达验证，获得稳定分泌aatase抗体的杂交瘤细胞。

经hat培养基初筛和elisa阳性验证，得到6株阳性细胞，转移48孔板后，elisa验证，其中一株杂交瘤细胞阳性值消失，最终得到5株阳性杂交瘤细胞，即1b5、1b10、3d5、6c2、6h2（表1）。

三.有限稀释法克隆化阳性杂交瘤细胞

获得5株表达aatase抗体的阳性杂交瘤细胞，取少量杂交瘤细胞，用hat培养液稀释到10个/ml，滴加到铺有饲养层细胞的96孔培养板中，100µl/孔，37℃，5%co2培养箱中培养；显微镜观察初步筛选出单克隆细胞，进而通过elisa实验进行抗体阳性验证，获得表达aatase抗体的单株杂交瘤细胞，继续亚克隆2代，获得稳定性的单克隆杂交瘤细胞。

阳性的融合细胞株亚克一代分别得到1,9,1,15,17株单一杂交瘤细胞株，取1b5-d9、1b10-b8、3d5-f6、6c2-c5、6h2-c9进行亚克二代、亚克三代（表1）。

表1

实验例1：aatase基因单克隆抗体特异性的检测，并与多克隆抗体的比较

提取长牡蛎不同组织（血细胞、鳃、外套膜、肌肉、肝胰腺）的蛋白，并将组织蛋白和aatase重组蛋白分别与5×lodingbuffer混匀，99°c、10min；按次序上样，待蛋白胶电泳停止，取下凝胶，将蛋白转至pvdf膜，放入5%脱脂奶粉封闭液中，37°c，2h；tbst轻摇洗膜5min；一抗孵育，37°c，1h；tbst洗膜5min×3；二抗孵育，37°c，1h；tbst洗膜5min×3；将膜放入ecl显色液中，反应2min。

按上述方法，用多克隆抗体代替单克隆抗体作为一抗，并检测。

单克隆抗体westernblot的结果，与小鼠的多克隆抗体进行比较，结果分别如图3、图4所示，结果表明二者均能特异性识别重组蛋白，但单克隆抗体具有较好的特异性（图3）；小鼠多克隆抗体不能识别组织中天然蛋白，而单克隆抗体可以很好的识别天然蛋白（图4）。

实验例2：aatase蛋白在血细胞中定位分析

取健康牡蛎，用抗凝剂预装注射器，按1：1比例抽取8ml血淋巴细胞，800g，离心10min，缓慢弃掉上清，用l-15培养基重悬，均匀地滴在载玻片上，室温沉降1h，使其自然形成单层细胞；然后用4%多聚甲醛固定10min，pbst洗5min×3；滴加3%bsa封闭1h；甩去bsa，滴加一抗，37°c湿盒中孵育1h，pbst洗5min×3；滴加alexafluer488标记的二抗，37°c湿盒中孵育1h，pbst洗5min×3；50%缓冲甘油封片，置于olympus荧光显微镜下观察。

荧光显微镜观察分析结果如图5所示，aatase蛋白主要位于颗粒细胞的细胞膜上。

实验例3：免疫磁珠法分选颗粒细胞

取健康牡蛎，用抗凝剂预装注射器，按1：1比例抽取体积20ml血淋巴细胞，800g，离心10min，缓慢弃掉上清，用分离buffer(l-15培养基+2mmedta+0.5%bsa)，37℃封闭1h，650g离心5min，弃掉上清；重悬细胞与抗体稀释液中，37℃孵育1h，分离buffer洗5min×3；重悬细胞与分离buffer，并加入goat-anti-mouseiggmagneticbeads(20µlper10⁷cells)，37℃孵育1h，分离buffer洗5min×3；olympus荧光显微镜观察、流式细胞仪检测分离出的细胞和流穿液中的细胞。

olympus荧光显微镜观察分离出的如图6所示，流式细胞仪检测结果如图7所示。表明：细胞主要为颗粒细胞，流穿液中的细胞主要为透明细胞以及少量的半颗粒细胞。

序列表

<110>大连海洋大学

<120>用于分选长牡蛎颗粒细胞的aatase单克隆抗体及制备方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>476

<212>prt

<213>人工序列(crassostreagigas)

<220>

<221>variant

<222>(1)..(476)

<400>1

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151015

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202530

tyrtyrileargglyvalaspiletyralaglnmetalathrleumet

354045

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130135140

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145150155160

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180185190

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210215220

aspalaleuproalatyrglualahisphetyraspgluileglugln

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245250255

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275280285

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290295300

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325330335

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340345350

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355360365

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<213>人工序列(crassostreagigas)

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<221>exon

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<400>2

atggttgatccgggacattt20

<210>3

<211>16

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<213>人工序列(crassostreagigas)

<220>

<221>exon

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<223>引物

<400>3

tactataattctgta15