一种血红蛋白抗体的制备方法与流程

本发明涉及抗体制备领域，具体涉及一种血红蛋白抗体的制备方法。

背景技术：

结直肠癌(crc)是一种常见的恶性肿瘤，其发病率在我国恶性肿瘤中居第五位，一般由良性腺瘤发展而来，早期发现对提高结直肠癌患者的治愈率和生存期有重要帮助。结直肠癌的早期筛查方法最常用的是粪便隐血试验，与传统的粪便隐血检测方法相比，免疫化学方法直接对粪便中的血红蛋白进行检测(粪便免疫化学检测法，fit)具有很多优势。免疫法粪便隐血试验是结直肠癌筛查的新方法，使用针对血红蛋白中的珠蛋白成分的抗体，来检测粪便中的血红蛋白。fda已经建议60岁以上人群，每年检查一侧fit。fit是利用单克隆抗体或多克隆抗体直接检测人粪便中的血红蛋白，不受进食食物的影响。定性fit是在粪便中血红蛋白含量超过一定阈值后会产生可视性的颜色变化，定量fit则可测量数值，当超过一定的正常范围后被定义为阳性，因此，制备需要高效价的血红蛋白抗体。

在制备血红蛋白抗体的过程中，需要提取纯化血红蛋白，血红蛋白是一种构象不稳定的蛋白质分子，是一种结合蛋白血红素的四聚体蛋白质，在血红蛋白的提取过程中由于2,3-二磷酸甘油酸(2,3-dpg)的丢失，使血红素从珠蛋白亚基上脱离，同时血红蛋白四聚体裂解为二聚体，这给血红蛋白的制备纯化以及抗体制备制造了很大障碍。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种简单高效的血红蛋白抗体的制备方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种血红蛋白抗体的制备方法，包括以下步骤：

s1:自人全血中分离纯化血红蛋白；

s2:用脂质体包裹血红蛋白，得到脂质体包裹的血红蛋白；

s3:用脂质体包裹的血红蛋白作为抗原免疫动物制备血红蛋白抗体。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

进一步，所述步骤s1的具体步骤为：取健康人全血，4000rpm离心去除上清，沉淀用生理盐水洗涤2-4次，并用生理盐水配制成红细胞悬液，加入的生理盐水与全血的体积比为1.5～2.5:1，加入红细胞悬液10-15倍体积的10mmph为7.4的磷酸钠缓冲液，低渗溶血1h，15000rpm4℃离心35～45min，取上清，将所述上清加入100kd的超滤管中，4000rpm离心20～30min，收集收集管中的液体，即为含有血红蛋白的溶液。

进一步，所述步骤s2的具体步骤为：将氯仿和乙醚以2:3的体积比混合得到混合液，将大豆卵磷脂和胆固醇按照质量比为2:1加入混合液中得到类脂溶液，所述类脂溶液中大豆卵磷脂和胆固醇的质量分数为8～10mg/ml，将所述血红蛋白配制成浓度为6～7mg/ml的溶液，并用注射器缓慢滴加到类脂溶液中，血红蛋白溶液与所述类脂溶液的体积比为3:10，水浴超声5min，形成w/o型乳液，将乳液放置30min，若分层则重新配制，若不分层则将乳液置于旋转蒸发仪中37℃减压蒸发除去有机溶剂，达到胶合状态后，加水继续减压蒸馏直至凝胶自瓶壁上脱落，加入的水与所述类脂溶液的体积比为2～5:1，将凝胶过0.45μm微孔滤膜，得到乳白色脂质体混悬液，即为脂质体包裹的血红蛋白。

进一步，所述血红蛋白抗体为多克隆抗体，所述步骤s3包括以下步骤：

s31:用所述脂质体包被的血红蛋白免疫动物，得到动物抗人血红蛋白抗血清；

s32:将血红蛋白偶联至亲和层析柱，将所述动物抗人血红蛋白抗血清加入偶联有血红蛋白的亲和层析柱，然后用中性洗脱液进行洗脱，得到纯化的血红蛋白抗体。

可选地，所述血红蛋白抗体为单克隆抗体，所述步骤s3的具体步骤为：用所述脂质体包被的血红蛋白免疫小鼠，培养后取脾脏细胞和骨髓瘤细胞融合获得多个杂交瘤细胞，选取阳性克隆扩大培养，并注射至balb/c小鼠腹腔，7～10日后抽取腹水，纯化得血红蛋白抗体。

10.进一步，所述s32的具体步骤为：将血红蛋白用偶联缓冲液配制成浓度为1mg/ml的血红蛋白溶液，称取溴化氢活化的琼脂糖凝胶微球，装柱，用1mm的hcl于4℃活化25～35min，用偶联缓冲液平衡层析柱，加入所述血红蛋白溶液，加入的所述血红蛋白溶液与所述琼脂糖凝胶微球的体积比为5:2，室温孵育3～4h，用5倍柱体积的偶联缓冲液清洗层析柱，加入5倍柱体积的1mph为8.0的tris-hcl封闭层析柱，4℃放置8～16h，然后用偶联酸、碱洗液交替清洗层析柱3次，最后用平衡缓冲液平衡层析柱，得到亲和层析柱，将所述含有血红蛋白抗体的动物体液用平衡缓冲液稀释2～3倍，室温孵育2～3h，用5倍柱体积的平衡缓冲液洗去非特异性结合的抗体，然后加入中性洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液得到血红蛋白抗体。

进一步，所述平衡缓冲液为ph为7.4的150mm的pbs缓冲液。

进一步，所述中洗脱缓冲液的ph值为7.2，包括3mmgcl2，0.075m4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)和25vol％乙二醇。

采用上述进一步方案的有益效果是将血红蛋白用脂质体进行包裹后，免疫动物，可以防止血红蛋白被降解，制备得到的抗体效价比直接用不经脂质体包裹的血红蛋白免疫动物得到的抗体效价高，并且制备得到的多克隆抗体亲和纯化过程中，中性洗脱液能够更好的对抗原和抗体进行保护，得到更高亲和力的抗体。

本发明还提供了上述制备方法制备得到的血红蛋白抗体，抗体效价高。

附图说明

图1为本发明实施例3中elisa鉴定抗血清效价的dab显色图，其中lan1和lan2为实验组用脂质体包裹的血红蛋白免疫小鼠制备的抗血清，lan3和lan4为对照组不经脂质体包裹的血红蛋白免疫小鼠制备的抗血清；

图2为本发明实施例3中elisa鉴定纯化得到血红蛋白多克隆抗体效价的dab显色图，其中lan1、lan2和lan3分别为实验组纯化前血清、中性洗脱流穿液以及中性洗脱得到的抗体，lan4、lan5和lan6分别为对照组纯化前血清、酸性洗脱流穿液以及酸性洗脱得到的抗体；

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明提供一种血红蛋白抗体的制备方法，将用脂质体包裹的血红蛋白免疫动物制备得到，具体实施例如下。

实施例1血红蛋白的分离纯化

取健康人全血20ml，4000rpm离心，去除上层的血浆和白细胞层，沉淀用生理盐水清洗三次，加入生理盐水40ml配制成红细胞悬液，加入600mlph为7.4的磷酸钠缓冲液，低渗溶血1h，用高速离心机4℃，15000rpm离心40min，取上清，将上清加入到100kd的超滤离心管中，4000rpm离心30min，收集收集管中的液体，即为含有血红蛋白的溶液。

实施例2制备脂质体包裹的血红蛋白

取4ml氯仿和6ml乙醚混合得到混合液，称取60mg大豆卵磷脂和30mg胆固醇得到类脂溶液，将血红蛋白用超纯水配制成浓度为6.67mg/ml的溶液,取3ml稀释后的血红蛋白溶液并用注射器缓慢滴加到类脂溶液中，水浴超声5min，形成w/o型乳液，将乳液静置半小时，若分层则重新配制，若不分层则将乳液置于旋转蒸发仪中37℃减压蒸发除去有机溶剂，达到胶合状态后，加入30ml超纯水，继续减压蒸馏除直至凝胶自瓶壁上脱落，将凝胶过0.45μm微孔滤膜，得到乳白色脂质体混悬液，即为脂质体包裹的血红蛋白。

实施例3血红蛋白多克隆抗体的制备

实验组取2-3月月龄的试验用兔，将上述脂质体包裹的血红蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分混合后，按照每只实验兔400ug抗原皮下多点注射，15天后测定血清效价，选择免疫反应好的实验兔再加强免疫，取脂质体包裹的血红蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂充分混合后，按照每只实验兔125μg抗原皮下多点注射，加强免疫的次数为3次，每次间隔15天，颈动脉取血，获得兔抗人血红蛋白抗血清。

对照组直接用到的血红蛋白为不经脂质体包裹的血红蛋白，其他步骤同实验组。

间接elisa鉴定抗血清效价：用新鲜制备的血红蛋白包被96微孔板，按照每孔100ng的量4℃包被过夜，用pbst(pbs+0.2％teween20)洗版3次，血清用pbst+5％的脱脂牛奶稀释，稀释比从1:10000开始，1/2倍比稀释，每孔加样100μl，37℃孵育1h，用pbst洗版三次后dab显色，结果如图1所示，其中lan1和lan2为实验组用脂质体包裹的血红蛋白免疫小鼠制备的抗血清，血清效价均达到1:64万，lan3和lan4为对照组不经脂质体包裹的血红蛋白免疫小鼠制备的抗血清，血清效价低于1:32万，血红蛋白经脂质体包裹后免疫动物可以提高制备的抗血清的效价。

采用亲和层析纯化上述制备的血红蛋白多克隆抗体，用到的缓冲液分别为：

偶联缓冲液：0.1mnahco3,0.5mnacl,ph8.3；

平衡缓冲液：150mmnacl，10mmna2hpo4，1.8mmnah2po4，ph7.4；

中性洗脱缓冲液：3mmmgcl2，0.075mmhepes，25vol％乙二醇，ph7.2；

偶联酸洗液：0.1mhcl,0.5mnacl，ph4.0；

偶联碱洗液：0.1mtris-hcl,0.5mnacl，ph8.0

取5mg血红蛋白加入5ml偶联缓冲液中制备成血红蛋白溶液，称取2ml溴化氢活化的琼脂糖凝胶微球，装入层析柱，用1mm的hcl于4℃活化30min，用偶联缓冲液平衡，加入血红蛋白溶液，室温孵育4h，用5倍柱体积的偶联缓冲液清洗柱子，加入10ml1m的tris-hcl封闭柱子，4℃过夜，然后用偶联酸碱洗液交替清洗柱子3次，最后用平衡缓冲液平衡柱子，得到亲和纯化柱。将上述得到的抗血清用平衡缓冲液稀释3倍，过0.45μm滤器，并加入到亲和层析柱中，室温孵育3h，用5倍柱体积的平衡缓冲液冲洗柱子，洗去非特异性结合的抗体，然后逐滴加入洗脱缓冲液，分管收集洗脱液。取出预处理好的透析袋，用pbs冲洗干净，一端用透析夹夹紧，加入收集的含有血红蛋白卡抗体的洗脱液，另一端也用透析夹夹紧，放入1lpbs中，4℃缓慢搅拌，每3-4小时换一次pbs，透析3遍后用聚乙二醇2000浓缩，得到纯化的血红蛋白多克隆抗体。

对照组的洗脱时采用酸性洗脱缓冲液，酸性洗脱缓冲液的配方为150mmnacl/hcl,ph为2.0-2.5，洗脱得到的含有血红蛋白抗体的洗脱液先用磷酸中和至ph为7.4，其他步骤与上述步骤一致。

通过sds-page电泳测定抗体的浓度，采用中性洗脱得到的血红蛋白抗体为0.9mg/ml抗血清，对照组中采用酸性洗脱缓冲液洗脱得到的血红蛋白抗体为1.0mg/ml抗血清，得率相比对照组低；间接elisa鉴定纯化得到的血红蛋白多克隆抗体的效价，dab显色结果如图2所示，其中lan1、lan2和lan3分别为实验组纯化前血清、中性洗脱流穿液以及中性洗脱得到的抗体效价，lan4、lan5和lan6分别为对照组纯化前血清、酸性洗脱流穿液以及酸性洗脱得到的抗体效价，中性洗脱得到的抗体效价可以达到1:32万，而酸性洗脱得到的抗体效价只有1:8万，可见中性洗脱对于血红蛋白抗体的活力保护更好，得到的更具有亲和力的抗体，在临床检测中具有更高的灵敏度和更宽的检测范围。

实施例3血红蛋白单克隆抗体的制备

取8周龄的balb/c小鼠3只用作抗原注射，足量的脂质体包裹的血红蛋白与弗氏佐剂混匀，第一次使用弗氏完全佐剂，以后加强注射使用弗氏不完全佐剂，均与等体积抗原充分混匀后背部多点注射，主注射100μg抗原/只小鼠，加强注射50μg抗原/只小鼠，主注射后，每隔15天加强免疫1次，共加强免疫3次后，尾静脉取血，检测抗血清效价，取效价最高的小鼠进行融合。

融合前一周，复苏sp2/0细胞，正常培养至对数期。选定要融合的小鼠，融合当天用颈椎脱臼法处死，取脾，标准流程收集脾细胞并计数。按1:3-1：10的比例混合骨髓瘤细胞和脾细胞，标准流程进行细胞融合操作，随后用hatdmem完全培养基培养，融合后3天即可以看到杂交瘤细胞，第7天换1/2hat完全培养基，第8天换1/2ht培养基。融合后10天左右开始进行筛选检测。融合后用hat选择性培养基培养，显微镜下观察，看到多个生长的杂交瘤细胞，证明融合操作成功。

吸取细胞上清100ul/孔进行间接elisa检测。根据elisa结果，判断阳性孔。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次复检，进一步确认阳性孔。

对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆。(因为第一次亚克隆得到的阳性孔细胞株尚不稳定，有可能包含多个杂交瘤细胞，普遍认为第二次亚克隆后杂交瘤细胞为单个细胞株，并确定为阳性)。第一次亚克隆有限稀释阳性孔中细胞，至多个孔中，加htdmem培养基培养，7天左右在显微镜下观察，间接elisa检测有克隆生长的孔，取od值高的孔为阳性孔；挑取阳性孔的细胞进行第二次亚克隆，检测出稳定阳性的杂交瘤细胞株，作为最终制备单抗的细胞，并扩大培养。

将上述阳性细胞扩大培养并注射至balb/c小鼠(经弗氏不完全佐剂至敏)的腹腔，一般7-10日可见小鼠腹部隆起即代表有腹水产生。当小鼠有明显腹水产生时及时抽取腹水。将上述细胞的腹水，进行纯化，纯化后抗体纯度大于90％。纯化方法如下：

辛酸硫酸铵+deae离子柱法纯化(igg1,igg2a,igg2b,igg3亚型抗体):

腹水离心，吸出淡黄色液体计算体积，用4倍体积的60mm醋酸缓冲液(ph4.0)1:3稀释，逐滴加入辛酸(终浓度为25μl/ml稀释腹水)，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。10000r/min，4℃，20min，收集上清，加入1/10体积的10*pbs(0.1mph7.4)。根据每ml上述混合液加0.277g固体硫酸铵(0℃条件下，45％饱和硫酸铵为0.291g/ml)，继续静置至少60min以上。10000r/min，4℃，20min，弃上清，将沉淀溶解于少量pbs中。对pbs透析，4℃透析过夜。

检测浓度纯度后，调整浓度至2mg/ml，间接elisa验证单克隆抗体效价。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。